Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

O objetivo geral deste protocolo é usar microscopia para analisar a formação de biofilmes bacterianos em hifas filamentosas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como como o biofilme bacteriano é formado nas hifas, quão específicas elas são e do que são feitas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a investigação da formação de biofilme bacteriano em hifas fúngicas em múltiplas escalas, desde as faixas nanométricas até centímetros.

A demonstração do procedimento será feita por Cora Miquel Guennoc do meu laboratório, e Christophe Rose, engenheiro de microscopia eletrônica da Plataforma INRA PTEF. Para começar, prepare membranas de celofane com o mesmo diâmetro das placas de Petri e coloque-as em EDTA fervente por 30 minutos. Em seguida, use água deionizada para enxaguar as folhas e autoclave-as duas vezes.

Para preparar pré-culturas fúngicas, inocular o fungo em meio de ágar, coberto com uma membrana de celofane pré-tratada com EDTA. Incubar as culturas na temperatura ideal para obter colônias de aproximadamente um centímetro de diâmetro. A partir da pré-cultura, inocular uma placa de Petri de meio de ágar apropriado, coberta com a membrana de celofane EDTA, usando um bisturi para arranhar suavemente a área externa de uma colônia de pré-cultura e, em seguida, transferindo as hifas para a placa de ágar.

Incube as placas na temperatura ideal até que as colônias tenham aproximadamente um centímetro de diâmetro. Para preparar culturas bacterianas como P. fluorescens BBc6, use uma alça estéril para coletar duas a três colônias bacterianas individuais do meio de ágar e inocular 25 mililitros de LB. Incube a cultura na temperatura ideal durante a noite. Depois de cultivar a bactéria durante a noite, centrifugue a cultura a 5.000 vezes g por três minutos.

Em seguida, suspenda o pellet em 25 mililitros de tampão fosfato de potássio estéril de 0,1 molar. Depois de repetir a centrifugação, use o mesmo tampão para ajustar a concentração bacteriana final para 10 elevado à nona célula por mililitro. Encha uma microplaca de seis poços com cinco mililitros da suspensão bacteriana.

Use uma lâmina de barbear estéril para cortar a membrana de celofane da cultura fúngica em quadrados, com uma única colônia em cada membrana. Em seguida, com uma pinça, remova cuidadosamente os quadrados de celofane contendo hifas do meio sólido e transfira-os para poços individuais da suspensão bacteriana. Agite suavemente a microplaca até que as colônias de fungos se desprendam do celofane.

Em seguida, remova as folhas de celofane, deixando as colônias de fungos no prato. Incubar a microplaca com agitação suave a 20 graus Celsius por um tempo, dependendo das cepas utilizadas e do estágio a ser analisado. Para P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor, incubar as culturas por 30 minutos para obter biofilmes em estágio inicial e por até 16 horas para biofilmes maduros.

Para remover bactérias planctônicas e bactérias eletrostaticamente ligadas às hifas, enxágue o fungo transferindo-o para uma nova microplaca de seis poços cheia de solução salina forte. Agite suavemente o prato por um minuto. Transfira o fungo para uma nova microplaca de seis poços contendo cinco mililitros de tampão fosfato de potássio 0,1 molar estéril.

Agite suavemente o prato por dois minutos e, em seguida, transfira o fungo para um tampão fresco. Enquanto mantém a colônia de fungos em tampão, use um bisturi para cortar a colônia aproximadamente ao meio. Transfira metade da colônia a ser corada para uma placa de Petri contendo um mililitro de água estéril, suplementada com um corante fluorescente apropriado para visualizar a rede fúngica, como aglutinina de gérmen de trigo conjugada a Alexa Fluor 633.

Em seguida, incube a amostra no escuro. Após a coloração, enxágue a amostra transferindo-a para uma tampa de placa de Petri contendo 10 mililitros de tampão fosfato de potássio estéril 0,1 molar e agite suavemente por um minuto. Mergulhe uma lâmina na tampa da placa de Petri e posicione delicadamente a seção cortada para flutuar acima da lâmina.

Em seguida, levante lentamente a lâmina da solução tampão, permitindo que a amostra se deposite suavemente na lâmina. O aspecto mais delicado é o posicionamento da amostra na lâmina. Para evitar a descrição do biofilme, a amostra e a lâmina devem ser imersas durante o posicionamento da amostra, e a amostra não deve ser movida mais antes da imagem.

Por fim, adicione 10 microlitros de meio de montagem anti-desbotamento à amostra e cubra-a com uma lamínula de vidro. Examine as lâminas sob um microscópio confocal a laser com uma objetiva de 10x ou 40x. Use uma combinação de varredura de blocos e as funções Z-stack para obter visualizações 3D globais da colônia de fungos e dos biofilmes.

Para realizar a microscopia eletrônica, após enxaguar o fungo em solução salina forte como antes, transfira o fungo para água estéril em vez de tampão para evitar a formação de cristais de sal durante a etapa de desidratação. Transfira os biofilmes para um porta-amostras e remova o excesso de água. Em seguida, transfira as amostras para a câmara de um microscópio eletrônico de varredura de pressão variável.

Em um estágio de resfriamento Peltier, congele a amostra a 50 graus Celsius negativos, permitindo que ela seque lentamente diretamente na câmara SEM, com 100 Pascals de pressão variável definida por 15 horas. Recupere a amostra e transfira-a para um sistema de deposição de filme de alto vácuo. Em seguida, cubra a amostra com dois nanômetros de platina sob plasma de argônio.

Observe a amostra revestida com um microscópio eletrônico de varredura, com uma pistola de emissão de campo usando o detector de alta resolução na lente e uma alta tensão eletrônica de um quilovolt. Esta análise em mesoescala de biofilmes demonstra a distribuição heterogênea do biofilme de P. fluorescens BBc6 em verde nas hifas de L. bicolor S238N, mostradas em vermelho. A análise também possibilitou o rastreamento da formação de biofilme ao longo do tempo, desde as etapas iniciais em que apenas algumas bactérias marcadas com GFP estavam ligadas às hifas, mostradas em vermelho, até a formação de um biofilme espesso e maduro.

Como mostrado aqui, as imagens de mesoescala de alta resolução também foram usadas para realizar análises em microescala, para obter arquiteturas de colônias. Além disso, nesta projeção de intensidade máxima 2D de alta resolução de uma imagem confocal 3D, a marcação específica com SYPRO Ruby, mostrada em vermelho, indica a presença de proteínas na matriz, com bactérias BBc6 marcadas com GFP e fungo marcado com FUN-1 em verde escuro. Após a desidratação e codificação da mesma amostra, mais detalhes da estrutura do biofilme foram obtidos por imagem de MEV.

As pontas das setas verdes apontam para células bacterianas no biofilme e as pontas das setas amarelas apontam para hifas fúngicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de duas horas e meia para uma amostra, sem contar o tempo de incubação para a formação do biofilme e a cultura de microrganismos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso do método depende muito da capacidade de obter colônias de fungos muito finas, feitas de apenas algumas camadas de hifas.

Após esse procedimento, outros métodos, como mutagênese ou hibridização in situ, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como a caracterização funcional ou química do biofilme, ou para estudar biofilmes multiespécies. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores de vários campos, como medicina, ciência ambiental, indústria alimentícia e assim por diante, explorarem a formação de biofilme durante as interações bacterianas fúngicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e analisar a formação de biofilme bacteriano em hifas fúngicas.