Name: Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a analisar biofilmes bacterianos em hifas fúngicas usando microscopia confocal e eletrônica. Este método permite investigar a formação de biofilmes em múltiplas escalas, desde nanômetros até centímetros.

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Este trabalho foi apoiado pela Agência Nacional de Pesquisa da França por meio do Laboratório de Excelência ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), da Área de Foco Científico de Interfaces Planta-Micróbio no Programa de Ciências Genômicas e do Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental do DOE Office of Science. O Laboratório Nacional de Oak Ridge é gerenciado pela UT-Battelle, LLC, para o Departamento de Energia dos Estados Unidos sob o contrato DE-AC05-00OR22725.

1. Preparação de culturas bacterianas e fúngicas <ol><li> Preparação de culturas de fungos <ol><li> Preparar membranas de celofane com o mesmo diâmetro que os pratos de Petri e ferve-las em EDTA (1 g / L em água desionizada) durante 30 min. Lave as folhas com água deionizada e autoclave duas vezes. </li><li> Prepara-se uma pré-cultura de fungos através da inoculação de agar fúngicas conecta no meio de agar apropriado coberta com uma membrana de celofane EDTA pré-tratada. Incubar-lo na temperatura de crescimento óptima para obter colónias cerca de 1 cm de diâmetro. <ol><li> Para L. bicolor S238N, incuba-se a 25 ° C durante 5 dias em meio de agar Pachlewski P5, feitas de 0,5 g de tartarato de diNH4, 1 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de MgSO 4 .7H 2 O, 5 g de maltose D + , 20 g de glicose D +, 1 ml de 10% de tiamina-HCl, 1 ml de solução diluída de 1/10 de micronutrientes (6 g / L de sulfato ferroso, 0,27 g / L de molibdénio trioxyde; 8,45 g / l de ácido bórico; 5 g / homem Lsulfato de ganese; 5 g / l de sulfato cúprico; 2,27 g / l de sulfato de zinco) fez-se a 1 L com água desionizada; e 20 g de agar; pH 5,5. </li></ol></li><li> A partir da pré-cultura de fungos, inocular uma nova placa de agar coberto com a membrana de celofane EDTA pré-tratados que contêm um meio de agar de baixo carbono para promover a expansão radial das colónias. <ol><li> Para inocular a placa de Petri, suavemente arranhar a superfície externa (onde as células têm o mesmo estado fisiológico) de uma colónia de fungos a partir da pré-cultura com um bisturi e transferir as hifas à nova placa de agar. </li><li> Incubar à temperatura óptima de crescimento, até as novas colónias são cerca de 1 cm de diâmetro. Para L. bicolor S238N, incubar a 25 ° C durante 5 dias em meio de agar P20 (0,25 g de tartarato Dinh 4; 0,5 g de KH 2 PO 4; 0,25 g de MgSO 4 .7H 2 O; 1 g de glucose + D ; 0,5 ml de 10% de tiamina-HCl, 0,5 ml de solução de micronutrientes diluída 1/10 (cf 1.1.2.1), fez-se a 1 L com água desionizada; e 20 g de agar; pH 5,5). Nota: devido à pré-cultura em celofane, a segunda cultura não conterá meios de agar nos núcleos centrais. As fichas de ágar deve ser removido para análise posterior dos biofilmes, uma vez que estas fichas introduzir ágar e nutrientes que podem criar vieses na análise. Este passo só diz respeito fúngicas espécies que são mantidos e propagados em placas de ágar, e não é necessário para fungos que se propagam a partir de esporos ou estoques congelados. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de culturas bacterianas <ol><li> Usar uma ansa estéril para recolher 2 a 3 colónias bacterianas individuais a partir de uma cultura em meio de agar apropriado e inocular 25 ml de meio líquido de Luria-Bertani (LB) (ou qualquer outro meio apropriado, dependendo da estirpe utilizada). Para P. fluorescens BBc6, incubar uma cultura durante a noite a 28 ° C com agitação suave (~ 150 rpm). Nota: A utilização de uma estirpemarcado com proteína fluorescente, tal como GFP, é preferível, pois isto evita a execução de uma dupla-coloração (fungos e bactérias) antes de as observações microscópicas. O tempo, a velocidade de agitação, e a temperatura da incubação dependem da estirpe utilizada, sendo o objectivo obter uma cultura em crescimento exponencial tardia. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de N in vitro de biofilmes de bactérias na fúngica Colony <ol><li> Centrifugar a cultura bacteriana a 5000 xg durante 3 min e suspender o sedimento em 25 ml de tampão estéril de fosfato de potássio 0,1 M (25 g / l KH 2 PO 4 e 2,78 g / LK 2 HPO 4, pH 5,8). Repetir esta etapa uma vez e ajustar a concentração bacteriana final a 10 9 culas / ml com o mesmo tampão. </li><li> Encha uma microplacas de 6 poços com 5 ml da suspensão bacteriana (ou 0,1 M de tampão de fosfato de potássio estéril para o controlo negativo). </li><li> Corte a membrana de celofane do fungai cultura com uma lâmina de barbear esterilizada para obter quadrados de celofane com uma única colónia de fungos em cada membrana. Cuidadosamente remover os quadrados de celofane contendo hifas do meio sólido usando uma pinça e transferir o quadrado de celofane contendo hifas a um poço da microplaca contendo a suspensão bacteriana. </li><li> Agitar suavemente a microplaca enquanto as colônias de fungos ainda estão ligados ao celofane; em seguida, retire as folhas de celofane, deixando as colônias de fungos na placa. </li><li> Incubar a microplaca com agitação suave (~ 60 rpm) a uma temperatura adaptada para os microrganismos estudados. Nota: O tempo de incubação depende da velocidade de estabelecimento do biofilme e a fase a ser analisado. Para P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, incubar a 20 ° C durante 30 minutos para chegar biofilmes em fase inicial e até 16 horas para conseguir amadurecer biofilmes. </li></ol> 3. Laser Scanning Confocal análise de microscopia do formato de biofilmeíon <ol><li> Preparação de amostra <ol><li> Para remover bactérias planctónicas e bactérias electrostaticamente-ligados às hifas, lavar o fungo, transferindo-o para uma nova microplaca de 6 poços cheios com 5 ml de uma solução fortemente salina (NaCl, 17 g / l) 17; agite durante 1 min. </li><li> Transferir o fungo para uma nova microplaca de 6 poços contendo 5 ml de tampão de fosfato de potássio 0,1 M estéril, agitar suavemente durante 2 min, e transferir o fungo para tampão de fosfato de potássio fresco. </li><li> Cortar a parte da colónia de fungos a ser trabalhada com um bisturi, mantendo-o em tampão de fosfato de potássio, de tal modo que a secção obtida contém cerca de metade da colónia de fungos. </li><li> Para corar a amostra, transferi-lo para uma placa de Petri cheia de água estéril contendo um corante fluorescente apropriado (dependendo do objectivo da análise), e incuba-se no escuro. <ol><li> Para visualizar a rede fúngica, usar, por exemplo, Vermelho do Congo (0,1% de CO definitivancentration, 5 minutos de incubação), germe de trigo agglutin (WGA) lectina conjugada com Alexa Fluor 633 (10 ug / ml de concentração final, 10 minutos de incubação) ou TEMP1 (10 uM de concentração final, 10 minutos de incubação). </li><li> Se utilizando uma bactéria não-fluorescente marcado com, contracoloração das células bacterianas com uma sonda fluorescente de ADN específicos de entre os numerosos corantes de ADN de células-permeante disponíveis comercialmente. Por exemplo, usar DAPI (/ ml concentração final de 0,25 ^ g, 10 minutos de incubação). </li><li> Para visualizar as proteínas da matriz, usar uma mancha de proteína 21. </li></ol></li><li> Após a coloração, lavar a amostra, transferindo-a para uma tampa de placa de Petri contendo 10 ml de fosfato de potássio 0,1 M estéril e agitar suavemente durante 1 min. </li><li> Metade submergir um slide na tampa placa de Petri e delicadamente trazer a seção de corte para flutuar acima do slide. Em seguida, retire devagar o slide a partir da solução tampão, permitindo que a amostra assente suavemente sobre o slide. <li> Finalmente, adicione 10 ml de meio de montagem anti-desbotamento à amostra e cobri-lo com uma lamela de vidro. Observação: Uma vez que a corrediça é preparada, a análise microscópica deve ser realizada o mais rapidamente possível (dentro de, no máximo, 30 minutos), para evitar a alteração na estrutura do biofilme. </li></ol></li><li> Análise microscópica confocal <ol><li> Examine os slides em um microscópio confocal a laser com uma lente objetiva de 10X ou 40X acoplado ao software de imagem. Nota: Aqui, um multi-feixe de varrimento equipado com microscópio confocal 405, 488, e 561 nm de excitação laser, um detector de GaAsP PMT e 10X 40X e 0,3 NA NA 1,2 objectivos foi usada. <ol><li> Realizar imagem usando parâmetros adaptadas ao tipo de dados solicitados e os constrangimentos de tempo. Uso do laser de comprimentos de onda de excitação / emissão de acordo com a mancha utilizado e a recommendati do fabricanteons. Use uma combinação de varredura de azulejos e as funções Z-stack para obter vistas 3D globais da colônia de fungos e os biofilmes. Nota: Imagens do Figura 3 foram adquiridos utilizando os seguintes parâmetros: 8-bit / pixel, com média = 2, pixel de permanência = 1.58 ms, telhas de varredura de imagens 5x5 com costura on-line (cobertura de 10%, limite = 0,7); Z-passo = 2 uM. </li></ol></li><li> Para visualização de dados 3D, use um dos muitos softwares livres ou comerciais (estes oferecem muitas opções para renderização em 3D). <ol><li> Por exemplo, para exibir dados Z-stack como projeções de intensidade máxima 2D, subtrair o canal de campo brilhante, ajustar o brilho eo contraste, e mesclar canais para criar uma imagem composta. Se eles estiverem presentes, eliminar fatias sem sinal nas extremidades Z-stack. Em seguida, executar uma 2D projeção máxima intensidade e converter o resultado em cor RGB. Use a função de &quot;projeto de Z&quot; no software ImageJ 22 para obter as imagens pressentido aqui por projeções de intensidade máxima 2D. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Análise de microscopia eletrônica <ol><li> Preparar as amostras como descritos para LSCM, excepto na etapa 3.1.2, transferir os biofilmes de água estéril em vez de tampão de fosfato de potássio, após as etapas de lavagem. Isto evita a formação de cristais de sal durante a etapa de desidratação, o que iria perturbar a imagem SEM. </li><li> Transfira os biofilmes a um suporte de amostras e retire o excesso de água; permitir apenas uma pequena película de água para cobrir a amostra. </li><li> Transferir a amostra para a câmara de uma pressão variável de microscópio eletrônico de varredura (VP-SEM); congelá-lo a -50 ° C em uma fase de arrefecimento de Peltier; e permitir que ele liofilizar lentamente, directamente na câmara de SEM, com 100 Pa de pressão variável, ajustado para 15 h. </li><li> Depois de se completar a liofilização, recuperar a amostra e transferi-lo para um sistema de deposição de filmes de alto vácuo. Brasão da amostra com 2 nm de Platinam (medição de quartzo) em plasma de argônio (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA). </li><li> Observar a amostra revestida com uma SEM equipado com um canhão de emissão de campo (FEG) usando a alta resolução &quot;na lente&quot; detector e uma alta tensão eletrônico de 1 kV. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Biofilmes bacterianas são recuperadas em diversos ambientes e têm sido estudadas desde 1950, levando ao desenvolvimento de um número de métodos para analisá-los 24. Os métodos clássicos de quantificar e biofilmes monitor incluem ensaios de micro-titulação e, o método mais utilizado, cristal violeta (CV) coloração. Estes métodos são rápida, de baixo custo, e fácil de manusear e 25 são particularmente úteis para quantificar a biomassa total biofilme ou para executar os ensaios de viabilidade e de quantificação da matriz. Por um outro lado, &quot;genómica&quot; métodos também são úteis em estudos de biofilme, permitindo análises quantitativas e funcionais de biofilmes 26, 27. Apesar das vantagens da placa de micro-titulação e &quot;ômicas&quot; métodos, várias características essenciais de biofilmes não pode ser capturado com estas técnicas, o que dificulta um entendimento completo do presente processo. Tais características incluem estrutura matricials, arquiteturas colônia de bactérias, as interações / célula a célula, e padrões de colonização, que são dados fundamentais para a compreensão tanto o funcionamento de biofilmes ea dinâmica da sua formação. Apesar da capacidade da microscopia para captar esses recursos, análise de microscopia de biofilme bacteriano sobre fungos filamentosos ainda são escassos. Isto é devido, principalmente, para o crescimento de fungos filamentosos, que muitas vezes formas de colónias, redes complexas de espessura, tridimensionais. Formação de biofilme bacteriano sobre os fungos é comum em ambientes diversos e está significativamente envolvida em vários campos 4 (por exemplo, medicina, agricultura e meio ambiente.); portanto, é fundamental para desenvolver novos métodos para facilitar a sua investigação. Para este fim, um método combinado para gerar colónias de fungos muito finas com imagem microscópica dos biofilmes bacterianas. Além disso, propusemos um conjunto de ferramentas de microscopia para analisar qualitativamente esses biofilmes. O sucesso do método dependea capacidade para produzir colónias de hifa muito finas e para aplicar as tintas apropriadas. Estes pontos são discutidos abaixo. Devido às estruturas complexas dos biofilmes, compreender sua função exige uma abordagem multi-escala de 28, 29. Padrões de distribuição dos biofilmes, arquitetura bacterial colony e estrutura matricial e composição são analisadas em diferentes escalas (ie, meso-escala e micro-escala). Além disso, nanoescala resolução permite o acesso às interacções físicas / célula e a nano-estrutura da matriz. Assim, o método desenvolvido permite facilmente uma análise multi-escala dos biofilmes bacterianas formadas na colónia de fungos. Na maioria dos estudos, LSCM análises de biofilmes são limitados à micro-escala, a meso-escala normalmente ser realizada por meio de tomografia de coerência óptica 30, 31, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 32. O método aqui apresentado permite que ambas as análises micro e meso-escala por LSCM. Isto demonstra a utilidade da combinação de ambas as análises na mesma região da amostra e até mesmo sobre a mesma imagem usando nova geração microscópios confocais com alta resolução (Figura 3). Assim, as questões relacionadas com dados compilados reunidos em diferentes escalas com diferentes métodos são aqui evitados. Esta combinação de análises deu acesso concomitantemente à repartição biofilme sobre a colônia de fungos, a arquitetura colônia de bactérias ao longo do biofilme em desenvolvimento, e a estrutura da matriz. A análise de meso-escala mostrou uma distribuição heterogênea dos biofilme bacteriano sobre as colônias de fungos (Figuras 2 e 3). Esta observação não teria sido possível com os protocolos que permitem apenas imagiologia de uma pequena porção da colónia de fungos, que não é necessariamente representativos de toda a colónia. Assim, enquantomuitas vezes negligenciada, a análise de meso-escala pode dar informações preciosas sobre padrões de distribuição de biofilme. Finalmente, o método desenvolvido pode ser utilizado para analisar as amostras com diferentes técnicas de microscopia, incluindo a microscopia electrónica de varrimento. Aqui, SEM foi usada para atingir a escala nano e para obter a organização espacial bacteriana dentro do biofilme. É um desempenho muito bom com as colônias de fungos finas, enquanto SEM só é permitido de imagem em superfície. Em contraste com LSCM, SEM, no entanto, necessária a desidratação da amostra e, na maioria das vezes, o revestimento com um metal condutor. Este processo de desidratação pode alterar as estruturas biológicas quando não é devidamente executado e pode exigir otimização. Aqui, a desidratação da amostra utilizando liofilização lenta foi utilizado 33. No entanto, aplicando tanto LSCM e SEM para as amostras permitirá a realização de microscopia correlativo na mesma localização da amostra. Apesar das vantagensdescrito acima, existem algumas limitações. Em primeiro lugar, pode não ser aplicável a todos os tipos de fungos. Com efeito, este método de cultura é desenvolvida para fungos espalhamento radialmente na superfície de meios sólidos. Este método pode não ser adequado para fungos que formam principalmente hifas aéreas (por exemplo, Fusarium sp.) Ou por fungos micro-aeróbio espalhamento principalmente dentro de agar. Além disso, fungos degradantes celofane pode ser problemático, bem como (por exemplo., Trichoderma sp.). Em segundo lugar, é importante notar que a estratégia de coloração é um ponto crítico e a escolha da mancha tem de ser feita com cuidado, como a mancha não deve perturbar o biofilme. Por exemplo, verificou-se que Calcofluor Branco provocou uma ruptura parcial do biofilme (dados não mostrados), provavelmente devido ao elevado valor do pH desta mancha. Além disso, alguns corantes produzida de coloração heterogéneo (por ex., Vermelho do Congo), enquanto outros produzido coloração homogénea (por ex., A coloração da parede celular com lectina do WGA), que dá uma qualidade de imagem heterogénea.Além disso, é importante estar ciente de que alguns corantes podem não ser totalmente específica. Por exemplo, não só as manchas WGA paredes celulares dos fungos, mas também de ácido N-acetilneuramínico em paredes celulares de bactérias gram-positivas e adesinas produzidos por bactérias gram-positivas e -negativas durante a formação de biofilme 34, 35. Portanto, o uso de bactérias marcadas com proteínas fluorescentes e / ou fungos é recomendado para evitar a coloração múltipla. Se são utilizados vários corantes, eles não devem interferir quimicamente, e os seus espectros de emissão não devem sobrepor-se. Meso-escala analisa exigir uma grande área digitalizada, e, por conseguinte, LSCM pode ser demorado (40 min a 1 h, dependendo da espessura da amostra) e o gargalo análise de um grande número de amostras. No entanto, podem ser feitos ajustamentos dependendo do tipo de dados necessários. É possível reduzir o tempo de aquisição e o tamanho da imagem, alterando a qualidade de imagem. Por exemplo, de alta resoluçãonão é necessário analisar a repartição geral biofilme. Finalmente, algumas limitações precisam ser considerados quando se escolhe para exibir dados de pilha Z- como projeções 2D ou 3D. projeções bidimensionais são uma boa maneira de resumir os dados, mas informações de profundidade está perdido, e as estruturas sobrepostas tornar-se escondido. Por outro lado, as projecções 3D permitem a visualização de diferentes pontos de vista, mas muitas vezes eles tornam mal no caso de complexidade espacial. Em conclusão, nós relataram um método para a caracterização de biofilme bacteriano sobre as hifas no nível estrutural. A metodologia pode ser estendida a outras aplicações. Com efeito, este método permite que o desempenho de caracterização funcional ou química de biofilmes bacterianas formadoras de hifas fúngicas. Devido à grande variedade de sistemas repórter existentes fluorescentes, análise LSCM pode ser usado para várias finalidades 29. Por exemplo, o microfone de fluorescênciaroscopy poderia ser utilizada para monitorizar gradiente de pH 36 ou difusão molécula em biofilmes 37. Além disso, o método permite a análise da comunidade em biofilmes multiespecíficas. Por exemplo, hibridação in situ fluorescente dirigida a grupos específicos de bactérias é particularmente útil para estudar repartição bacteriana específica em multispecies biofilmes 38, 39. Últimos, numerosos corantes fluorescentes pode ser utilizado para caracterizar a composição da matriz dos biofilmes 21. Aqui, as proteínas foram alvo usando Sypro, que cora uma grande variedade de proteínas, entre elas as proteínas da matriz (Figura 4), mas outros corantes permite a visualização de outros constituintes da matriz importantes, tais como exopolissacáridos ou ADN extracelular. Curiosamente, todas estas análises poderão ser realizadas no meso-escala, utilizando o método descrito. Desde LSCM podem ser realizados em amostras de vida,Também é possível obter imagens de lapso de tempo utilizando, por exemplo, câmaras coverwell, particularmente adequados para colónias de fungos finas. Esta opção é particularmente interessante, como a formação de biofilme é um processo complexo e dinâmico. Por fim, para uma finalidade quantitativa, o método relatado pode melhorar a precisão da análise quantitativa automática, fazendo esta quantificação possível em imagens de meso-escala. Isto pode superar a heterogeneidade de biofilme e questões estatísticas 29.

Fungos e bactérias têm muitas oportunidades de interagir uns com os outros, porque eles coabitam na maioria dos ambientes terrestres. Devido à sua diversidade e sua onipresença, essas interações são importantes em muitas áreas biológicas, incluindo a biotecnologia, agricultura, processamento de alimentos e medicamentos 1, 2. Interacções moleculares requerem um certo grau de proximidade para permitir as trocas entre os parceiros e, em alguns casos, uma associação física dos parceiros é necessário para uma interacção funcional 3. A associação física comum entre as bactérias e fungos, é a formação de biofilmes em superfícies bacterianas fúngicas 4. Este contacto directo entre as células bacterianas e hifas fúngicas permite interacções íntimos que estão envolvidos em vários processos biológicos. Por exemplo, na medicina, o estudo da formação de biofilme de Pseudomonas aeruginosa no oportu-tunistic fungo patogênico Candida albicans pode fornecer insights sobre a relação entre a formação de biofilme e virulência 5. Na agricultura, estudos sugerem que do crescimento das plantas, bactérias promotoras Rizobactérias e biocontrole têm uma maior eficiência quando associado com um fungo num biofilme misto. Por exemplo, elkanii Bradyrhizobium têm reforçado atividade -fixing N 2, quando associado com Pleurotus ostreatus em um biofilme misto 6. Finalmente, em biorremediação, os biofilmes mistos bacteriana-fúngicos têm sido utilizados para a recuperação de sítios poluídos 7, 8. LSCM é particularmente adequado para estudar biofilmes uma vez que permite uma observação tridimensional de vida biofilmes hidratado com pré-tratamentos mínimos, mantendo, assim, a estrutura do biofilme e organização. Assim, a análise de biofilme por LSCM é muito informativo, especialmente para detarminho o decurso no tempo da formação de biofilme e a detecção de fases característicos 9, 10, a partir do passo de adesão para o desenvolvimento de um biofilme maduro. Também é particularmente adaptado-se visualizar a estrutura do biofilme e a matriz 11, 12 ou para quantificar o tamanho de biofilme 13, 14. Embora este método é adequado para estudar biofilmes em superfícies bióticos ou abióticos finas, estudando biofilme bacteriano sobre uma colónia de fungos filamentosos ainda é muito difícil. Na verdade, a maioria dos fungos filamentosos construir, complexos e redes tridimensionais de espessura em cultura. Mesmo se os objectos grossos podem ser visualizados por microscopia confocal, a atenuação da penetração do laser e a emissão de fluorescência, muitas vezes diminuem a qualidade das imagens finais ao longo de uma profundidade de 50 mm 15. Além disso, porque colónias fúngicas não são rígidas, it é difícil lidar com os microorganismos sem perturbar os biofilmes. Devido à espessura das amostras, as poucas análises microscópicas de biofilme bacteriano sobre as hifas dos fungos são geralmente realizada apenas sobre uma pequena parte da colónia de fungos, por conseguinte, contendo apenas poucos hifas 16, 17, 18. Tudo isto limita a nossa capacidade para descrever a distribuição do biofilme sobre a colónia de fungos e, assim, pode trazer polarizações para a análise no caso da distribuição heterogénea do biofilme dentro da colónia de fungos. Para ultrapassar tais dificuldades, relata-se um método para o crescimento e a análise de biofilme bacteriano sobre as hifas dos fungos. Este método foi aplicado para estudar a formação de biofilme em Pseudomonas fluorescens BBc6 sobre as hifas do basidiomycete ectomicorrízico Laccaria bicolor S238N. Estes dois microorganismos floresta-solo foram previamente descritos para formar mistaestruturas biofilme-like 19, 20. Este método pode facilmente ser ainda adaptado para outros sistemas de fungos / bacteriana filamentosos. O método aqui apresentado baseia-se na combinação de um método de cultura de fungos, permitindo o crescimento de colónias de fungos muito finas, com LSCM e imagem SEM. Isto permitiu-nos obter micro- (gama uM) e meso (gama mm) dimensionar vistas da interacção entre os dois microorganismos, que permite a caracterização qualitativa do biofilme. Nós também mostraram que as amostras podem ser observados com o SEM, permitindo a análise estrutural do biofilme ao nível nano-escala (gama de nM).

<table><tbody><tr><td>Placas de cultura de tecidos de falcão de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-33</td><td>Usado em 2.2 e 3.1</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Fisher Scientific</td><td>C580-25</td><td>Usado em 3.1.4.1</td></tr><tr><td>FUN 1 Cell Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F7030</td><td>Usado em 3.1.4.1</td></tr><tr><td>Aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 633 Conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W21404</td><td>Usado em 3.1.4.1</td></tr><tr><td>Solução DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td>Usado em 3.1.4.2</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>Usado em 3.1.4.3</td></tr><tr><td>FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix proteína Mancha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10318</td><td>Usado em 3.1.4.4</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>Usado em 3.1.7</td></tr><tr><td>LSM780 Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Usado no software 3.2.1</td></tr><tr><td>ZEN 2.1 lite black&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>usado em 3.2.1</td></tr><tr><td>Revestidor de alto vácuo Leica EM ACE600</td><td>Leica</td><td></td><td>usado em 4</td></tr><tr><td>GeminiSEM-FEG</td><td>Zeiss</td><td></td><td>usado em 4</td></tr></tbody></table>

um novo método para a análise qualitativa multi-escala de bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica colonies usando confocal e microscopia eletrônica

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

biofilme bacteriano frequentemente formar em superfícies fúngicas e pode ser envolvido em numerosos processos de interação bacteriana-fúngicos, como a cooperação metabólica, competição ou predação. O estudo de biofilmes é importante em muitos campos biológicos, incluindo ciências ambientais, produção de alimentos e medicamentos. No entanto, poucos estudos têm-se centrado em tais biofilme bacteriano, em parte devido à dificuldade de investigá-los. A maioria dos métodos de biofilme análises quantitativa e qualitativa descritos na literatura são adequados apenas para biofilmes em superfícies que formam abióticos ou em superfícies homogéneas bióticos e fino, tal como uma monocamada de células epiteliais. Enquanto microscopia confocal de varrimento laser (LSCM) é frequentemente utilizado para analisar in situ e em biofilmes in vivo, esta tecnologia se torna muito desafiador quando aplicada a biofilme bacteriano sobre as hifas fúngicas, devido à espessura e as três dimensões do netw hifasorks. Para superar este inconveniente, foi desenvolvido um protocolo combinando microscopia com um método para limitar a acumulação de camadas de hifas em colónias de fungos. Usando este método, fomos capazes de investigar o desenvolvimento de biofilme bacteriano em hifas fúngicas em múltiplas escalas usando microscopia LSCM e eletrônica de varredura (MEV). Este relatório descreve o protocolo, incluindo culturas de microrganismos, condições de formação de biofilmes bacterianas, coloração biofilme e LSCM e visualizações SEM.

O procedimento geral esquemática de cultura de fungos e preparação do biofilme são dados na Figura 1. O método de cultura permitiu-nos obter colónias de fungos de 20 a 50 mm de espessura, contendo algumas camadas de hifas, permitindo que micro e meso-escala análises de biofilme de estar hidratado usando LSCM. A aplicação do método permitiu a obtenção de imagens de alta qualidade P. fluorescens-BBc6 biofilmes sobre L. bicolor hifas ao longo da formação do biofilme (Figuras 2 - 4). A análise de meso-escala dos biofilmes demonstrada a distribuição heterogénea do biofilme de P. fluorescens BBc6 sobre as hifas de L. bicolor S238N (Figuras 2 e 3). Análise de meso-escala também permitiu o acompanhamento da formação de biofilme ao longo do tempo (Figura3) a partir dos primeiros passos, em que apenas algumas bactérias foram ligadas a hifas (Figura 3A), para a formação de uma espessa, biofilme maduro (Figura 3b). A alta resolução das imagens de meso-escala nos permitiu realizar a análise de micro-escala nas mesmas imagens, a fim de obter as arquiteturas colônia (Figura 3C - d). A análise micro-escala combinada com a rotulagem específica nos permitiu dar um passo adiante na caracterização do biofilme. Aqui, SYPRO rubi 23, os marcadores que a maioria das classes de proteínas, foi aplicado às amostras (Figura 4) e mostra a presença de proteínas na matriz. Finalmente, mais detalhes da estrutura do biofilme foram obtidas por SEM de imagem da mesma amostra após a desidratação e de revestimento (Figura 5). SEM imagem fornecidaacesso à escala nanométrica, dando, assim, o acesso à estrutura da matriz. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig1.jpg"> Figura 1: procedimento esquemática geral da cultura fúngica e preparação biofilme. Esta figura descreve as principais etapas do método, a partir de culturas de microrganismos para provar análises. Mais detalhes são dados no protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig2.jpg"> Figura 2: repartição biofilme BBc6 na colônia de fungos. A amostra foi fotografada depois de 18 horas de interação no aumento de 10x. A imagem foi obtida através de 2D projeção de intensidade máxima de imagens de microscopia confocal 3D. A grade de cinza na figure descreve as posições de mosaico. L. bicolor hifas estão manchadas com o Congo Red (vermelho) e bactérias são marcadas com GFP (verde). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig3.jpg"> Figura 3: Os estágios iniciais e tardios da BBc6 formação de biofilme em L. bicolor hifas. Esta imagem foi obtida através de 2D projeção de intensidade máxima de imagens de microscopia confocal 3D. A visualização foi realizada a ampliação de 40X. (A) Biofilmes repartição após 2 horas de interação. (B) repartição de biofilme após 14 horas de interação. (C) Ampliação do rectângulo branco em (a). (D) O alargamento do rectângulo branco em (b). hifas fúngicas estão manchadas com o Congo Red (vermelho) e bactérias são GFP-tagged (verde). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig4.jpg"> Figura 4: coloração Matriz de BBc6 biofilme sobre L. bicolor hifas. (A) Biofilmes após 16 horas de interação. (B) alargamento do rectângulo branco em (a). A visualização foi realizada a ampliação de 40X, e essas imagens foram obtidas por meio de projecção 2D máxima intensidade das imagens de microscopia confocal 3D. As bactérias são marcadas com GFP (verde), o fungo está manchado com fun1 (verde escuro) e as proteínas são coradas com S. Ruby (vermelho). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 5: SEM imagem de biofilmes BBc6 sobre L. bicolor hifas. SEM A visualização foi realizada a 2360X, EHT: 1 kV. Antes de imagem, a amostra foi lentamente liofilizou-se na câmara de SEM e revestido com platina. setas verdes apontam para biofilme bacteriano e setas amarelas apontam para hifas fúngicas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

O objetivo geral deste protocolo é usar microscopia para analisar a formação de biofilmes bacterianos em hifas filamentosas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como como o biofilme bacteriano é formado nas hifas, quão específicas elas são e do que são feitas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a investigação da formação de biofilme bacteriano em hifas fúngicas em múltiplas escalas, desde as faixas nanométricas até centímetros.A demonstração do procedimento será feita por Cora Miquel Guennoc do meu laboratório, e Christophe Rose, engenheiro de microscopia eletrônica da Plataforma INRA PTEF. Para começar, prepare membranas de celofane com o mesmo diâmetro das placas de Petri e coloque-as em EDTA fervente por 30 minutos. Em seguida, use água deionizada para enxaguar as folhas e autoclave-as duas vezes.Para preparar pré-culturas fúngicas, inocular o fungo em meio de ágar, coberto com uma membrana de celofane pré-tratada com EDTA. Incubar as culturas na temperatura ideal para obter colônias de aproximadamente um centímetro de diâmetro. A partir da pré-cultura, inocular uma placa de Petri de meio de ágar apropriado, coberta com a membrana de celofane EDTA, usando um bisturi para arranhar suavemente a área externa de uma colônia de pré-cultura e, em seguida, transferindo as hifas para a placa de ágar.Incube as placas na temperatura ideal até que as colônias tenham aproximadamente um centímetro de diâmetro. Para preparar culturas bacterianas como P. fluorescens BBc6, use uma alça estéril para coletar duas a três colônias bacterianas individuais do meio de ágar e inocular 25 mililitros de LB. Incube a cultura na temperatura ideal durante a noite. Depois de cultivar a bactéria durante a noite, centrifugue a cultura a 5.000 vezes g por três minutos.Em seguida, suspenda o pellet em 25 mililitros de tampão fosfato de potássio estéril de 0,1 molar. Depois de repetir a centrifugação, use o mesmo tampão para ajustar a concentração bacteriana final para 10 elevado à nona célula por mililitro. Encha uma microplaca de seis poços com cinco mililitros da suspensão bacteriana.Use uma lâmina de barbear estéril para cortar a membrana de celofane da cultura fúngica em quadrados, com uma única colônia em cada membrana. Em seguida, com uma pinça, remova cuidadosamente os quadrados de celofane contendo hifas do meio sólido e transfira-os para poços individuais da suspensão bacteriana. Agite suavemente a microplaca até que as colônias de fungos se desprendam do celofane.Em seguida, remova as folhas de celofane, deixando as colônias de fungos no prato. Incubar a microplaca com agitação suave a 20 graus Celsius por um tempo, dependendo das cepas utilizadas e do estágio a ser analisado. Para P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor, incubar as culturas por 30 minutos para obter biofilmes em estágio inicial e por até 16 horas para biofilmes maduros.Para remover bactérias planctônicas e bactérias eletrostaticamente ligadas às hifas, enxágue o fungo transferindo-o para uma nova microplaca de seis poços cheia de solução salina forte. Agite suavemente o prato por um minuto. Transfira o fungo para uma nova microplaca de seis poços contendo cinco mililitros de tampão fosfato de potássio 0,1 molar estéril.Agite suavemente o prato por dois minutos e, em seguida, transfira o fungo para um tampão fresco. Enquanto mantém a colônia de fungos em tampão, use um bisturi para cortar a colônia aproximadamente ao meio. Transfira metade da colônia a ser corada para uma placa de Petri contendo um mililitro de água estéril, suplementada com um corante fluorescente apropriado para visualizar a rede fúngica, como aglutinina de gérmen de trigo conjugada a Alexa Fluor 633.Em seguida, incube a amostra no escuro. Após a coloração, enxágue a amostra transferindo-a para uma tampa de placa de Petri contendo 10 mililitros de tampão fosfato de potássio estéril 0,1 molar e agite suavemente por um minuto. Mergulhe uma lâmina na tampa da placa de Petri e posicione delicadamente a seção cortada para flutuar acima da lâmina.Em seguida, levante lentamente a lâmina da solução tampão, permitindo que a amostra se deposite suavemente na lâmina. O aspecto mais delicado é o posicionamento da amostra na lâmina. Para evitar a descrição do biofilme, a amostra e a lâmina devem ser imersas durante o posicionamento da amostra, e a amostra não deve ser movida mais antes da imagem.Por fim, adicione 10 microlitros de meio de montagem anti-desbotamento à amostra e cubra-a com uma lamínula de vidro. Examine as lâminas sob um microscópio confocal a laser com uma objetiva de 10x ou 40x. Use uma combinação de varredura de blocos e as funções Z-stack para obter visualizações 3D globais da colônia de fungos e dos biofilmes.Para realizar a microscopia eletrônica, após enxaguar o fungo em solução salina forte como antes, transfira o fungo para água estéril em vez de tampão para evitar a formação de cristais de sal durante a etapa de desidratação. Transfira os biofilmes para um porta-amostras e remova o excesso de água. Em seguida, transfira as amostras para a câmara de um microscópio eletrônico de varredura de pressão variável.Em um estágio de resfriamento Peltier, congele a amostra a 50 graus Celsius negativos, permitindo que ela seque lentamente diretamente na câmara SEM, com 100 Pascals de pressão variável definida por 15 horas. Recupere a amostra e transfira-a para um sistema de deposição de filme de alto vácuo. Em seguida, cubra a amostra com dois nanômetros de platina sob plasma de argônio.Observe a amostra revestida com um microscópio eletrônico de varredura, com uma pistola de emissão de campo usando o detector de alta resolução na lente e uma alta tensão eletrônica de um quilovolt. Esta análise em mesoescala de biofilmes demonstra a distribuição heterogênea do biofilme de P. fluorescens BBc6 em verde nas hifas de L. bicolor S238N, mostradas em vermelho. A análise também possibilitou o rastreamento da formação de biofilme ao longo do tempo, desde as etapas iniciais em que apenas algumas bactérias marcadas com GFP estavam ligadas às hifas, mostradas em vermelho, até a formação de um biofilme espesso e maduro.Como mostrado aqui, as imagens de mesoescala de alta resolução também foram usadas para realizar análises em microescala, para obter arquiteturas de colônias. Além disso, nesta projeção de intensidade máxima 2D de alta resolução de uma imagem confocal 3D, a marcação específica com SYPRO Ruby, mostrada em vermelho, indica a presença de proteínas na matriz, com bactérias BBc6 marcadas com GFP e fungo marcado com FUN-1 em verde escuro. Após a desidratação e codificação da mesma amostra, mais detalhes da estrutura do biofilme foram obtidos por imagem de MEV.As pontas das setas verdes apontam para células bacterianas no biofilme e as pontas das setas amarelas apontam para hifas fúngicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de duas horas e meia para uma amostra, sem contar o tempo de incubação para a formação do biofilme e a cultura de microrganismos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso do método depende muito da capacidade de obter colônias de fungos muito finas, feitas de apenas algumas camadas de hifas.Após esse procedimento, outros métodos, como mutagênese ou hibridização in situ, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como a caracterização funcional ou química do biofilme, ou para estudar biofilmes multiespécies. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores de vários campos, como medicina, ciência ambiental, indústria alimentícia e assim por diante, explorarem a formação de biofilme durante as interações bacterianas fúngicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e analisar a formação de biofilme bacteriano em hifas fúngicas.

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Research

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