Utilizando tecnologia de impressão 3D para mesclar MRI com Histologia: Um protocolo para o Cérebro Seccionamento

O objetivo geral deste protocolo é alinhar com precisão volumes de imagens de ressonância magnética com cortes de histologia por meio da criação de suportes cerebrais personalizados em 3D e caixas cortadoras. Embora este vídeo foque em tecido cerebral extraído de marmoset, este protocolo pode ser aplicado a qualquer cérebro, seja de roedor, primata não humano ou humano. Prepare uma estação de trabalho conforme descrito no protocolo.

Encha o tubo com Fomblin e gaze até a marca de 20 mililitros. Comprima a gaze para remover bolhas de ar ao longo do caminho. Seque suavemente o cérebro da formalina.

Em seguida, insira o cérebro com a parte frontal voltada para o fundo do tubo. Prenda cuidadosamente o cérebro no tubo usando gaze ao redor dos lados do cérebro para fixar sua posição. Preencha o restante do tubo com gaze e Fomblin.

Remova cuidadosamente as bolhas de ar ao longo do processo. Em seguida, fixe a tampa e feche o tubo com parafina. Marque a tampa e a linha com a fissura inter-hemisférica.

Em seguida, enrole o tubo em um papel toalha e insira-o na bobina com a marca na posição central superior. Insira a bobina no escâner de ressonância magnética. Após a aquisição e o pós-processamento, obtemos uma imagem ponderada em T2 que pode ser usada para criar um modelo digital do cérebro.

Abra a RNM na orientação coronal. Em seguida, utilize as ferramentas de transformação para reamostrar a imagem em vóxeis isotrópicos de 1 milímetro. Depois, aplique um filtro de redução de ruído não linear.

Selecione a tabela de consulta de exibição. Em seguida, clique no botão Limite Duplo. Arraste o controle deslizante no gráfico para cobrir todo o cérebro.

Crie uma máscara binária do cérebro utilizando o algoritmo de segmentação Threshold com mínimo/máximo. Insira o valor localizado no canto inferior esquerdo do gráfico de intensidade, logo abaixo da escala, na caixa Limite inferior. Em seguida, selecione Binário e desmarque o Limite inverso.

Selecione o algoritmo morfológico, Preencher buracos. Marque Processar em 2,5D. Para preencher a lacuna entre o cérebro posterior e o córtex, selecione a linha VOI.

Trace uma conexão entre o cérebro posterior e o córtex em ambos os lados do cérebro no ponto mais lateral. Continue desenhando conexões de VOI através do cérebro. Converta os VOIs em uma máscara binária.

Utilize a calculadora de imagem para combinar as máscaras binárias de VOI e cérebro selecionando a operação OU. Selecione Promover o tipo de imagem de destino. Agora, selecione o algoritmo morfológico Preencher buracos.

E verifique o Processo em 2,5D. Selecione o algoritmo Extrair superfície, selecione Imagem de máscara, insira um nome e depois selecione o tipo de arquivo ply. As lacunas na caixa de corte correspondentes à localização do plano de corte podem ser posicionadas a partir da parte frontal do cérebro, da parte traseira do cérebro ou em relação a uma região de interesse, como as lesões na substância branca vistas aqui.

Usando VOI de caixa, desenhe uma caixa ao redor do cérebro. Copie e cole a caixa no número de cortes de ressonância magnética correspondente à espessura desejada dos espaços entre as lâminas. Em seguida, avance o número de cortes de ressonância magnética por seção e posicione a caixa como feito anteriormente para criar outro espaço entre lâminas.

Repita este processo por todo o cérebro. Inverta as VOIs da caixa para uma máscara binária. Em seguida, extraia a superfície utilizando a extração de superfície, conforme realizado anteriormente para o cérebro.

Selecione a máscara binária do intervalo da lâmina. Utilize a matemática de imagem para multiplicá-la por 10.000. Em seguida, utilize a calculadora de imagem para adicionar a máscara binária multiplicada à ressonância magnética isotrópica reamostrada.

Agora, ao selecionar a visualização triplanar, pode-se observar um mapa de lâmina de ressonância magnética que mostra a localização em que o cérebro será seccionado, em três vistas ortogonais. No Netfabb Professional, selecione Adicionar peça. Em seguida, selecione o modelo de Folga da Lâmina e os modelos em formato ply do Cérebro.

Selecione o modelo de cérebro e clique no modo de reparo. Use o botão de seleção de camada para selecionar o cérebro. Em seguida, alterne a seleção para as outras camadas e exclua-as.

Em seguida, aplique o reparo e remova a parte antiga. Com o cérebro selecionado, selecione Mover. Clique em origem e registre os parâmetros nas caixas X, Y e Z.

Esses são necessários para manter o posicionamento da folga da lâmina. Clique em traduzir. E feche a janela.

Selecione o modelo de Folga da Lâmina e traduza-o usando os parâmetros registrados na etapa anterior. Selecione o modelo de Cérebro e clique no modo de reparo. Use o botão de seleção de superfície para selecionar o cérebro.

Em seguida, selecione Triângulos suavizados. Insira quatro, para o número de Iterações. E marque Evitar a redução de volume.

Selecione Reduzir Triângulos e insira 200000 na caixa Contagem de Triângulos de Destino. Em seguida, selecione Reparo Automático e realize um reparo padrão. Aplique o reparo.

Em seguida, exporte o modelo cerebral suavizado como um arquivo STL. Importe o modelo cerebral suavizado para o Meshmixer. Utilize as ferramentas de escultura para suavizar as áreas desenhadas com as VOIs em linha.

E corrija quaisquer outros defeitos menores no modelo. Importe o modelo de cérebro suavizado e editado para o Netfabb Professional. Em seguida, adicione a peça, partes cortadoras de cérebro marmoset.

Selecione as conchas para as partes. Em seguida, renomeie cada parte conforme descrito no protocolo. Usando as configurações de seleção descritas no protocolo, clique e arraste as partes para posicionar o cérebro no centro da caixa.

Clique e arraste as partes para ajustar a profundidade do cérebro na caixa. Selecione o modelo de cérebro suavizado e editado, no modelo recortado na caixa, e selecione a operação booleana. Clique no modelo do cérebro para torná-lo vermelho.

E selecione subtração booleana. Aplique os cálculos. Marque a caixa para saliências que impedirão o posicionamento adequado do cérebro.

Consulte a seção suplementar do protocolo para um método de removê-los. Selecione o modelo de folga da lâmina e clique em mover. Registre na posição Z.

Esta será a posição da fenda da lâmina mais posterior. Em seguida, feche a janela. Selecione a parte da lâmina nas peças do cortador de cérebro e clique em Mover.

Digite o valor de Z da etapa anterior. E insira os valores atuais das posições X e Y. Selecione a translação absoluta e traduza.

Clique em Duplicar. Se a espessura da seção for consistente, como mostrado aqui, insira o número total de lâminas e a contagem total e a contagem Z, e insira a espessura da seção na caixa de intervalo Z. Em seguida, selecione duplicar.

Selecione a peça da lâmina do micrótomo das peças do cortador de cérebro. Repita os mesmos passos de movimentação e duplicação realizados com a peça da lâmina. Selecione todas as Lâminas de Micrótomo e o suporte principal da lâmina e clique na operação booleana.

Selecione todas as Lâminas de Micrótomo para torná-las vermelhas e clique em subtração booleana. Em seguida, aplique os cálculos. Entre no modo de reparo e selecione reparo automático.

Realize um reparo estendido e aplique o reparo. Exporte o suporte da lâmina como um STL. Selecione todas as lâminas, as caixas principal e secundária e o modelo do cérebro editado e suavizado e clique na operação booleana.

Use a janela de seleção de peças para tornar todas as peças, exceto a caixa principal, vermelhas. Em seguida, selecione a subtração booleana. Aplique os cálculos.

Entre no modo de reparo e marque a caixa para arestas afiadas que poderiam lesionar o cérebro. Essas podem ser reparadas no modo de reparo do Netfabb ou utilizando as ferramentas de escultura no Meshmixer.

Em seguida, selecione Reparo Automático. Realize um Reparo Estendido. Depois, aplique o reparo.

Exporte a caixa cerebral como um STL. No Cura, selecione Carregar e importe a Caixa Cerebral. Clique no botão Girar.

Em seguida, clique e arraste para posicionar a caixa plana. Edite as configurações de impressão conforme mostrado no protocolo. E então salve o percurso da ferramenta.

Siga o mesmo processo para o suporte da lâmina e também duplique o objeto. Em seguida, salve a trajetória da ferramenta. Após aplicar uma fina camada de cola na plataforma de impressão, imprima a caixa cerebral e os suportes das lâminas na impressora 3D utilizando as configurações descritas no protocolo.

Após a conclusão das impressões, o cérebro pode ser preparado para o corte. Monte uma estação de trabalho conforme descrito no protocolo. Posicione cuidadosamente o cérebro na caixa e certifique-se de que está firmemente fixado.

Posicione as lâminas de micrótomo no porta-lâminas, encaixando-as nos espaços correspondentes da caixa. Usando luvas de proteção, pressione firmemente os porta-lâminas para baixo. Aplique pressão lenta e equilibrada para cortar o cérebro.

Remova as fatias uma a uma, começando pela parte frontal do cérebro. Embora esta abordagem seja direta, o método exige várias etapas, bem como o uso de diversos tipos de software, e os pesquisadores devem familiarizar-se com as interfaces do usuário antes de iniciar o procedimento. Este fluxo de trabalho resume o protocolo para fabricar a caixa cortadora de cérebro de marmosete.

O cérebro é fixado com formalina e uma ressonância magnética ponderada em T2 é adquirida com resolução de 150 mícrons. As imagens são processadas e limiarizadas para criar uma máscara binária. Em seguida, a superfície é renderizada em software de modelagem 3D.

Uma subtração booleana entre um modelo de cortador e o modelo do cérebro cria o modelo digital do cortador de cérebro. A caixa do cortador de cérebro é então impressa em uma impressora 3D. Em seguida, o cérebro é firmemente posicionado dentro da caixa do cortador para o corte.

Uma vez que o cérebro é fatiado, uma comparação visual entre as imagens de RM in vivo e pós-mortem e as fotografias das superfícies superficiais dos blocos revela uma boa correspondência de orientação em múltiplos blocos. Uma comparação mais detalhada entre a RM pós-mortem de alta resolução e as seções histológicas coradas com CV LFB provenientes de múltiplos blocos cerebrais demonstra uma correspondência precisa e consistente em todas as estruturas do cérebro do marmoset. Neste modelo animal de Esclerose Múltipla, os animais desenvolvem lesões na substância branca disseminadas por todo o cérebro.

Utilizando esta técnica, lesões pequenas detectadas por RNM in vivo podem ser rastreadas tanto em seções de RNM post mortem quanto em cortes histológicos. A histologia e a RNM post mortem também podem revelar lesões que passaram despercebidas na RNM in vivo. Neste caso, a RNM in vivo não mostrou evidências convincentes de sinal hipointenso normal para sugerir lesões em qualquer um dos tratos ópticos.

No entanto, na ressonância magnética post-mortem, foram observadas hiperintensidades de sinal no trato óptico. E essas áreas correspondiam diretamente às lesões mielinizadas vistas na seção histológica com LFB CV. Assim, em conclusão, a metodologia aqui apresentada permite aos pesquisadores avaliar com precisão a patologia subjacente aos achados de ressonância magnética.

Consideramos que é uma abordagem promissora para identificar novos biomarcadores de doenças que envolvem o cérebro e para processos patológicos específicos, como inflamação e remielinização.