Name: Utilizando tecnologia de impressão 3D para mesclar MRI com Histologia: Um protocolo para o Cérebro Seccionamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Aprenda a alinhar imagens de ressonância magnética com seções histológicas usando suportes cerebrais personalizados impressos em 3D. Este protocolo computacional melhora a correlação radiológica-histopatológica em neuroimagem.

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O Programa de Pesquisa Intramural do NINDS apoiou este estudo. Agradecemos ao NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. Agradecemos a Jennifer Lefeuvre e Cecil Chern-Chyi Yen pela assistência na aquisição de ressonância magnética post-mortem. Agradecemos a John Ostuni e à Seção de Instrumentação pela assistência com a impressão 3D. A Figura 1 deste trabalho utilizou snapshots do MeshLab, ferramenta desenvolvida com o apoio do projeto 3D-CoForm.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo descrito aqui permite uma comparação precisa entre a RM e cortes histológicos. O protocolo é apresentada num formato unificado que pode ser aplicado aos cérebros de seres humanos ou animais pequenos, tais como saguis ou roedores. Diferenças específicas para grande (humano) e pequenas (primatas não humanos e roedores) cérebros são destacadas, e no vídeo e figuras de acompanhamento, demonstramos a aplicação no sagüi. Embora a abordagem é simples, o método requer muitos passos, bem como a utilização de vários tipos de software. Além disso, várias questões que possam afectar a precisão deste método é importante mencionar. A qualidade de imagem da ressonância magnética in vivo é um fator importante. Para minimizar a disparidade na resolução da imagem entre a RM e imagens histológicas digitalizadas, deve ser usado o menor tamanho possível MRI voxel. Este conceito também se aplica à qualidade de imagem da ressonância magnética pós-morte. Embora o aumentotempo de aquisição em MRI postmortem permite muito maior resolução de imagem, a preparação pode introduzir artefatos de imagem, tais como quedas de sinal focais relacionadas com bolhas de ar. Estes artefactos podem obscurecer as áreas do tecido, bem como afectar o seu contorno. Além disso, as dimensões do tecido sobre a TMA post mortem não são susceptíveis de ser afectadas pelo processo de fixação e a duração. Enquanto a in vivo para ex vivo MRI jogo pode estar intimamente aproximada utilizando marcos anatômicos em configuração geometria fatia durante a aquisição, o registro não-linear ainda seria necessário para chegar a um maior grau de precisão em combinar essas duas imagens de ressonância magnética. O desenho do suporte do cérebro e slicer é também um passo crucial. Na criação do modelo digital de cérebro, um algoritmo de suavização é aplicado que aumenta ligeiramente do modelo em relação ao cérebro fixo. Isso permite a fácil inserção do cérebro em seu suporte e slicer e reduz bordas afiadas no titular &amp;# 39; s de contorno. No entanto, se o modelo é muito grande (por exemplo, por mais de 5%), o cérebro pode mover-se durante a MRI pós-morte e / ou o corte. Outro ponto importante é o de adaptar a concepção do modelo de cérebro de modo a que o cerebelo é adequadamente colocada no interior do objecto 3D impressa. Isto pode ser particularmente desafiador quando o cerebelo foi danificado durante a extração cerebral na autópsia. Ao imprimir o cortador de cérebro e titular, o tipo de impressora 3D também deve ser escolhida com cuidado. Algumas impressoras multi-jet necessitam de pós-processamento utilizando um forno para remover o material de apoio. Embora estas impressoras podem produzir objectos que são à prova de água e relativamente mais durável do que a área de trabalho fundido modelagem por deposição em impressoras (FDM), o processo de aquecimento para remover suportes podem deformar ligeiramente a caixa, criando intervalos de lâminas que não são perfeitamente perpendicular ao contorno cérebro. O processo de corte do cérebro é mais um passo crucial. Antes th cortee cérebro inteiro em lajes, é importante ter a certeza que o cérebro está sentado firmemente dentro do cortador de cérebro: não deve haver movimento quando ligeira pressão é aplicada sobre o cérebro. Isto tornará possível para as lâminas para cortar o cérebro na localização precisa definir pelos investigadores. Uma pressão contínua, equilibrada deve ser aplicada a ambos os suportes de lâmina durante o corte. Dependendo da nitidez das lâminas e a rigidez do tecido, um ligeiro movimento de corte transversal pode ser vantajosa para a manutenção da superfície de corte plana. O processo de incorporação de parafina pode também ser uma fonte de desalinhamento entre RM e histologia. Se a laje de tecido não está sentado plana contra a caixa durante o processo de incorporação, haverá uma inclinação entre o plano de corte do micrótomo e o local da superfície da laje. Isto irá exigir o corte secções inutilizáveis ​​para encontrar uma superfície plana em que todo o tecido é exposto. Uma maneira de corrigir a inclinaçãoé mudando o ângulo do plano de visualização na MRI postmortem high-isotrópico-resolução. No entanto, isso é quase impossível de executar no in vivo ressonância magnética que é geralmente adquirida com a resolução anisotrópica (tipicamente grossas cortes coronais). Finalmente, o tecido pode experimentar alguma deformação durante o período de formalina e embebidos em parafina de fixação (encolhimento), bem como durante a preparação das lâminas (dobráveis, rachaduras, rugas). Algumas destas deformações pode ser corrigida com a colocação das secções de 4-5 ^ M, num banho de água antes de transferir em lâminas. Outras deformações pode ser parcialmente resolvido através da realização de coregistration imagem deformável das imagens digitalizadas histológicas para as imagens de ressonância magnética pós-morte. No entanto, minimizando as deformações com a prática cuidadosa e hábil é a abordagem mais eficaz para combinar volumes de ressonância magnética para histologia seções. Em conclusão, a metodologia aqui apresentada permite investigators para avaliar com precisão a patologia subjacente dos resultados de MRI. Em termos mais gerais, é uma abordagem promissora para a identificação e / ou validação de novos biomarcadores de ressonância magnética para estudos de investigação que visam processos patológicos específicos, tais como inflamação ou remielinização.

A ressonância magnética in vivo fornece uma medida não invasiva e sensível da integridade do tecido no nível macroscópico. As alterações na intensidade do sinal de ressonância magnética observadas in vivo são medidas de resultado em muitos ensaios clínicos em andamento. 1 Embora as mudanças de intensidade observadas na ressonância magnética possam identificar áreas de anormalidade no contexto de todo o cérebro, elas geralmente não são suficientemente específicas para diferenciar processos patológicos. Isso é especialmente verdadeiro para processos dinâmicos envolvendo múltiplas patologias. Por exemplo, na esclerose múltipla (EM) ou em seu modelo animal, encefalomielite autoimune experimental (EAE), inflamação, edema, degradação da mielina, destruição axonal, gliose e morte neuronal se sobrepõem. 2, 3 Para obter a especificidade necessária em relação à patologia subjacente, deve-se levar em consideração o contexto, juntamente com o conhecimento da histologia dos tecidos anormais identificados pela RM.
No entanto, mesmo em experimentos com animais bem controlados, combinar histologia com ressonância magnética in vivo é fundamentalmente desafiador por vários motivos. Primeiro, a diferença nas escalas dimensionais entre as seções histológicas e a ressonância magnética é de várias ordens de magnitude. 4 Em segundo lugar, para uma comparação adequada, a orientação do plano de corte da ressonância magnética deve corresponder ao plano de secção do tecido cerebral quando cortado. Devido à forma do cérebro, é muito difícil fazer cortes consistentemente retos e precisos quando o cérebro está sentado em uma superfície plana. Terceiro, o grande tamanho do cérebro em relação a uma área de interesse potencialmente pequena (lesão, tumor, etc.) cria um cenário de "agulha no palheiro" para o patologista que processa o tecido. Quarto, mesmo quando o tecido-alvo é encontrado, ele é comumente processado de forma a tornar virtualmente impossível uma associação com os dados originais da ressonância magnética. Finalmente, a secção patológica tradicional do tecido cerebral é muitas vezes imprecisa e inconsistente, complicando ainda mais a comparação entre as seções histológicas e as imagens de ressonância magnética. 
 Tentativas anteriores de superar esses desafios dependiam do uso de algoritmos deformacionais para co-registrar os dados e/ou colocar marcadores fiduciais dentro ou ao redor do tecido como referência. 5, 6, 7, 8 A primeira abordagem requer modelos computacionais complexos que são particularmente suscetíveis a complicações devido à formatação de dados, artefatos de imagem e alterações causadas pelo processamento de tecidos. 4 Por outro lado, a última abordagem introduz a possibilidade de contaminar ou danificar o próprio tecido. 9
A abordagem descrita aqui melhora a transição entre as modalidades por meio do uso de ressonância magnética post-mortem para preencher a lacuna entre a ressonância magnética in vivo e a histologia. A ressonância magnética post-mortem fornece imagens tridimensionais (3D) do cérebro em resolução mais alta do que pode ser alcançada in vivo e, além disso, fornece os dados necessários para produzir um modelo morfologicamente preciso da superfície cerebral. Este modelo digital pode então ser usado para criar um suporte personalizado impresso em 3D para o cérebro. Com um posicionamento cuidadoso, o suporte do cérebro permite um seccionamento cerebral preciso e orientado para a ressonância magnética, reduzindo a necessidade de algoritmos matemáticos complexos e permite um foco em regiões específicas para amostragem direcionada. 
Nosso laboratório introduziu recentemente novos métodos para criar suportes e fatiadores de cérebro personalizados usando ressonância magnética post-mortem e tecnologia de impressão 3D para cérebros humanosde 10 e saguis. 4 Os dois métodos permitem uma correlação mais precisa entre ressonância magnética e histologia em um ambiente de pesquisa e, em última análise, permitem uma compreensão mais profunda da patologia específica subjacente às anormalidades da ressonância magnética. Experimentos cuidadosamente planejados, nos quais o cérebro é amostrado repetidamente ao longo do tempo in vivo, podem fornecer contexto para a interpretação da patologia, o que, por sua vez, pode adicionar especificidade à interpretação da ressonância magnética. Aqui, apresentamos um protocolo modificado em uma estrutura unificada que pode ser aplicado a qualquer tecido cerebral, seja derivado de primatas não humanos, roedores ou humanos. Fornecemos instruções detalhadas e um vídeo correspondente para o seccionamento do sagui. Embora o protocolo geral se aplique a qualquer tipo de cérebro, devido às diferenças na aquisição de ressonância magnética e no tamanho do tecido, bem como aos desafios encontrados ao lidar com tipos específicos de cérebro, existem algumas diferenças na abordagem, dependendo do tipo de cérebro que está sendo processado. Nesta apresentação, as seções com "humano" denotarão diferenças no protocolo específico do cérebro humano.

<table><tbody><tr><td>7T / 30cm USR AVIII Bruker MRI</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>38 mm Bruker Biospin bobina de volume</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fomblin</td><td>Solvay Solexis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos de centrífuga Falcon, polipropileno, estéril</td><td>Corning</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gaze Fisherbrand Fisher</td><td>Scientrific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Filme de Laboratório Parafilm M All-Purpose</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica RM2235 micrótomo rotativo&nbsp;</td>Lâminas Descartáveis <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica, perfil baixo (819)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato Violeta Cresyl, 0.1%</td><td>Microscopia Eletrônica</td> Aquosa Sciences <td>26089-01</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue, 0.1% em 95% Álcool</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>26056-15</td><td></td></tr><tr><td>ETOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2 Extended&nbsp;</td><td>Ultimaker.75</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kg Oficial Ultimaker Branded PLA&nbsp; Filamento, 2,85 mm, Prateado</td><td>Metálico Ultimaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 (Blue Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Netfabb Professional 5.0.1</td><td>Netfabb</td><td>http://www.netfabb.com/professional.php</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer 10.9.332</td><td>Autodesk</td><td>http://www.meshmixer.com/download.html</td><td></td></tr><tr><td>Mipav 7.2</td><td>NIH CIT</td><td>http://mipav.cit.nih.edu</td><td></td></tr><tr><td>Cura</td><td>Ultimaker</td><td>https://ultimaker.com/en/products/cura-software</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando tecnologia de impressão 3d para mesclar mri com histologia: um protocolo para o cérebro seccionamento

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

A ressonância magnética (MRI) permite o delineamento entre tecido normal e anormal em escala macroscópica, amostrando um volume de tecido inteiro tridimensionalmente. Embora a ressonância magnética seja uma ferramenta extremamente sensível para detectar anormalidades teciduais, a associação de alterações de sinal com um processo patológico subjacente geralmente não é direta. No sistema nervoso central, por exemplo, inflamação, desmielinização, dano axonal, gliose e morte neuronal podem induzir achados semelhantes na ressonância magnética. Como tal, a interpretação dos exames de RM depende do contexto e, portanto, a correlação radiológico-histopatológica é de extrema importância. Infelizmente, a secção patológica tradicional do tecido cerebral é muitas vezes imprecisa e inconsistente, complicando assim a comparação entre as seções histológicas e a ressonância magnética. Este artigo apresenta uma nova metodologia para seccionar com precisão os tecidos cerebrais de primatas e, assim, permitir uma correspondência precisa entre histologia e ressonância magnética. O protocolo detalhado descrito neste artigo ajudará os investigadores a aplicar esse método, que se baseia na criação de fatiadores cerebrais impressos em 3D. Ligeiramente modificado, pode ser facilmente implementado para cérebros de outras espécies, incluindo humanos.

O fluxo de trabalho deste método é resumido na Figura 1. Uma vez que o cérebro está cortado, uma comparação visual entre as imagens de RM e imagens das superfícies superficiais das lajes mostra um bom jogo orientação através de múltiplas placas (Figura 2). Depois de as placas são embebidos em parafina, seccionados que estão num micrótomo e coradas. Uma comparação mais aprofundada entre a alta resolução post-mortem de ressonância magnética e os cortes histológicos corados demonstra uma correspondência precisa e consistente entre todas as estruturas do cérebro de saguim (Figura 3). Neste modelo animal de MS, os animais desenvolvem lesões de substância branca espalhados por toda a substância branca cerebral. Estas lesões podem ser detectados de forma não invasiva através da realização de ressonância magnética. A Figura 4 demonstra a capacidade desta técnica para elucidar o substrato patológico dos resultados de MRI. Pequenas lesões detectadas na ressonância magnética in vivo podeser rastreados em ambos postmortem ressonância magnética e histologia. Tal como mostrado nas inserções, desmielinização no interior das lesões é um dos principais componentes que promovem a mudança do sinal de RM (hiperintensidade comparação com o tecido circundante). A histologia e postmortem MRI também pode mostrar lesões perdidas em in vivo ressonância magnética (Figura 4). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxo de trabalho para a criação de uma caixa de cortador de sagüi cérebro. O cérebro é fixado com formalina (A1) e uma ressonância magnética ponderadas em T2 é adquirido com voxels isotrópicos de 150 um por aresta (A2). As imagens são processadas e thresholded para criar uma máscara binária (A3). A superfície é então processado em software de modelagem 3D (A4). A subtração booleana entre um modelo de cortador eo modelo de cérebro cria um modelo digital do cortador de cérebro (B1). A caixa de cortador de cérebro é impresso em uma impressora 3D (B2). O cérebro é então colocado firmemente na caixa de cortador decorte (B3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig2.jpg" /> Figura 2. Da esquerda para a direita: In vivo ressonância magnética, postmortem MRI, ea fotografia de placas de tecido. Cortando aviões foram estabelecidas com base na autópsia ressonância magnética (B) e visualmente em comparação com o correspondente ressonância magnética in vivo fatia (A). O cérebro foi então cortado, e as placas resultantes foram encontrados para ser consistente (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig3.jpg" /> Figura 3. De alta resolução MRI postmortem e histologiaseção correspondente. Placas foram embebidas em parafina, cortadas com um micrótomo para 4 uM secções e coradas com violeta rápido de cresilo e azul (B). As secções foram então visualmente combinado com T2 100 uM * ressonância magnética ponderadas com base em estruturas cerebrais (A). Detalhes para adquirir esta imagem estão na seção complementar do protocolo e Tabela 1. As estruturas cerebrais: (1) seta vermelha = cápsula interna, seta azul = comissura anterior; (2) seta vermelha = putâmen, seta azul = trato óptico; (3) seta vermelha = caudado, seta azul = hipocampo; (4) seta vermelha = corpo caloso, seta azul = aqueduto cerebral; (5) seta vermelha = colículo inferior, seta azul = trato piramidal. A caixa a tracejado na B1 indica uma fatia sempre que, durante o corte do cérebro ou inclusão em parafina, um erro causou uma ligeira rotação em torno do eixo Y, levando a incompatibilidade da comissura anterior do lado esquerdo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma</a>versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig4.jpg" /> Figura 4. Seguimento lesões de MRI in vivo para a seção de histologia. A in vivo MRI não mostraram nenhuma evidência convincente de hipersinal anormal para sugerir lesões em qualquer trato óptico (A1). No entanto, a alta MRI resolução postmortem mostra claros intensos linhas hiper em ambas as vias ópticas (A2). A mancha azul violeta / cresyl rápida de uma seção histologia 4 mm mostra que as áreas hiperintensas visto na ex vivo MRI são desmielinização (A3). Na substância branca cerebral, in vivo MRI mostra hiperintensidade sutil bilateralmente (B1, ampliado nas inserções). As áreas hipertensas são mais evidentes no postmortem MRI (B2) de alta resolução. A mancha LFB de uma seção histologia 4 mm mostra que estas áreas são de desmielinização (B3). Após a comparação com a linha de base in vivo ressonância magnética e uma mancha hemotoxilina-and-eosina, o lado direito foi determinado para ser uma anormalidade anatômica, não uma lesão demyelinated. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="arquivos de código suplementares" src="/files/ftp_upload/54780/54780supplementalfiles.jpg" /> Arquivos de código suplementar. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl" target="_blank">Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a> Brain_Slicer_Parts_Human.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Human.stl" target="_blank">Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a> Cap_Insert.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Cap_Insert.stl" target="_blank">Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a>

O objetivo geral deste protocolo é o de alinhar com precisão ressonância (MRI) Os volumes de imagem magnética com cortes histológicos através da criação de suportes cerebrais impresso-3D personalizados e caixas slicer.

Utilizando tecnologia de impressão 3D para mesclar MRI com Histologia: Um protocolo para o Cérebro Seccionamento

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

O objetivo geral deste protocolo é alinhar com precisão volumes de imagens de ressonância magnética com cortes de histologia por meio da criação de suportes cerebrais personalizados em 3D e caixas cortadoras. Embora este vídeo foque em tecido cerebral extraído de marmoset, este protocolo pode ser aplicado a qualquer cérebro, seja de roedor, primata não humano ou humano. Prepare uma estação de trabalho conforme descrito no protocolo.Encha o tubo com Fomblin e gaze até a marca de 20 mililitros. Comprima a gaze para remover bolhas de ar ao longo do caminho. Seque suavemente o cérebro da formalina.Em seguida, insira o cérebro com a parte frontal voltada para o fundo do tubo. Prenda cuidadosamente o cérebro no tubo usando gaze ao redor dos lados do cérebro para fixar sua posição. Preencha o restante do tubo com gaze e Fomblin.Remova cuidadosamente as bolhas de ar ao longo do processo. Em seguida, fixe a tampa e feche o tubo com parafina. Marque a tampa e a linha com a fissura inter-hemisférica.Em seguida, enrole o tubo em um papel toalha e insira-o na bobina com a marca na posição central superior. Insira a bobina no escâner de ressonância magnética. Após a aquisição e o pós-processamento, obtemos uma imagem ponderada em T2 que pode ser usada para criar um modelo digital do cérebro.Abra a RNM na orientação coronal. Em seguida, utilize as ferramentas de transformação para reamostrar a imagem em vóxeis isotrópicos de 1 milímetro. Depois, aplique um filtro de redução de ruído não linear.Selecione a tabela de consulta de exibição. Em seguida, clique no botão Limite Duplo. Arraste o controle deslizante no gráfico para cobrir todo o cérebro.Crie uma máscara binária do cérebro utilizando o algoritmo de segmentação Threshold com mínimo/máximo. Insira o valor localizado no canto inferior esquerdo do gráfico de intensidade, logo abaixo da escala, na caixa Limite inferior. Em seguida, selecione Binário e desmarque o Limite inverso.Selecione o algoritmo morfológico, Preencher buracos. Marque Processar em 2,5D. Para preencher a lacuna entre o cérebro posterior e o córtex, selecione a linha VOI.Trace uma conexão entre o cérebro posterior e o córtex em ambos os lados do cérebro no ponto mais lateral. Continue desenhando conexões de VOI através do cérebro. Converta os VOIs em uma máscara binária.Utilize a calculadora de imagem para combinar as máscaras binárias de VOI e cérebro selecionando a operação OU. Selecione Promover o tipo de imagem de destino. Agora, selecione o algoritmo morfológico Preencher buracos.E verifique o Processo em 2,5D. Selecione o algoritmo Extrair superfície, selecione Imagem de máscara, insira um nome e depois selecione o tipo de arquivo ply. As lacunas na caixa de corte correspondentes à localização do plano de corte podem ser posicionadas a partir da parte frontal do cérebro, da parte traseira do cérebro ou em relação a uma região de interesse, como as lesões na substância branca vistas aqui.Usando VOI de caixa, desenhe uma caixa ao redor do cérebro. Copie e cole a caixa no número de cortes de ressonância magnética correspondente à espessura desejada dos espaços entre as lâminas. Em seguida, avance o número de cortes de ressonância magnética por seção e posicione a caixa como feito anteriormente para criar outro espaço entre lâminas.Repita este processo por todo o cérebro. Inverta as VOIs da caixa para uma máscara binária. Em seguida, extraia a superfície utilizando a extração de superfície, conforme realizado anteriormente para o cérebro.Selecione a máscara binária do intervalo da lâmina. Utilize a matemática de imagem para multiplicá-la por 10.000. Em seguida, utilize a calculadora de imagem para adicionar a máscara binária multiplicada à ressonância magnética isotrópica reamostrada.Agora, ao selecionar a visualização triplanar, pode-se observar um mapa de lâmina de ressonância magnética que mostra a localização em que o cérebro será seccionado, em três vistas ortogonais. No Netfabb Professional, selecione Adicionar peça. Em seguida, selecione o modelo de Folga da Lâmina e os modelos em formato ply do Cérebro.Selecione o modelo de cérebro e clique no modo de reparo. Use o botão de seleção de camada para selecionar o cérebro. Em seguida, alterne a seleção para as outras camadas e exclua-as.Em seguida, aplique o reparo e remova a parte antiga. Com o cérebro selecionado, selecione Mover. Clique em origem e registre os parâmetros nas caixas X, Y e Z.Esses são necessários para manter o posicionamento da folga da lâmina. Clique em traduzir. E feche a janela.Selecione o modelo de Folga da Lâmina e traduza-o usando os parâmetros registrados na etapa anterior. Selecione o modelo de Cérebro e clique no modo de reparo. Use o botão de seleção de superfície para selecionar o cérebro.Em seguida, selecione Triângulos suavizados. Insira quatro, para o número de Iterações. E marque Evitar a redução de volume.Selecione Reduzir Triângulos e insira 200000 na caixa Contagem de Triângulos de Destino. Em seguida, selecione Reparo Automático e realize um reparo padrão. Aplique o reparo.Em seguida, exporte o modelo cerebral suavizado como um arquivo STL. Importe o modelo cerebral suavizado para o Meshmixer. Utilize as ferramentas de escultura para suavizar as áreas desenhadas com as VOIs em linha.E corrija quaisquer outros defeitos menores no modelo. Importe o modelo de cérebro suavizado e editado para o Netfabb Professional. Em seguida, adicione a peça, partes cortadoras de cérebro marmoset.Selecione as conchas para as partes. Em seguida, renomeie cada parte conforme descrito no protocolo. Usando as configurações de seleção descritas no protocolo, clique e arraste as partes para posicionar o cérebro no centro da caixa.Clique e arraste as partes para ajustar a profundidade do cérebro na caixa. Selecione o modelo de cérebro suavizado e editado, no modelo recortado na caixa, e selecione a operação booleana. Clique no modelo do cérebro para torná-lo vermelho.E selecione subtração booleana. Aplique os cálculos. Marque a caixa para saliências que impedirão o posicionamento adequado do cérebro.Consulte a seção suplementar do protocolo para um método de removê-los. Selecione o modelo de folga da lâmina e clique em mover. Registre na posição Z.Esta será a posição da fenda da lâmina mais posterior. Em seguida, feche a janela. Selecione a parte da lâmina nas peças do cortador de cérebro e clique em Mover.Digite o valor de Z da etapa anterior. E insira os valores atuais das posições X e Y. Selecione a translação absoluta e traduza.Clique em Duplicar. Se a espessura da seção for consistente, como mostrado aqui, insira o número total de lâminas e a contagem total e a contagem Z, e insira a espessura da seção na caixa de intervalo Z. Em seguida, selecione duplicar.Selecione a peça da lâmina do micrótomo das peças do cortador de cérebro. Repita os mesmos passos de movimentação e duplicação realizados com a peça da lâmina. Selecione todas as Lâminas de Micrótomo e o suporte principal da lâmina e clique na operação booleana.Selecione todas as Lâminas de Micrótomo para torná-las vermelhas e clique em subtração booleana. Em seguida, aplique os cálculos. Entre no modo de reparo e selecione reparo automático.Realize um reparo estendido e aplique o reparo. Exporte o suporte da lâmina como um STL. Selecione todas as lâminas, as caixas principal e secundária e o modelo do cérebro editado e suavizado e clique na operação booleana.Use a janela de seleção de peças para tornar todas as peças, exceto a caixa principal, vermelhas. Em seguida, selecione a subtração booleana. Aplique os cálculos.Entre no modo de reparo e marque a caixa para arestas afiadas que poderiam lesionar o cérebro. Essas podem ser reparadas no modo de reparo do Netfabb ou utilizando as ferramentas de escultura no Meshmixer.Em seguida, selecione Reparo Automático. Realize um Reparo Estendido. Depois, aplique o reparo.Exporte a caixa cerebral como um STL. No Cura, selecione Carregar e importe a Caixa Cerebral. Clique no botão Girar.Em seguida, clique e arraste para posicionar a caixa plana. Edite as configurações de impressão conforme mostrado no protocolo. E então salve o percurso da ferramenta.Siga o mesmo processo para o suporte da lâmina e também duplique o objeto. Em seguida, salve a trajetória da ferramenta. Após aplicar uma fina camada de cola na plataforma de impressão, imprima a caixa cerebral e os suportes das lâminas na impressora 3D utilizando as configurações descritas no protocolo.Após a conclusão das impressões, o cérebro pode ser preparado para o corte. Monte uma estação de trabalho conforme descrito no protocolo. Posicione cuidadosamente o cérebro na caixa e certifique-se de que está firmemente fixado.Posicione as lâminas de micrótomo no porta-lâminas, encaixando-as nos espaços correspondentes da caixa. Usando luvas de proteção, pressione firmemente os porta-lâminas para baixo. Aplique pressão lenta e equilibrada para cortar o cérebro.Remova as fatias uma a uma, começando pela parte frontal do cérebro. Embora esta abordagem seja direta, o método exige várias etapas, bem como o uso de diversos tipos de software, e os pesquisadores devem familiarizar-se com as interfaces do usuário antes de iniciar o procedimento. Este fluxo de trabalho resume o protocolo para fabricar a caixa cortadora de cérebro de marmosete.O cérebro é fixado com formalina e uma ressonância magnética ponderada em T2 é adquirida com resolução de 150 mícrons. As imagens são processadas e limiarizadas para criar uma máscara binária. Em seguida, a superfície é renderizada em software de modelagem 3D.Uma subtração booleana entre um modelo de cortador e o modelo do cérebro cria o modelo digital do cortador de cérebro. A caixa do cortador de cérebro é então impressa em uma impressora 3D. Em seguida, o cérebro é firmemente posicionado dentro da caixa do cortador para o corte.Uma vez que o cérebro é fatiado, uma comparação visual entre as imagens de RM in vivo e pós-mortem e as fotografias das superfícies superficiais dos blocos revela uma boa correspondência de orientação em múltiplos blocos. Uma comparação mais detalhada entre a RM pós-mortem de alta resolução e as seções histológicas coradas com CV LFB provenientes de múltiplos blocos cerebrais demonstra uma correspondência precisa e consistente em todas as estruturas do cérebro do marmoset. Neste modelo animal de Esclerose Múltipla, os animais desenvolvem lesões na substância branca disseminadas por todo o cérebro.Utilizando esta técnica, lesões pequenas detectadas por RNM in vivo podem ser rastreadas tanto em seções de RNM post mortem quanto em cortes histológicos. A histologia e a RNM post mortem também podem revelar lesões que passaram despercebidas na RNM in vivo. Neste caso, a RNM in vivo não mostrou evidências convincentes de sinal hipointenso normal para sugerir lesões em qualquer um dos tratos ópticos.No entanto, na ressonância magnética post-mortem, foram observadas hiperintensidades de sinal no trato óptico. E essas áreas correspondiam diretamente às lesões mielinizadas vistas na seção histológica com LFB CV. Assim, em conclusão, a metodologia aqui apresentada permite aos pesquisadores avaliar com precisão a patologia subjacente aos achados de ressonância magnética.Consideramos que é uma abordagem promissora para identificar novos biomarcadores de doenças que envolvem o cérebro e para processos patológicos específicos, como inflamação e remielinização.

utilizing-3d-printing-technology-to-merge-mri-with-histology-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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