Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

O objetivo geral deste experimento é determinar a contagem de células NK e os níveis de ativação citotóxica em uma amostra de sangue total humano de maneira rápida, confiável e estável. Este método pode ajudar a responder a perguntas nos campos imunológicos, como: Quais são os efeitos de intervenções externas na bioatividade das células NK? A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida e precisa, Embora ainda forneça resultados reproduzíveis em todos os experimentos.

Para isolar as células NK do sangue total humano, coloque primeiro os tubos de 15 mililitros rotulados como amostra de sangue total, fração negativa e fração positiva nas posições apropriadas no rack do tubo separador de células. Quando todos os tubos estiverem carregados, insira o rack separador no mini-sampler para rotulagem automática e selecione Reagente no menu, para destacar a posição onde o frasco será colocado no rack. Selecione Ler reagente para ativar o leitor de código 2D e segure o frasco de reagente apropriado na frente do leitor de código 2D em um ângulo de 0.5 a 2.5 centímetros da tampa do leitor de código.

Coloque o frasco de leitura na posição apropriada do rack separador. Em seguida, na guia Separação, realce as posições desejadas. Em seguida, abra o submenu Rotulagem e selecione um programa de rotulagem automática.

Atribua as microesferas do reagente de separação de células às posições 1, 2, 3 e 4 do rack. E selecione o programa de separação Posselwb. Selecione o programa Lavagem com enxágue.

Insira 1500 microlitros para o Volume de amostra no submenu Volume e pressione Enter. Em seguida, clique em Executar para iniciar a separação das células. Clicar em ok para confirmar se há buffer suficiente disponível para processar todas as amostras.

Para preparar uma amostra de ensaio de citotoxicidade, primeiro, rotule tubos de 1,5 mililitro para cada amostra e/ou participante, conforme apropriado, e canalize a proporção desejada de células NK e células K562 marcadas com DIO em cada tubo. Recolha as células por centrifugação e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o grânulo celular. Em seguida, ressuspenda a mistura de células em 500 microlitros de meio celular NK incompleto e rotule as células em cada tubo com 5 microlitros de iodeto de propídio.

Colete as células por meio de outra centrifugação e incube a cultura de descarte a 37 graus Celsius por duas horas. No final da incubação, centrifugue as células nas mesmas condições de centrífuga e ressuspenda o pellet em 25 microlitros de meio de cultura de células NK incompleto fresco. Para analisar as células por citometria de fluxo, primeiro clique no botão de inicialização no software do citômetro de fluxo de imagem para lavar o sistema.

Em seguida, clique no botão de gráfico de dispersão para criar quatro gráficos de dispersão e carregue o tubo de controle positivo duplo. Usando a amostra de controle duplo positivo, determine a intensidade desejada para o laser de 405 miliwatts, para que o detector não fique sobrecarregado, e ajuste o gerador de imagens para adquirir o número apropriado de contagens de células. Definir o laser de 405 miliwatts em uma intensidade adequada para a detecção de DIO e PI exigirá experiência com ambos os corantes e a faixa de detecção do citômetro de fluxo.

Após a aquisição da amostra de controle positivo duplo, carregue a amostra de controle somente DIO, selecione a objetiva 40X e desligue o laser de 642 miliwatts e o canal Brightfield. Reproduzir o número adequado de células e repetir a aquisição para a amostra exclusiva de iodeto de propídio. Quando todas as amostras de controle tiverem sido executadas, ligue o laser de 405 miliwatts e o canal Campo claro novamente e clique em Definir intensidade.

Em seguida, na guia Aquisição de arquivo, insira um nome de arquivo personalizado e selecione uma pasta para salvar os arquivos de dados. Em seguida, insira o número de células a serem adquiridas. Carregue o primeiro tubo de amostra experimental e clique no botão Adquirir.

Quando todas as amostras tiverem sido executadas, abra o aplicativo de software de análise de citômetro de fluxo de imagem e abra um único arquivo RIF experimental. Na guia de compensação, selecione Criar nova matriz. O software solicitará a seleção dos arquivos de cor única e os mesclará para criar um arquivo de matriz a ser selecionado para aplicar a compensação de canal.

Use a função Building Blocks para configurar os gráficos de pontos apropriados. Em seguida, clique na função de estatísticas para acessar os números das células em cada portão. Neste experimento representativo, amostras de sangue foram coletadas conforme indicado e a concentração de células NK por mililitro de sangue total foi medida para cada corredor e, em média, para cada ponto de tempo.

Três em cada quatro corredores apresentaram um ligeiro aumento semelhante na contagem de células NK após o exercício. Imediatamente seguido por uma diminuição acentuada, antes de retornar lentamente ao normal, 24 a 48 horas após o término do evento. Em média, a contagem de células NK diminuiu 1,5 horas após o exercício, mas voltou a níveis quase normais após 24 horas.

Após o cálculo da contagem de células, a atividade citotóxica das células NK foi imediatamente analisada como acabamos de demonstrar, com uma diminuição média na citotoxicidade das células NK imediatamente, e 1,5 horas após o término do evento de exercício, que aumentou significativamente em 24 horas após o exercício. A citotoxicidade NK manteve-se elevada em relação aos níveis pré-exercício, embora de forma não significativa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de quatro horas quando executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter e caracterizar a contagem de células NK e a atividade citotóxica de amostras de sangue humano de maneira hidrópica reprodutível.