Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do

O objetivo geral deste estudo é estabelecer um sistema de cultura infecciosa in vitro baseado em células de mamíferos para o vírus Zika, com o fim de investigar a replicação do vírus Zika, bem como utilizar a plataforma in vitro para o desenvolvimento de fármacos. Este protocolo detalhado, passo a passo, do sistema de cultura celular infecciosa pelo vírus Zika pode ajudar a elucidar os mecanismos de patogênese mediada pelo vírus Zika e a evolução da virulência viral. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a produção em larga escala do vírus Zika para o desenvolvimento de medicamentos e vacinas.

Inicie a coleta de células Vero com densidade celular de 80% em um frasco de cultura T75 aspirando o meio do frasco e lavando as células com dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Adicione dois mililitros de tripsina a 0,25% e incube o frasco a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, adicione oito mililitros de meio de crescimento contendo soro para inativar a tripsina. Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Depois, remova 10 microlitros de células e misture com volume igual de azul de tripano a 0,4%. Carregue a mistura preparada na lâmina de câmara de contagem celular e obtenha a contagem das células viáveis utilizando um contador automático de células. Semee um total de sete milhões de células em um frasco T160 em um volume de 30 mililitros. No dia seguinte, prepare uma multiplicidade de infecção apropriada do inóculo do vírus Zika em 10 mililitros de meio de cultura sem soro por frasco.

O manuseio seguro do vírus é essencial para prevenir a disseminação da infecção.

Remova o meio usado do frasco T160 e, em seguida, adicione os 10 mililitros completos do inóculo viral recém-preparado. Incube os frascos inoculados a 37 graus Celsius com 5%CO₂ por quatro a seis horas. Distribua o inóculo inclinando suavemente o frasco lateralmente a cada hora de incubação. Ao final da incubação, substitua o inóculo por 30 mililitros de meio de crescimento suplementado com soro, previamente aquecido. Em seguida, continue o cultivo viral pelos próximos 96 horas. Após quatro dias, verifique o progresso da infecção observando o aparecimento de placas virais na monocamada celular, utilizando um microscópio de contraste de fase. Capture imagens conforme necessário nas ampliações de 40x e 200x.

Colete os sobrenadantes do cultivo celular no ponto temporal de 96 horas e centrifugue o sobrenadante a 300 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos celulares. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os sobrenadantes sem perturbar o precipitado de detritos e transfira-os para tubos de 15 mililitros.

Armazene os sobrenadantes do cultivo viral em múltiplas alíquotas a menos 80 graus Celsius.

Para titular o vírus, primeiro semeie células Vero ingênuas em uma placa de 12 poços a uma concentração de um vezes 10 à quinta células por poço, em um volume de dois mililitros. No dia seguinte, prepare diluições seriadas de dez vezes dos sobrenadantes de cultura viral, coletados do frasco T160 usando meio sem soro.

Ao preparar diluições seriadas do sobrenadante de cultura viral para ácidos tituladores, certifique-se de manipular o vírus com segurança para prevenir infecção.

Em seguida, remova o meio usado de cada poço da placa de 12 poços contendo células Vero e adicione 400 microlitros do inóculo diluído sobre as células Vero em triplicata. Incube as placas inoculadas no incubador de cultura de tecidos por quatro a seis horas.

No final da incubação, substitua o inóculo por dois mililitros de meio suplementado com soro por poço. Após 48 horas da inoculação, conte as focos virais nas diluições apropriadas, utilizando um microscópio de contraste de fase. Calcule o título viral como unidades formadoras de placa por mililitro.

Após inoculação de células Vero em uma placa de 12 poços com títulos alto e baixo do vírus Zika, e incubação por 48 e 96 horas, a replicação do genoma é avaliada por PCR quantitativa para expressão do genoma do vírus Zika e por imunocitoquímica para RNA de fita dupla.

Para imunocitoquímica, remova o meio dos poços da placa de 12 poços e adicione um mililitro de metanol a cada poço. Deixe as células fixarem a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, lave as células fixadas três vezes com PBS 1x. Então, adicione o tampão bloqueador e incube por uma hora à temperatura ambiente. Dilua o anticorpo monoclonal de camundongo anti-RNA de fita dupla J2 na proporção de 1 para 100 no tampão bloqueador, adicione-o às células e incube as células nesta solução durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, dilua o anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo conjugado com 594 na proporção de 1 para 1.000 no tampão bloqueador e, após lavar as células com PBS 1x, adicione-o às células e incube-as por uma hora à temperatura ambiente. Após lavar as células com PBS 1x, realize a coloração para os núcleos utilizando o corante Hoechst e observe as células usando um microscópio de fluorescência com aumento de 100x.

Seis horas após o plaqueamento de uma placa de 12 poços com células Vero ingênuas, como antes, adicione citocinas de interesse nas concentrações indicadas em duplicatas biológicas. Doze horas após o tratamento, realize a infecção pelo vírus Zika e inclua poços controle negativo sem infecção. Quatro horas após a infecção, substitua o inóculo viral por meio tratado com citocinas e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por mais 44 horas. A 48 horas pós-infecção, conte as placas virais utilizando um microscópio de contraste de fase e obtenha imagens representativas de células infectadas com aumento de 40x.

Este gráfico mostra o conteúdo genômico do vírus Zika medido por RT-qPCR. Os iniciadores dos genótipos Pan e da cepa PRVABC-59 apresentaram sensibilidade e especificidade iguais. Como esperado, os iniciadores virais do vírus da hepatite C não amplificaram nenhum produto.

Cinética de crescimento viral do Zika nos pontos de tempo indicados em células infectadas com título baixo e alto, comparada à do controle mock não infectado, é mostrada aqui. Os resultados do ensaio de imunocitoquímica mostram que, 48 horas após a infecção, as células infectadas estão em poucos aglomerados, enquanto que, 96 horas após a infecção, a maioria das células está infectada. Este gráfico mostra a modulação do crescimento viral do Zika por várias citocinas, comparada à do controle com veículo.

Essas imagens de contraste de fase mostram células infectadas pelo vírus Zika com ou sem tratamento com citocina. As placas virais formadas por células infectadas podem ser observadas como focos. Observe que os poços tratados com interferon não apresentam placas virais.

Após este procedimento, outros métodos, como o mapeamento de alta resolução de domínios do vírus Zika para localização de proteínas virais e replicação em células de mosquitos e humanas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a elucidação do mecanismo de patogênese da doença e a evolução da virulência viral. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estabelecer um sistema de cultura infecciosa in vitro baseado em células de mamíferos para o estudo da replicação do vírus Zika, bem como da utilização da plataforma in vitro para o desenvolvimento de fármacos e vacinas.