Name: Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a determinar a contagem e a citotoxicidade de células NK em amostras de sangue total humano usando citometria de fluxo. Este método rápido e reprodutível apoia pesquisas imunológicas e estudos de intervenções terapêuticas.

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Este projeto foi apoiado pelo Subsídio Competitivo da Iniciativa de Pesquisa em Agricultura e Alimentos nº 2100-68003-30395 do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA.

NOTA: Todos os procedimentos de recolha de sangue foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB). 1. Recolha de Sangue Total <ol><li> Tenha um phlebotomist certificada tirar sangue de acordo com as diretrizes da Organização Mundial de Saúde. </li><li> Tirar sangue em um 4 ml tubo de colheita de sangue contendo ácido Di-Potássio etilenodiaminotetracético (EDTA K 2). Inverta tubo de recolha de sangue de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha tubo de coleta de sangue à temperatura ambiente num agitador de bancada até à separação. </li></ol> 2. Preparação de células alvo marcadas com DiO <ol><li> Crescer as células K562 em completa de Iscove Modified Meios de Dulbecco (IMDM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina durante várias semanas, antes do ensaio para assegurar a saúde das células. Ajuste o concentratde iões das células a 3 x 10 5 células / mL diariamente através da realização de uma contagem de células e subsequente passagem de células. Executar uma mudança de meio completo a cada 2 a 3 dias. </li><li> No dia do ensaio, executar uma contagem de células utilizando uma mistura 1: 1 hemocitómetro. <ol><li> Retirar 10 mL do frasco K562 e coloque em 1,5 mL tubo. </li><li> Adicionar 10 ul de corante azul de tripano para o mesmo tubo de 1,5 ml para um factor de diluição de 1: 1. </li><li> Agite suavemente o tubo para misturar K562 células e tripan corante azul. </li><li> Permitir K562 corante azul de tripano de células-se a incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Remover 15 mL de células K562 coradas de tubo. </li><li> Pipeta hemocitómetro para contagem de células. </li><li> Contagem de células nas quatro esquinas, bem como o quadrado do meio para um total de cinco quadrados. </li><li> Calcular a contagem de células utilizando a equação: Total de células / ml = Total de células contadas X (fator de diluição / Número de quadrados) X 10.000 / mL </li></ol></li> Ressuspender as células alvo K562 a uma densidade final de 1 x 10 6 culas / ml em meio de cultura IMDM isento de soro. <li> Para células alvo K562 não coradas, adicionar 10 ml de células alvo K562 para um tubo de 15 ml a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml para um total de 10 x 10 6 células K562. Colocar em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 até que esteja pronto para uso. </li><li> Para células alvo K562 DiO manchado, adicionam-se 10 ml de células K562 alvo para um tubo de 15 ml a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml para um total de 10 x 10 6 células K562. <ol><li> Adicionar 1 mL de solução-DiO rotulagem de células por ml de suspensão de células em 15 ml de tubo designada por coloração DiO e suavemente vórtice. Por exemplo, adicionar 10 ul de solução de marcação celular DiO a 10 x 10 6 K562 células / ml num volume de 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Incubar solução K562-DiO durante 20 min a 37 ° C com 5% de CO 2 em um tubo de 15 ml. </li></ol></li><li> Segueing de incubação, adicionar 3 ml de solução salina à temperatura ambiente fosfato tamponada (PBS) a uma solução K562-DiO contendo 15 ml de tubo. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 135 xg à temperatura ambiente. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o pelete de células com uma pipeta de volume ajustável 1000 ul. </li><li> Adicionar 10 ml de IMDM fresco para pellet contendo células 15 mL tubo. </li><li> Suavemente o tubo de vórtice para ressuspender as células. </li><li> Repita os passos 2.7 a 2.10 por mais duas vezes. </li><li> Células de loja em um 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 até que esteja pronto para uso. NOTA: As células podem ser armazenadas no incubador durante até 24 horas, mas é preferível usá-los no mesmo dia. </li></ol> 3. Preparação de Controles <ol><li> Transferir o seguinte em separados e devidamente rotulados tubos de 1,5 ml: <ol><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo ressuspenso DIO-rotulados K562 células para o "Double positiva" rotuladas 1,5 tubo mL. </li><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo novamente suspensas células K562 DIO-etiquetados para a "única dio" rotulados 1,5 tubo mL. </li><li> Adicionar 500 mL de IMDM fresco contendo células K562 não marcadas ressuspendidas em a "iodeto de propídio (PI), apenas" marcado tubo 1,5 mL. </li></ol></li><li> Coloque a ponta positiva Duplo e PI apenas tubos em um 55 ° C banho de água durante 5 minutos. </li><li> Após a 5 min tiver decorrido, remover os tubos e limpe com 70% de etanol. </li><li> Adicionar 10 L de PI ao Duplo positiva e PI apenas 1,5 tubos mL. </li><li> Coloque todos os três controlos de células alvo K562 na incubadora a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Após os 30 min de incubação tiver decorrido, centrifugar os três controlos de células alvo K562 durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender cada controlo com 20 mL de meio fresco cultura de células IMDM, e deixar na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante pelo menos30 min para o sinal DiO óptima. NOTA: Os controles são agora pronto para ser executado através do fluxo de imagem citômetro. </li></ol> 4. NK celular separação automatizada <ol><li> Ligue separador de células e permitir que o ciclo de start-up para terminar. </li><li> Certifique-se de que todas as garrafas iluminações de fluidos são verdes e que o frasco de resíduos está vazio. </li><li> Obter uma temperatura de 15 mL suporte de tubos quarto. NOTA: A seleção é baseado em volumes de amostra. Por exemplo, para um volume de menos do que 3 ml de utilizar um suporte de tubos de 15 ml e para um volume de mais de 3 mL usar um suporte para tubos de 50 mL. </li><li> tubos de amostra de etiqueta em conformidade (Repita por amostra / participante): Participante 1 Whole Amostra de Sangue; Participante 1 fracção negativa; Participante 1 fracção positiva. </li><li> Gentilmente pipeta 1,5 ml de sangue total a partir do Passo 1.2 em "Whole Amostra de Sangue" tubo de 15 mL. </li><li> Coloque 15 ml tubo adequadamente rotulado como "Whole Amostra de Sangue" do Passo 4.5 e rotulado 15 mL "fracção negativa" e"fracção positiva" tubos de Passo 4.4 no suporte de tubos. Utilize suporte de amostras thefollowing set-up: Fileira (R1) A: Whole Amostra de Sangue, Row (R2) B: fração magneticamente marcados positiva,: Negativo, fração não marcado, Row (R4) C. </li><li> Insira o rack separador para o MiniSampler para autolabeling. </li><li> Seleccionar "Reagente" no menu e realçar a posição em que o frasco vai ser colocado na prateleira de separação. </li><li> Selecione "Ler Reagente" para activar o leitor de código 2D. </li><li> Colocar o frasco do reagente apropriado em frente do leitor de código de 2D entre 0,5-2,5 cm da tampa do leitor de código. NOTA: Por exemplo, o reagente necessário para a separação de células NK é CD56. </li><li> Segure frasco de reagente em um ângulo na frente do leitor de código 2D para leitura ideal. </li><li> Colocar o frasco de reagente para a posição adequada cremalheira separador. </li><li> Destacar as posições desejadas na aba Separação na tela. </li><li> No submenu Labeling, atribuir um auprograma tolabeling. </li><li> Atribuir a célula de separação MicroBeads Reagente CD56 para acumular posições 1, 2, 3 e 4. </li><li> Selecione o programa de separação "posselwb". </li><li> Selecione a opção "lavar" programa de lavagem. </li><li> Inserir um volume de amostra de 1.500 mL no submenu "Volume" usando o teclado numérico. </li><li> Selecione a opção "Enter" no teclado. </li><li> Selecione "Executar" para iniciar a separação de células. </li><li> Selecione "OK" para confirmar que tampão suficiente disponível para o processamento de todas as amostras. </li></ol> 5. Contagem de Células NK Separação Após celular <ol><li> Imediatamente após a separação de células com o separador de células, recuperar a fração positiva. Deixe em temperatura ambiente. Esta fracção contém a população de células NK puro desejado. </li><li> Para cada amostra individual, executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro, como por Etapa 2.2. <ol><li> Após os cálculos, registre a contagem de células. </li></ol></li></ol> 6. Ensaio de Citotoxicidade Preparação da Amostra <ol><li> Preparar e rotular tubos de 1,5 ml para cada amostra / participante em conformidade. </li><li> Pipeta desejada proporção de células NK e células K562 DIO-rotulados para cada tubo. NOTA: Por exemplo, a proporção desejada de células alvo K562 e células efectoras NK é de 1: 5. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 135 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender NK-DiO marcado mistura de células K562 em 500? L de meio celular NK sem interleucina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanol (2-ME) (incompleta meios de cultura de células NK). NOTA: O meio de cultura de células NK é incompleta Meio Essencial Mínimo de Eagle com bicarbonato de sódio, sem L-glutamina, ribonucleósidos e desoxiribonucleósidos. </li><li> Adicionar 5 mL de PI a cada tubo. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Após 2 h de incubação, centrifuGE durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 25 ul incompleta meios de cultura celular NK. </li></ol> 7. Preparação de espontânea ( "S") Amostra <ol><li> Pipetar 500 ul de células K562 DIO-marcados (concentração de 1 x 10 6 células / ml) no tubo de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 10 ul de PI de cada um dos tubos. </li><li> tubo de centrifugação durante 2 minutos a 163 x g. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Após 2 h de incubação, centrifuga-se durante 2 min a 163 x g. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 25 ul incompleta Meio Essencial (MEM-α) Meios de cultura de células alfa-mínimos. </li></ol> 8. Aquisição de Dados com imagens de fluxo Citómetro <ol><li> Pressione o botão verde no interior da porta da frente da imagem de citometria de fluxo para ligar o instrumento. </li><li> Ligue all computadores associados com a imagiologia de fluxo FACSCalibur. </li><li> Inicie o fluxo de imagem citômetro software. </li><li> Clique no botão "Iniciar" para limpar o sistema e preparar a linha de amostra. </li><li> Uma vez que o "Startup" estiver concluída, feche a janela "calibrações". </li><li> Atribuir canais: no lado superior esquerdo, clique em cada canal, a fim de atribuir-lhes. </li><li> No lado direito, clique no botão gráfico de dispersão para criar 4 scatterplots: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Comece analisando amostras usando primeiro o controle "Double positiva". <ol><li> Clique em "Load". </li><li> Coloque o tubo de 1,5 ml com a amostra "Double positiva" de Passos 3,4 para 3,9 no carregador de amostra. </li><li> Selecione o objetivo 40X sob a guia "Ampliação". </li><li> Ligue a 405 mW e642 lasers MW. </li><li> Ligue o canal "Brightfield". </li><li> Clique em "Selecionar intensidade." </li><li> Com base na amostra de controlo "Duplo positiva", determinar a intensidade desejada para o laser de 405 mW de modo que o detector não está sobrecarregado. Nota: Por exemplo, a intensidade ideal para este experimento foi fixado em 11 mW. </li></ol></li><li> Após a desejada set-up é conseguido, adquirir dados. <ol><li> Sob a guia "Aquisição Arquivo", digite em um texto nome personalizado. Selecione uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. </li><li> Digite o número de células de adquirir ao lado de "Collect". Tipicamente, este número varia entre 1.000 a 10.000. </li><li> Clique em "Adquirir". NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido, o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol></li><li> Após a aquisição for concluída, carregar a amostra de controlo seguinte - DiO único controle. </li><li> Clique em "Load". </li><li> Coloque o tubo de 1,5 mL com o "único dio" amostra para o carregador de amostra. </li><li> Deixar o objetivo 40X sob a guia "Ampliação" selecionado. </li><li> Deixar o laser 405 mW ligado. </li><li> Desligue a mW laser de 642 e o canal "Brightfield". NOTA: Agora que a desejada configuração foi alcançado, os dados podem ser adquiridos. </li><li> Sob a guia "Arquivo Aquisição", digite em um texto nome personalizado e escolha uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. Digite o número de células de adquirir ao lado de "Collect.". Normalmente este número é de 1.000. </li><li> Clique em "Adquirir". NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol><li> Repita o passo 8,10 para o "único PI" amostra de controlo. As amostras experimentais estão agora prontos para serem recolhidos. </li><li> Lidar com as remaining amostras experimentais, incluindo as "amostras" S "espontânea" da seguinte forma: <ol><li> Deixar o objetivo 40X sob a guia "Ampliação" selecionado. </li><li> Ligue a 405 mW e 642 lasers MW. </li><li> Ligue o canal "Brightfield". </li><li> Clique em "Intensidade Set." </li><li> Sob a guia "Arquivo Aquisição", digite em um texto nome personalizado e escolha uma pasta para salvar o arquivo (s) de dados. Digite em um texto nome personalizado. </li><li> Digite o número de células de adquirir ao lado de "Recolha". </li><li> Clique no botão "Acquire". NOTA: Uma vez que o número desejado de células é adquirido o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente. </li></ol></li><li> Repita o passo 8,12 para todas as amostras experimentais. </li><li> Depois de todos os dados experimentais e arquivos foram recolhidos, clique no botão "Shutdown" para esterilizar o sistema. </li> 9. ImaginAnálise de amostras g Citómetro de fluxo <ol><li> Abra o fluxo de imagiologia citómetro de aplicação de software de análise. </li><li> Em "Arquivo", abra um arquivo .RIF experimental. </li><li> Construir uma nova matriz usando os arquivos .RIF única cor (OID somente controlar e controle somente-PI, criado durante as etapas de 8.10 e 8.11), selecionando "Criar um novo Matrix" sob a guia de Compensação no fluxo de imagens citômetro software. NOTA: O software irá pedir para a seleção dos arquivos de uma só cor e fundi-los para criar um arquivo de matriz (extensão de arquivo .ctm), que está a ser selecionado para aplicar a compensação de canal. </li><li> Criar gráficos de pontos utilizando a função de "blocos de construção" do software. <ol><li> Criar um ponto-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frequência) para a porta do células focalizados. Ligue para o portão "Focus" (Figura 1A). </li><li> Usando o portão "Focus", criar um gráfico de pontos de Bright Área Campo vs Campo brilhante proporção para g comeu as células singlet. Ligue para o portão "Single" (Figura 1B). </li><li> Usando o portão "Single", criar um gráfico de pontos de Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilize este plano para identificar e células dupla positivos (metas, mortos) gate DIO-positiva apenas células (alvos, vivo) e PI-DiO (Figura 1C). NOTA: Todas as parcelas descrito nos passos 9.4.1, 9.4.2 e 9.4.3 podem ser criados usando a função de "blocos de construção" do software. </li></ol></li><li> Clique na função de estatísticas do gráfico de pontos para acessar os números de células de cada portão. </li><li> Calcula-se a percentagem de alvos na amostra mortas espontânea e amostras experimentais utilizando a seguinte fórmula: % alvos mortos na amostra = (alvos #dead x 100) / (# viver alvos + #dead alvos) </li><li> Calcular a citotoxicidade utilizando a seguinte fórmula: % Citotoxicidade = [(Experimental mortos mortos-espontânea) / (morto 100 espontânea)] x100 </li></ol>_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg"> Figura 1: histogramas representativos, gráficos de dispersão e imagens para análise da atividade citotóxica. Análise (A) células foco. (B) Análise única célula. Análise (C) coloração das células alvo. Todas as determinações são feitas usando a imagem anexada para cada evento. Isso pode ser acessado no software de análise, basta clicar sobre o evento nos gráficos. (D) imagem representativa de um evento de gibão, mostrando uma célula NK apoptótica e um alvo K562 ao vivo. Ch01, Brightfield. CH02, a DIO. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método descrito neste estudo mede directamente a actividade específica de células NK de um indivíduo em resposta a estímulos (neste caso particular, o exercício prolongado). Tipicamente, as células NK são isolados a partir de um do sangue utilizando um gradiente de densidade ou de triagem de células, usando uma combinação de marcadores. Embora estes métodos sejam largamente usadas, elas têm muitas desvantagens: eles são morosos, envolvem manipulações múltiplas, e dependem fortemente do usuário. Como resultado, a tensã...

células assassinas naturais são um elemento essencial do sistema imune inato. Embora eles são muito regulado, eles têm a capacidade de reconhecer e eliminar células anormais através de contacto célula-a-célula e sem activação prévia 1. Como tal, eles formam uma linha rápida de defesa contra as infecções. O exercício, especialmente intensa, tem sido demonstrado para deprimir o sistema imunitário de forma transiente 2, 3, 4, 5. As células NK são particularmente propensos para este efeito 4, 6, 7, de forma eficaz criar uma janela de aumento da sensibilidade à doença. Assim, o estudo de intervenções antes, durante ou após o exercício intenso com o objetivo de reduzir o seu impacto sobre a função das células NK é de particular interesse para o bem-estar dos atletas pós-competições. 8, a cerca de 1% do compartimento de células brancas do sangue; 2) As células NK são muito sensíveis ao stress e dependem de exposição constante a condições fisiológicas para permanecer viável e estável no decurso da experimentação; e 3) ensaios padrão para determinar a citotoxicidade das células NK, como Ficoll gradientes 9 e solte ensaios de 10, não são confiáveis e inconsistente. A variabilidade inerente de amostras humanas único composto estas questões. amostras humanas frescas colhidas durante as intervenções são bastante regulamentado e difícil de obter, pelo menos, quando comparado com as amostras de animais ou linhas celulares imortalizadas. Isso reduz as oportunidades para repetir experiências ou adicionar participantes para o estudo de coorte para alcançar limiares estatísticos significativos. Coletivamente, estas questões apoiar a necessidade de um protocolo simplificado que permite foR tanto de alto rendimento e uma análise de alta fiabilidade da actividade lítica de células NK em amostras humanas. Nós estabelecemos um fluxo de trabalho que encurta o tempo necessário para identificar, isolar e células NK teste de sangue total humano, minimizando a exposição a factores externos. O método de optimizar o uso de dois instrumentos, um separador magnético à base de células e um fluxo de imagens citómetro, e, um T específica optimizado-ensaio: razão E para permitir a detecção das diminuições ou aumentos de citotoxicidade de células NK.

<table><tbody><tr><td>Linfoblastos K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Dulbecco Modificado de Iscove</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>Glicose alta, com L-Glutamina, com HEPES, Meio Essencial Mínimo Alfa Filtrado Estéril</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Sem ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos, mas com 2 mM de L-glutamina e 1,5 g/L de bicarbonato de sódio</td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano 0,4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração de iodeto de Propridium</td> de grau de cultura de tecidos <td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Solução de marcação de células Vybranto DiO</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>tampão de lavagem autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>colunas autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Sangue total CD56 MicroBeads, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Citômetro de fluxo de imagem</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0,4-0,7% de hipoclorito (esterilizador)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% de isopropanol (debubbler)</td><td>EMD Millipore</td><td>1,3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (fluido da bainha)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>Sem cálcio ou magnésio</td></tr><tr><td>Software INSPIRE</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Versão Mark II, setembro de 2013</td></tr><tr><td>Ideas Software Aplicativo</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Versão 6.1, Julho 2014</td></tr></tbody></table>

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

a citotoxicidade das células NK é uma medida utilizada para determinar o efeito de uma intervenção externa sobre a função da célula NK. No entanto, a precisão e reprodutibilidade deste ensaio pode ser considerado instável, quer devido a erros do utilizador ou por causa da sensibilidade das células NK para manipulação experimental. Para eliminar estes problemas, um fluxo de trabalho que eles se reduz a um mínimo foi estabelecida e é apresentada aqui. Para ilustrar, obtivemos amostras de sangue, em vários momentos, desde corredores (n = 4), que foram submetidos a uma intensa sessão de exercício. Primeiro, as células NK são simultaneamente identificados e isolados através de marcação de CD56 e de triagem magnética baseada, directamente a partir de sangue inteiro e de tão pouco como um mililitro. As células NK são ordenados removido de quaisquer anticorpos de reagentes ou de nivelamento. Eles podem ser contados, a fim de estabelecer uma contagem de células NK precisa por mililitro de sangue. Em segundo lugar, as células NK (células efectoras ordenados ou E) pode ser misturado com 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) marcaram células K562 (células alvo ou T) a um ensaio-óptima de 1: 5 razão T: E, e analisadas usando um imaging fluxo-citómetro que permite a visualização de cada evento e a eliminação de qualquer falsa positiva ou falsos negativos (como doublets ou células efetoras). Este fluxo de trabalho pode ser completada em cerca de 4 h, e permite a resultados muito estáveis ​​mesmo quando se trabalha com amostras humanas. Quando disponíveis, as equipes de pesquisa pode testar várias intervenções experimentais em seres humanos, e comparar as medidas em toda a vários pontos de tempo, sem comprometer a integridade dos dados.

Determinação do número de células NK O efeito de funcionamento pesado na contagem de células NK no sangue total foi medida, utilizando o protocolo de exercício descrito na Figura 2. Amostras de sangue foram colhidas antes do exercício, imediatamente após o exercício, 1,5 h após o exercício, e, finalmente, 24 e 48 h após a coleta de sangue inicial. A concentração de células NK por mililitro de sangue total foi medido para cada corredor (Figura 3A) e,...

Este trabalho descreve um fluxo de trabalho avançado para a determinação precisa e rápida da contagem de células NK (Natural Killer) e citotoxicidade de células NK em amostras de sangue humano.

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NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

O objetivo geral deste experimento é determinar a contagem de células NK e os níveis de ativação citotóxica em uma amostra de sangue total humano de maneira rápida, confiável e estável. Este método pode ajudar a responder a perguntas nos campos imunológicos, como: Quais são os efeitos de intervenções externas na bioatividade das células NK? A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida e precisa, Embora ainda forneça resultados reproduzíveis em todos os experimentos.Para isolar as células NK do sangue total humano, coloque primeiro os tubos de 15 mililitros rotulados como amostra de sangue total, fração negativa e fração positiva nas posições apropriadas no rack do tubo separador de células. Quando todos os tubos estiverem carregados, insira o rack separador no mini-sampler para rotulagem automática e selecione Reagente no menu, para destacar a posição onde o frasco será colocado no rack. Selecione Ler reagente para ativar o leitor de código 2D e segure o frasco de reagente apropriado na frente do leitor de código 2D em um ângulo de 0.5 a 2.5 centímetros da tampa do leitor de código.Coloque o frasco de leitura na posição apropriada do rack separador. Em seguida, na guia Separação, realce as posições desejadas. Em seguida, abra o submenu Rotulagem e selecione um programa de rotulagem automática.Atribua as microesferas do reagente de separação de células às posições 1, 2, 3 e 4 do rack. E selecione o programa de separação Posselwb. Selecione o programa Lavagem com enxágue.Insira 1500 microlitros para o Volume de amostra no submenu Volume e pressione Enter. Em seguida, clique em Executar para iniciar a separação das células. Clicar em ok para confirmar se há buffer suficiente disponível para processar todas as amostras.Para preparar uma amostra de ensaio de citotoxicidade, primeiro, rotule tubos de 1,5 mililitro para cada amostra e/ou participante, conforme apropriado, e canalize a proporção desejada de células NK e células K562 marcadas com DIO em cada tubo. Recolha as células por centrifugação e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o grânulo celular. Em seguida, ressuspenda a mistura de células em 500 microlitros de meio celular NK incompleto e rotule as células em cada tubo com 5 microlitros de iodeto de propídio.Colete as células por meio de outra centrifugação e incube a cultura de descarte a 37 graus Celsius por duas horas. No final da incubação, centrifugue as células nas mesmas condições de centrífuga e ressuspenda o pellet em 25 microlitros de meio de cultura de células NK incompleto fresco. Para analisar as células por citometria de fluxo, primeiro clique no botão de inicialização no software do citômetro de fluxo de imagem para lavar o sistema.Em seguida, clique no botão de gráfico de dispersão para criar quatro gráficos de dispersão e carregue o tubo de controle positivo duplo. Usando a amostra de controle duplo positivo, determine a intensidade desejada para o laser de 405 miliwatts, para que o detector não fique sobrecarregado, e ajuste o gerador de imagens para adquirir o número apropriado de contagens de células. Definir o laser de 405 miliwatts em uma intensidade adequada para a detecção de DIO e PI exigirá experiência com ambos os corantes e a faixa de detecção do citômetro de fluxo.Após a aquisição da amostra de controle positivo duplo, carregue a amostra de controle somente DIO, selecione a objetiva 40X e desligue o laser de 642 miliwatts e o canal Brightfield. Reproduzir o número adequado de células e repetir a aquisição para a amostra exclusiva de iodeto de propídio. Quando todas as amostras de controle tiverem sido executadas, ligue o laser de 405 miliwatts e o canal Campo claro novamente e clique em Definir intensidade.Em seguida, na guia Aquisição de arquivo, insira um nome de arquivo personalizado e selecione uma pasta para salvar os arquivos de dados. Em seguida, insira o número de células a serem adquiridas. Carregue o primeiro tubo de amostra experimental e clique no botão Adquirir.Quando todas as amostras tiverem sido executadas, abra o aplicativo de software de análise de citômetro de fluxo de imagem e abra um único arquivo RIF experimental. Na guia de compensação, selecione Criar nova matriz. O software solicitará a seleção dos arquivos de cor única e os mesclará para criar um arquivo de matriz a ser selecionado para aplicar a compensação de canal.Use a função Building Blocks para configurar os gráficos de pontos apropriados. Em seguida, clique na função de estatísticas para acessar os números das células em cada portão. Neste experimento representativo, amostras de sangue foram coletadas conforme indicado e a concentração de células NK por mililitro de sangue total foi medida para cada corredor e, em média, para cada ponto de tempo.Três em cada quatro corredores apresentaram um ligeiro aumento semelhante na contagem de células NK após o exercício. Imediatamente seguido por uma diminuição acentuada, antes de retornar lentamente ao normal, 24 a 48 horas após o término do evento. Em média, a contagem de células NK diminuiu 1,5 horas após o exercício, mas voltou a níveis quase normais após 24 horas.Após o cálculo da contagem de células, a atividade citotóxica das células NK foi imediatamente analisada como acabamos de demonstrar, com uma diminuição média na citotoxicidade das células NK imediatamente, e 1,5 horas após o término do evento de exercício, que aumentou significativamente em 24 horas após o exercício. A citotoxicidade NK manteve-se elevada em relação aos níveis pré-exercício, embora de forma não significativa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de quatro horas quando executada corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter e caracterizar a contagem de células NK e a atividade citotóxica de amostras de sangue humano de maneira hidrópica reprodutível.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a atividade lítica das células natural killer contra as células-alvo coradas com fluorescência. O método permite a medição da citotoxicidade induzida por células NK colorindo células mortas e usando um citômetro de fluxo para quantificar células-alvo vivas e mortas.

Preparação de amostra de ensaio de citotoxicidade mediada por células natural killer para análise de citometria de fluxo

Este vídeo demonstra a realização de um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para determinar a citotoxicidade das células natural killer (NK) contra as células cancerígenas alvo. O ensaio quantifica a liberação da enzima lactato desidrogenase citoplasmática das células cancerígenas, medindo a absorbância do produto de cor vermelha formado.

Um ensaio in vitro para avaliar a citotoxicidade de células assassinas naturais contra células cancerígenas

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

A erradicação mediada por células por células cancerígenas é importante para a iniciação e progressão do câncer. Aqui, apresentamos dois protocolos não baseados em radioatividade para avaliar a citotoxicidade mediada por célulank em relação às células tumorais hepáticas. Além disso, um terceiro protocolo é apresentado para analisar a migração de células NK.

Medição da Citotoxicidade e Migração Mediadas por Células Assassinas Naturais no Contexto das Células Tumorais Hepáticas

Um protocolo para estudar eventos orientados pela FcγRIIIa por anticorpos terapêuticos em células assassinas naturais humanas é descrito aqui. Esta plataforma de estimulação artificial permite o interrogatório de funções de efeitos a jusante, como degranulação, produção de quimiocina/citocina, e caminhos de sinalização mediados pelas porções fcγriiia e fc de anticorpos envolvidos na vinculação.

Avaliação de Eventos celulares assassinos naturais humanos impulsionados pelo engajamento da FcγRIIIa na presença de anticorpos terapêuticos

Neste artigo, descrevemos um método para medir a glicólise e a respiração mitocondrial em células primárias do Assassino Natural (NK) humanas isoladas do sangue periférico, em repouso ou após a ativação induzida pelo IL15. O protocolo descrito poderia ser facilmente estendido para células NK humanas primárias ativadas por outras citocinas ou estímulos solúveis.

Análise do Metabolismo celular assassino natural humano

Este protocolo descreve um método sem rótulo para a análise rápida de uma única célula da contagem e atividade de células natural killer (NK) usando a tecnologia de imagem de sombra sem lente. Este método quantifica as mudanças morfológicas em células NK individuais por meio de análise computadorizada de seus padrões de difração.

Plataforma de imagem sem lentes implantável em campo para análise rápida e sem rótulos da ativação de células assassinas naturais

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho padronizado in vitro. para medição consistente da citotoxicidade natural, mediada pelo receptor de antígeno quimérico e dependente de anticorpos de células humanas natural killer, utilizando imagens de células vivas e citometria de fluxo.

Quantificação da citotoxicidade de células NK potenciada por receptores de antígeno quiméricos e anticorpos terapêuticos usando imagem de células vivas e citometria de fluxo

Aprenda a determinar a contagem e a citotoxicidade de células NK em amostras de sangue total humano usando citometria de fluxo. Este método rápido e reprodutível apoia pesquisas imunológicas e estudos de intervenções terapêuticas.

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