Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

O objetivo geral deste procedimento é visualizar o citoesqueleto de actina em células de mamíferos aderentes no nível ultraestrutural, usando um método de microscopia de super-resolução tridimensional chamado iPALM. A imagem iPALM fornece resolução espacial nanométrica subtendencial em todas as três dimensões. Isso permite que as ultraestruturas sejam visualizadas usando sondas de florescência, permitindo alta especificidade de marcação.

O procedimento apresentado neste vídeo deve ser rapidamente adaptável e instrutivo para visualizar outras características ultraestruturais em células por localização de molécula única com base em microscopia de super-resolução. Comece este procedimento preparando as células em vidros de cobertura em uma placa de seis poços. Para montar a amostra de imagem, use uma pinça fina para remover suavemente a lamínula do poço tampão.

Em seguida, retire rápida e suavemente o excesso de tampão tocando na borda da lamínula com papel absorvente dobrado. Coloque o lado da célula de vidro de cobertura voltado para cima em um pedaço de papel limpo para lentes. Enxágue a amostra colocando 30 a 50 microlitros do tampão de imagem na amostra.

Remova o excesso de tampão inclinando e batendo com papel absorvente dobrado. Depois de repetir a etapa de enxágue algumas vezes, coloque 30 a 50 microlitros de tampão de imagem na amostra. Seque a borda da lamínula e coloque vários pontos muito pequenos de epóxi de cura rápida na área seca.

Abaixe lentamente outra lamínula número 1,5 pré-limpa no centro da célula contendo a lamínula de 22 milímetros. Deixe o tampão de imagem molhar ambas as lamínulas por ação capilar. Os pequenos pontos de epóxi de cura rápida devem aderir a ambos os vidros de cobertura.

Pressione suavemente a amostra montada usando papel absorvente dobrado para distribuir a pressão uniformemente. Use pressão suficiente para tornar a célula da amostra fina e uniforme, mas não tanto a ponto de esmagar as células. Meça a espessura adequada observando o padrão dos anéis de Newton.

Certifique-se de executar esta etapa com cuidado para minimizar as bolhas de ar. Se necessário, pratique com copos vazios várias vezes antes. Em seguida, sele a amostra com parafina de lanolina de vaselina derretida.

Em seguida, enxágue a amostra selada com água deionizada. Seque a amostra com ar comprimido para prepará-la para montagem no microscópio. Mova a lente objetiva superior com mola para cima para permitir a remoção do suporte de amostra.

Coloque a amostra selada no porta-amostras e prenda com vários pequenos ímãs de terras raras. Aplique óleo de imersão em ambos os lados da amostra de imagem. Coloque o sample suporte de volta no caminho óptico e abaixe suavemente a lente objetiva superior.

Ligue os lasers de excitação. Ligue também as câmeras EMCCD no modo de transferência de quadros. Em seguida, gire os filtros de emissão adequados.

Ative um obturador mecânico para bloquear o caminho do feixe superior e abrir o caminho do feixe inferior. Traga a lente objetiva inferior em foco por translação em pequenos incrementos usando o atuador piezoelétrico. Quando o fiducial estiver em foco, abra o caminho do feixe superior enquanto bloqueia o caminho do feixe inferior e coloque a lente objetiva superior em foco de maneira semelhante.

Monitore a largura do fiducial na tela do computador para obter o foco ideal. Para uma centralização adequada, abra os caminhos da viga superior e inferior. Ajuste manualmente a lente objetiva superior enquanto a objetiva inferior é mantida constante usando um par de parafusos de fixação microfinos até que as imagens fiduciais sejam sobrepostas o mais próximo possível, idealmente dentro de um pixel.

Em seguida, execute ajustes finos para que as imagens fiduciais se sobreponham dentro de um décimo de um pixel EMCCD. Ajuste os espelhos piezoelétricos de dois eixos superiores através do software de controle, mantendo as lentes objetivas e os espelhos de reflexão inferiores constantes. Compare os centros dos fiduciais das vistas objetivas superior e inferior por meio da tela do computador para orientar o processo.

Com os lasers ligados, as câmeras transmitindo continuamente e os caminhos do feixe superior e inferior abertos, oscilam o suporte de amostra Z piezo usando uma forma de onda de tensão senoidal gerada pelo software de controle para uma oscilação contínua do eixo Z em uma magnitude de 400 nanômetros. Translade manualmente o conjunto do divisor de feixe motorizado para cima ou para baixo até que a intensidade do fiducial oscile. Devido ao efeito de interferência de fóton único desejado, isso significa a correspondência próxima dos comprimentos do caminho óptico.

Uma proporção de pico para vale superior a 10 pode ser alcançada em casos ideais. Para garantir que a amplitude e a fase em cada superfície sejam o mais uniformes possível em todo o campo, ajuste o espelho inferior do conjunto do divisor de feixe em pequenos passos para ajustar a folga e os ângulos de inclinação. Execute o alinhamento fino do divisor de feixe traduzindo a amostra em oito etapas Z de nanômetros em 800 nanômetros.

Monitore a intensidade fiducial entre as câmeras de um a três. Ajuste a altura, a posição e a inclinação do espelho inferior dentro do conjunto do divisor de feixe em pequenos passos, de modo que a fase de oscilação da câmera um em relação à câmera dois seja maximizada, idealmente em 120 graus. Quando o alinhamento inicial estiver concluído, traduza a amostra para procurar um campo de visão adequado que contenha células para imagem e vários fiduciais próximos.

Coloque um gabinete ao redor do sistema para bloquear a luz difusa e as perturbações do ambiente. Uma vez encontrada a área de imagem, traduza a amostra novamente e registre a curva de calibração para uso em extrações de coordenadas Z subsequentes. Usando o comando adquirir varreduras de calibração versus posição piezo de amostra na interface principal.

Assim que uma área desejada for encontrada e a curva de calibração for obtida, insira os nomes de arquivo apropriados no software. Abra os caminhos do feixe superior e inferior e, em seguida, aumente a potência de excitação do laser de 642 nanômetros ao máximo. Para Alexa Fluor 647, pode ser necessário um período inicial de desligamento do Fluor-4

Expor com uma excitação constante de 642 nanômetros por cinco minutos, ou mais, se necessário, até que uma única molécula piscando seja observada. O software permite um aumento automático de fotoativação de 405 nanômetros durante o curso da aquisição. Um grande número de quadros de aquisição geralmente é necessário para que as características filamentosas sejam claramente visíveis.

Quando estiver pronto, inicie a aquisição de conjuntos de imagens brutas usando o comando start iPALM acquisition na interface principal. Durante a aquisição, ajuste o nível de ativação da foto ajustando a intensidade do laser de 405 nanômetros para manter a densidade de piscar adequada conforme necessário. Quando a lamínula da amostra é montada corretamente, os anéis de Newton podem ser observados a olho nu sob luz ambiente ou iluminação fluorescente padrão.

A extração das posições axiais dos emissores de fluorescência requer interferência multifásica simultânea na imagem iPALM, que é calibrada pelas mudanças de intensidade de um determinado fiducial em três EMCCDs. As intensidades são então normalizadas e ajustadas para determinar as diferenças de fase. Aqui está a imagem iPALM de reconstrução com cada coordenada de localização renderizada por um gaussiano 2D com a largura correspondente à incerteza de localização.

A coordenada Z é colorida de acordo com a barra de cores. Áreas de características filamentosas densas e esparsas podem ser vistas. Aqui são mostradas imagens iPALM de reconstrução do citoesqueleto de actina de células HUVEC marcadas por Alexa Fluor 647 faloidina.

A cor da imagem indica as coordenadas Z de acordo com a barra de cores. O histograma da seção transversal é gerado a partir das coordenadas de localização XY ao longo do eixo longo da área encaixotada. O encaixe gaussiano mostra largura total na metade máxima de 43,88 nanômetros associada à seção transversal transversal.

Este histograma é da posição Z das coordenadas de localização na área encaixotada. O encaixe gaussiano mostra largura total na metade do máximo de 17,50 nanômetros. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 90 minutos se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como visualizar o citoesqueleto de actina no ultraestrutural usando o iPALM por meio de preparação e montagem simples, alinhamento óptico, aquisição de dados brutos e análise subsequente para reconstrução de imagens de super resolução. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da biologia celular explorarem a arquitetura em nanoescala do citoesqueleto de actina, bem como estruturas de adesão celular, como as aderências focais.