Cápsulas à base de plantas de extração de para aplicações de microencapsulação

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um processo simplificado para extrair Cápsulas de Esporopolenina, ou SECs, para aplicações de microencapsulação. Este método pode fornecer rapidamente microcaptura limpa para aplicações alimentares e na área da saúde. A principal vantagem desta técnica é que o tempo do processo de extração de SECs pode ser significativamente reduzido, produzindo SECs limpas e intactas.

Embora este método possa fornecer informações sobre o processo de extração simplificado da SEC e sobre a caracterização extensiva passo a passo, ele também pode ser usado para explorar avaliações fundamentais da microestrutura e da morfologia de diferentes biomateriais de origem vegetal. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido ao processo convencional de extração de 8 a 10 dias, que envolve ácidos altamente corrosivos em temperaturas elevadas. Para iniciar este procedimento, prepare um sistema de refluxo em uma capela com um condensador de vidro, um sistema de circulação de água e um banho-maria.

Como o processo de extração por SEC envolve o uso de ácidos altamente corrosivos e solvente orgânico, ele deve ser realizado com equipamentos de proteção individual adequados, como óculos de proteção, jaleco laboratorial, máscara facial e luvas, além de notificação de risco. Pese cuidadosamente 100 gramas de esporos de L. clavatum sem gerar poeira e longe de qualquer fonte de ignição. Em seguida, transfira lentamente os esporos para um balão de fundo redondo de um litro em PTFE com uma barra de agitação magnética.

Adicione 500 mililitros de acetona aos esporos e agite suavemente o frasco para formar uma suspensão homogênea. Em seguida, coloque o frasco em um banho-maria ajustado a 50 graus Celsius e conectado ao condensador de refluxo. Aqueça a suspensão em refluxo por seis horas com agitação a 200 RPM.

Após deixar a suspensão esfriar à temperatura ambiente, filtre-a usando papel de filtro sob vácuo e colete os esporos desengordurados em grandes placas de Petri de vidro. Seque os esporos à temperatura ambiente, cobrindo as placas de Petri com papel de alumínio furado para permitir a evaporação do solvente. Após transferir os esporos secos e desengordurados para um frasco de politetrafluoroetileno (PTFE) de um litro, adicione 500 mililitros de solução de ácido fosfórico a 85%.

Coloque o frasco em um banho-maria ajustado a 70 graus Celsius e conecte-o ao condensador de refluxo. Aqueça a suspensão à refluxão por 30 horas com agitação. Após a suspensão ter esfriado até a temperatura ambiente, dilua-a com 500 mililitros de água desionizada morna e colete os SECs por filtração a vácuo utilizando papel de filtro.

Em seguida, transfira as SECs para um béquer de vidro de três litros para realizar uma série de lavagens. Na capela, adicione 800 milímetros de água desionizada quente às SECs e agite suavemente por 10 minutos. Em seguida, filtre a suspensão utilizando papel de filtro sob vácuo.

Transfira as SECs para um béquer de vidro limpo de três litros. Após repetir os passos anteriores cinco vezes, adicione 600 mililitros de acetona quente às SECs e agite suavemente por 10 minutos. Colete as SECs por filtração a vácuo e transfira-as para um béquer de vidro limpo de três litros.

Após repetir as etapas anteriores com os solventes apropriados, transfira os SECs limpos para seis placas de Petri de vidro grandes e seque em capela a temperatura ambiente por 24 horas para remover toda a água. Em seguida, seque os SECs em estufa a vácuo a 60 graus Celsius e um milibar de vácuo por 10 horas, ou até atingir peso constante. Depois, transfira os SECs secos para um frasco de polipropileno para armazenamento em um armário seco.

Prepare 1,2 mililitros de uma solução de Albúmina Sérica Bovina, ou BSA, em água desionizada e transfira para um tubo de polipropileno de 50 mililitros. Adicione 150 miligramas de SECs à solução de BSA. Agite a mistura em vórtex por 10 minutos para formar uma solução homogênea.

Após cobrir o tubo com papel filtro, transfira-o para um frasco de liofilizador e seque por quatro horas sob vácuo a um milibar. Assim que os SECs carregados com BSA estiverem secos, remova os aglomerados com um pilão e almofariz. Em seguida, transfira os SECs carregados com BSA para um tubo de 50 mililitros e adicione dois mililitros de água desionizada para remover a BSA residual.

Coletar as SECs por centrifugação a 4.704 ×g por cinco minutos. Após a conclusão, descartar o sobrenadante. Repetir a lavagem com água desionizada.

Em seguida, cubra o tubo contendo os SECs carregados com BSA com papel-filtro. Depois, transfira os SECs para um congelador por uma hora. Liofilize os SECs por 24 horas.

Armazene os SECs no congelador até a caracterização posterior. Utilize cinco miligramas dos SECs carregados com BSA em um tubo de polipropileno de dois mililitros. Adicione 1,4 mililitro de PBS e vortexie por cinco minutos.

Em seguida, sonique a suspensão com sonda em 40% de amplitude por três ciclos de dez segundos. Ao finalizar, filtre a solução utilizando um filtro de politetrafluoroetileno com porosidade de 0,45 mícron. Após realizar os passos anteriores com os SECs placebo, meça a absorbância dos SECs carregados com BSA em 280 nanômetros, utilizando o placebo como branco.

Por fim, quantifique a quantidade de BSA encapsulada utilizando uma curva padrão de BSA em PBS. As imagens de MEV indicam esporos intactos com uma microestrutura única e, antes do processamento, organelas esporoplásmicas em escala micrométrica foram observadas na imagem em corte transversal. Com a desengorduramento dos esporos e tratamento alcalino, nenhuma alteração morfológica ou estrutural foi observada.

As imagens de MEV após acidólise mostram SECs intactos, desprovidos de materiais esporoplásmicos. Nenhuma remoção substancial de materiais proteicos é observada em SECs desengordurados e tratados com álcali pela análise CHN. A maioria dos materiais proteicos é removida com a acidólise.

A análise por DIPA mostra a distribuição uniforme de tamanho das SECs após acidólise por até 30 horas. A integridade estrutural das SECs diminui com a prolongação da acidólise. Os dados de MEV e DIPA mostram que, após a etapa de desengorduramento, a acidólise produziu SECs intactas com distribuição de tamanho uniforme.

Dados de microscopia confocal indicam que SECs não tratadas exibem autofluorescência devido aos constituintes do esporoplasma dentro da cavidade do esporo. Após o processamento apenas com acidólise, todos os conteúdos esporoplasmáticos são removidos. Após a encapsulação de FITC-BSA, observa-se fluorescência verde no interior das SECs.

As imagens de MEV mostram microcristas intactas após a carga com BSA. Nenhuma alteração substancial foi observada no diâmetro, circularidade e razão de aspecto após a carga de BSA nas SECs. A quantificação de BSA a partir das SECs encapsuladas confirma a consistência do processo de microencapsulação, com 0,170 ± 0,01 gramas de carga de BSA por grama de SECs.

Uma vez dominado, esse processo simplificado de extração por SEC pode ser realizado em 48 horas, se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento com esporos e pólens de diversas plantas, é importante lembrar da avaliação passo a passo da morfologia estrutural e da análise elementar para obter cápsulas intactas e limpas. Após este procedimento, outros processos de extração que envolvem enzimas alcalinas podem ser realizados para verificar a viabilidade do processo otimizado para cápsulas derivadas de diversas plantas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de microencapsulação, entrega de fármacos e engenharia de tecidos explorarem diversos SECs de origem vegetal como biomateriais de próxima geração. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair e caracterizar SECs de esporos e grãos de pólen vegetais, bem como realizar a encapsulação de fármacos e biomacromoléculas em SECs.