preparação e In Vitro Caracterização de agentes de contraste à base de dendrímeros para Ressonância Magnética

O objetivo geral deste procedimento é mostrar a preparação e caracterização de um quelante paramagnético dendrimérico que pode ser usado como agente de contraste para ressonância magnética e demonstrar seu desempenho em um experimento de imagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos agentes de contraste de ressonância magnética, como as propriedades e a eficácia dos agentes de contraste dendriméricos. A principal vantagem dessa técnica é a preparação conveniente do eficiente agente de contraste de ressonância magnética com alto teor de proteína, garantindo assim sua fácil caracterização.

Este método pode se estender para outras modificações estruturais e otimizações funcionais de agentes de contraste de ressonância magnética dendrimérica, o que é de grande relevância para potenciais aplicações in vivo. As implicações se estendem à pesquisa biomédica e diagnóstico por imagem, pois a alta taxa molecular de agentes de contraste dendriméricos causa tempos de retenção de tecido mais longos e aumenta substancialmente o sinal de ressonância magnética. Primeiro, dissolva um grama do precursor macrocíclico DO3A éster tributílico em cinco mililitros de DMF.

Adicione 0,67 gramas de carbonato de potássio e mexa em temperatura ambiente por 45 minutos. Adicione 0,87 gramas de terc-butil-2-bromo-4 4-nitrofenil butatnoato em porções por mais de uma hora e continue mexendo a mistura de reação por 18 horas. Em seguida, remova o DMF com destilação a vácuo bulbo a bulbo a 40 a 60 graus Celsius.

Purificar o resíduo com cromatografia em coluna de sílica-gel para obter um sólido redondo. Dissolva um grama do sólido em uma mistura de 10 mililitros de etanol e 150 microlitros de uma solução de sete amônia normal em metanol. Adicione 150 miligramas de paládio no carvão ativado e instale o reator de garrafa no hidrogenador.

Agite a mistura por 16 horas sob uma atmosfera de hidrogênio de 2,5 bar. Despeje uma suspensão de terra de diatomáceas em etanol em um funil de vidro sinterizado Filtre a mistura de reação através da terra de diatomáceas para remover o catalisador de carbono de paládio. Remova o solvente do filtrado em um evaporador rotativo.

Dissolva o sólido resultante em 15 mililitros de diclorometano e quatro equivalentes de trietilamina. Para isso, adicione 1,3 equivalentes de tiofosgênio e mexa a mistura em temperatura ambiente por 16 horas. Remover o solvente da mistura de reacção num evaporador rotativo e purificar o resíduo com cromatografia em coluna de sílica-gel para obter o monómero do tipo DOTA sob a forma de sólido castanho claro.

Prepare 66,7 miligramas de dendrímero G4 PAMAM a partir de uma solução a 10% em metanol, evaporando o solvente em um evaporador rotativo a 40 graus Celsius. Dissolva o dendrímero em quatro mililitros de DMF. Adicione 0,105 mililitros de trietilamina à solução do dendrímero e mexa por 45 minutos a 60 graus Celsius.

Em seguida, adicione 354 miligramas do monômero em porções ao longo de uma hora. Continue mexendo a 45 graus Celsius por 48 horas. Remova o solvente com destilação a vácuo bulbo a bulbo.

Embalar uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho por meio de filtração em gel lipofílico em metanol por três horas à temperatura ambiente. Coletar frações de um mililitro usando metanol como eluente. Analise as frações por TLC.

Remover o solvente das fracções que contêm o quelante dendrimérico protegido num evaporador rotativo. Adquira um espectro de RMN de prótons do composto e integre as regiões aromáticas e alifáticas. Usando esses valores, determine o número de macrociclos protegidos do tipo DOTA acoplados ao dendrímero G4 PAMAM.

Para desproteger o produto, dissolva o sólido em cinco mililitros de ácido fórmico e mexa a mistura a 60 graus Celsius por 36 horas. Remova o ácido fórmico com um evaporador rotativo. Liofilizar o resíduo removido do evaporador rotativo para obter o quelante dendrimérico.

Usando RMN de prótons, determine o número de unidades macrocíclicas acopladas ao dendrímero. Dissolva o quelante liofilizado em água. Use hidróxido de sódio 0,1 molar para ajustar o pH da solução para 7,0.

Adicionar uma solução de 113 mg de cloreto de gadolínio III em um mililitro de água gota a gota à solução quelante durante um período de quatro horas. Ajuste periodicamente o pH para 7,0 com hidróxido de sódio 0,05 molar. Mexa a mistura em temperatura ambiente por 24 horas.

Em seguida, adicione 158 miligramas de EDTA em porções durante um período de quatro horas, corrigindo o pH de volta para 7,0 conforme necessário. Mexa por mais 24 horas em temperatura ambiente. Embale uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com meio de filtração de gel hidrofílico inchado em água.

Concentrar a mistura de reacção, carregar a mistura na coluna e eluir com água desionizada. Centrifugue a amostra purificada em uma unidade de filtro de centrífuga de três quilodalton por 30 minutos a 1.800 vezes g. Repita a filtração cerca de cinco vezes para remover o excesso de gadolínio e EDTA.

Confirmar a ausência de iões gadolínios livres no filtrado com um teste de laranja de xilenol. Remover os voláteis da amostra filtrada e liofilizar o resíduo para obter o agente de contraste dendrímero. Preparar uma solução-mãe de DCA em água com uma concentração entre cinco e 10 milimolares.

Para determinar a concentração precisa de DCA, primeiro combine 360 microlitros da solução estoque com 60 microlitros de um padrão D2O e terc-butanol. Coloque 400 microlitros da amostra em um tubo de RMN externo. Coloque um tubo de inserção de RMN coaxial contendo um terc-butanol e uma solução de referência de água no tubo de amostra.

Adquira um espectro de RMN de prótons e meça a mudança de frequência entre os sinais de terc-butanol das soluções de referência e de amostra. Calcular a concentração de DCA utilizando a fórmula indicada, corrigindo o terc-butanol adicionado na amostra. Determine a concentração de uma solução GdDOTA disponível comercialmente da mesma maneira.

Coloque as soluções DCA e GdDOTA em buffer HEPES e controles de água em dois conjuntos de frascos de plástico. Feche os frascos com tampas garantindo que não haja bolhas de ar. Em uma seringa de 60 mililitros, carregue horizontalmente as amostras de DCA de 0,01 e 0,02 milimolares, uma das amostras de GdDOTA de 0,5 e 1,0 milimolar e dois dos controles de água.

Repita este procedimento carregando o segundo conjunto de amostras em uma segunda seringa de 60 mililitros. Encha cada seringa com uma solução milimolar de GdDOTA e tampe as pontas da seringa. Coloque uma das seringas horizontalmente em um scanner de ressonância magnética de modo que as amostras fiquem verticais em relação ao scanner.

Deslize as seringas para o centro do scanner. Selecione a varredura anatômica para posicionar a seringa no isocentro do ímã. Em seguida, pressione o botão do semáforo para realizar ajustes dos parâmetros iniciais de varredura e iniciar a varredura.

Escolha o método de disparo de ângulo rápido/lento para realizar imagens ponderadas em T1 ou o método de aquisição rápida com aprimoramento de relaxamento para realizar imagens ponderadas em T2. Use a varredura do localizador para selecionar a fatia coronal para as amostras alinhadas verticalmente. Otimize o contraste com os parâmetros de aquisição de ruído e adquira a imagem.

Use um ROI circular para determinar a amplitude média do sinal e o desvio padrão para o plano de fundo e para cada amostra. Calcule a relação sinal-ruído. RMN, MALDI-TOF MS e análise elementar indicaram que uma média de 49 unidades macrocíclicas foram conjugadas ao dendrímero G4 PAMAM.

As concentrações e os tempos de relaxamento longitudinal e transversal das soluções de DCA também foram determinados com RMN. Os valores de relaxividade obtidos foram comparados com um monômero GdDOTA disponível comercialmente e usado clinicamente. O desempenho do DCA também foi comparado ao monômero GdDOTA.

Dois conjuntos de soluções tinham concentrações de gadolínio semelhantes, conforme determinado pelo número de unidades macrocíclicas conjugadas e os outros dois conjuntos tinham concentrações moleculares semelhantes. Em um experimento de imagem ponderado em T1 com concentrações semelhantes de gadolínio, a relação sinal-ruído foi ligeiramente maior para DCA do que para GdDOTA. Quando as soluções tinham concentrações semelhantes por molécula, a relação sinal-ruído DCA era cerca de três vezes maior que a do GdDOTA.

Em um experimento de imagem ponderado em T2, a relação sinal-ruído do DCA foi significativamente menor do que a do GdDOTA em ambos os pares de concentração, particularmente em concentrações mais altas de DCA. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar um agente de contraste de ressonância magnética à base de dendrímero purificado e caracterizado. Seguindo este procedimento, diferentes tipos de agentes de contraste de ressonância magnética dendrimérica e nanométrica podem ser preparados modificando as unidades da molécula e convenientemente analisados.

Depois de dominar essa técnica, os pesquisadores no campo do desenvolvimento de agentes de contraste de ressonância magnética devem ser capazes de preparar uma série de sondas específicas para executar vários estudos funcionais de importância crítica para a imagem molecular contemporânea.