Cápsulas à base de plantas de extração de para aplicações de microencapsulação

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um processo simplificado para extrair cápsulas de esporopolenina exina, ou SECs, para aplicações de microencapsulação. Este método pode fornecer rapidamente microcaptura limpa para aplicações de alimentos e saúde. A principal vantagem dessa técnica é que o tempo do processo de extração de SEC pode ser significativamente reduzido para produzir SECs limpos e intactos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o processo de extração simplificado da SEC e uma extensa caracterização passo a passo, ele também pode ser usado para explorar avaliações microestruturais e morfológicas fundamentais de diferentes biomateriais à base de plantas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades por causa do processo convencional de extração de 8 a 10 dias, envolvendo ácidos altamente corrosivos em temperaturas elevadas. Para iniciar este procedimento, prepare uma configuração de refluxo em uma capela com um condensador de vidro, um sistema de circulação de água e um banho-maria.

Como o processo de extração SEC envolve o uso de ácidos altamente corrosivos e solventes orgânicos, o processo deve ser realizado com equipamentos de proteção individual adequados, como óculos de proteção, jaleco, máscara facial e luvas com notificação de perigo. Pese cuidadosamente 100 gramas de esporos de L clavatum sem criar poeira e longe de qualquer fonte de ignição. Em seguida, transfira lentamente os esporos para um balão de fundo redondo de PTFE de um litro com uma haste de agitação magnética.

Adicione 500 mililitros de acetona aos esporos e agite suavemente o frasco para formar uma suspensão homogênea. Agora coloque o frasco em banho-maria regulado a 50 graus Celsius e conectado ao condensador de refluxo. Aqueça a suspensão até o refluxo por seis horas agitando a 200 RPM.

Depois de deixar a suspensão esfriar à temperatura ambiente, filtre-a com papel de filtro sob vácuo e colete os esporos desengordurados em grandes placas de Petri de vidro. Seque os esporos à temperatura ambiente, cobrindo as placas de Petri com papel alumínio com orifícios para evaporação do solvente. Depois de transferir os esporos secos e desengordurados para o frasco de PTFE de um litro, adicione 500 mililitros de solução de ácido fosfórico a 85%.

Colocar o balão num banho-maria regulado para 70 graus Celsius e ligá-lo ao condensador de refluxo. Aqueça a suspensão até o refluxo por 30 horas com agitação. Assim que a suspensão esfriar à temperatura ambiente, dilua-a com 500 mililitros de água deionizada quente e colete os SECs por filtração a vácuo usando papel de filtro.

Em seguida, transfira os SECs para um copo de vidro de três litros para realizar uma série de lavagens. Na hotte, adicionar 800 milímetros de água quente deionizada aos SECs e agitar suavemente durante 10 minutos. Em seguida, filtre a suspensão usando papel de filtro sob vácuo.

Transfira os SECs para um copo de vidro limpo de três litros. Depois de repetir as etapas anteriores cinco vezes, adicione 600 mililitros de acetona quente aos SECs e mexa delicadamente por 10 minutos. Colete os SECs por filtração sob vácuo e transfira-os para um copo de vidro limpo de três litros.

Depois de repetir os passos anteriores com os solventes apropriados, transferir os SECs limpos para seis grandes placas de Petri de vidro e secar num exaustor à temperatura ambiente durante 24 horas para remover toda a água. Em seguida, seque os SECs em um forno a vácuo a 60 graus Celsius e um milibar de vácuo por 10 horas ou até peso constante. Em seguida, transfira os SECs secos para uma garrafa de polipropileno para armazenamento em um armário seco.

Prepare 1,2 mililitros de uma solução de albumina de soro bovino, ou BSA, em água deionizada e transfira para um tubo de polipropileno de 50 mililitros. Adicione 150 miligramas de SECs à solução BSA. Vortex a mistura por 10 minutos para formar uma solução homogênea.

Depois de cobrir o tubo com papel de filtro, transferi-lo para um balão de liofilizador e secar durante quatro horas com vácuo a um milibar. Assim que os SECs carregados com BSA estiverem secos, remova os aglomerados com um almofariz e pilão. Agora transfira os SECs carregados com BSA para um tubo de 50 mililitros e adicione dois mililitros de água deionizada para remover o BSA residual.

Colete os SECs por centrifugação a 4.704 por cinco minutos. Quando terminar, descarte o sobrenadante. Repita a lavagem com água deionizada.

Em seguida, cubra o tubo que contém os SECs carregados com BSA com papel de filtro. Em seguida, transfira os SECs para um freezer por uma hora. Liofilize os SECs por 24 horas.

Armazene os SECs no freezer até nova caracterização. Use cinco miligramas de SECs carregados com BSA em um tubo de polipropileno de dois mililitros. Adicione 1,4 mililitros de PBS e vórtice por cinco minutos.

Em seguida, sonicar a suspensão a 40% de amplitude por três ciclos de dez segundos. Quando terminar, filtre a solução usando um filtro de polietersulfona de 0,45 mícron. Depois de realizar as etapas anteriores com os SECs placebo, meça os absorventes dos SECs carregados com BSA a 280 nanômetros usando placebo como um branco.

Finalmente, quantifique a quantidade de BSA encapsulada usando uma curva padrão BSA em PBS. As imagens de MEV indicam esporos intactos com uma microestrutura única e, antes do processamento, organelas esporoplasmáticas em escala de mícron foram observadas na imagem transversal. Com o desengorduramento de esporos e o tratamento alcalino, não foram observadas alterações morfológicas e estruturais.

As imagens de MEV após a acidólise mostram SECs intactos desprovidos de materiais esporoclásmicos. Nenhuma remoção substancial de material proteico é observada em SECs desengordurados e tratados com álcalis pela análise de CHN. A maioria dos materiais proteicos é removida com acidólise.

A análise DIPA mostra a distribuição uniforme do tamanho dos SECs após a acidólise por até 30 horas. A integridade estrutural do SEC diminui com a acidólise prolongada. Os dados de MEV e DIPA mostram que, após a etapa de desengorduramento, a acidólise produziu SECs intactos com uma distribuição de tamanho uniforme.

Os dados do CLSM indicam que os SECs não tratados exibem autofluorescência devido aos constituintes do esporoplasma dentro da cavidade do esporos. Após a acidólise, apenas o processamento, todo o conteúdo esporoclásmico é removido. Após o encapsulamento do FITC-BSA, a florescência verde é observada dentro dos SECs.

As imagens de MEV mostram micro-sulcos intactos após o carregamento do BSA. Nenhuma mudança substancial foi observada no diâmetro, circularidade e proporção após o carregamento de BSA em SECs. A quantificação de BSA de SECs encapsulados confirma a consistência do processo de microencapsulação com 0,170 mais ou menos 0,01 gramas de carregamento de BSA por grama de SECs.

Uma vez dominado, este processo simplificado de extração de SEC pode ser feito em 48 horas se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento para vários esporos de plantas e pólen, é importante lembrar a avaliação passo a passo da análise morfológica estrutural e elementar para obter cápsulas intactas e limpas. Seguindo esse procedimento, outros processos de extração envolvendo enzimas alcalinas podem ser realizados a fim de verificar a viabilidade do processo otimizado para diversas cápsulas à base de plantas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de microencapsulação, administração de medicamentos e engenharia de tecidos explorarem diversos SECs à base de plantas como biomateriais de próxima geração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair e caracterizar SECs de esporos de plantas e grãos de pólen, bem como realizar o encapsulamento de medicamentos e biomacromoléculas em SECs.