Name: Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda PCR em nanoesfera para detecção de patógenos respiratórios em cães e cavalos. Este método de alto rendimento permite analisar múltiplas amostras simultaneamente, aprimorando a vigilância OneHealth em medicina veterinária.

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O trabalho sobre os ensaios de patógenos respiratórios descritos aqui foi apoiado por fundos de desenvolvimento interno Cornell Centro de Diagnóstico de Saúde Animal. Desenvolvimento da nanoescala fluxo de trabalho PCR e sistemas de garantia de qualidade associados foi parcialmente financiado (FOA PA-13-244) e realizado em colaboração com o Laboratório de Investigação Veterinária da Food and Drug Administration e Response Network (FDA Vet-LIRN), Grant No. 1U18FD005144- 01. As taxas de publicação foram patrocinados pela VWR e Quanta Biosciences. Agradecemos Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, e Katrina Walker para a sua assistência com a escrita e revisão do protocolo. Agradecemos a Mike Carroll para filmar as entrevistas do autor. Nós finalmente agradecer ao editor e três revisores anônimos por seus comentários.

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<li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Equine+Pract%22%5BJournal%5D)">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li>
<li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+of+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li>
<li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li>
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<li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+of+Ticks%3A+The+Rule+Rather+Than+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539(2016).</li>
</ol>

Marcia Slater e Elen Ortenberg são funcionários da Thermo Fisher Scientific Inc., que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Este procedimento foi utilizado para testes de rotina de agentes patogénicos respiratórios no nosso laboratório, ao longo de seis meses (2-3 vezes por semana). Nós também tivemos sucesso usando o mesmo procedimento para criação de perfis de patógenos entéricos em amostras fecais e bactérias isoladas em um prato personalizado separadamente. Uma vez que as placas são produzidas, a equipe experiente pode completar as etapas 2-7 no prazo de um dia de trabalho normal. Os passos mais críticos são a vedação adequada da placa pré-amplificador, a transferência das amostras entre as placas pré-amplificado (que deve ser feito rapidamente para evitar a evaporação), e o revestimento final da placa de amplificação. Utilização da folha de cálculo macro como um guia para a análise dos resultados (verificação curvas para as amostras e controlos) foi também crítica que reduziu significativamente a quantidade de tempo e papelada necessária para este processo. A planilha macro fornecida é um exemplo; ele precisaria ser modificado ou re-criada para placas com diferentes configurações. Isso pode facilmente ser performed por alguém com conhecimento básico de planilha. Devido à quantidade muito pequena de amostra carregada na placa de amplificação (33 nl), a pré-amplificação é necessária. Na optimização deste protocolo (não mostrado), comparou-se um número de parâmetros de Pré-amplificação, incluindo a mistura principal, a adição de iniciadores aleatórios, número de ciclos, o tempo de recozimento, e a diluição antes da amplificação. Cada alvo tinha suas próprias condições ideais, e os descritos aqui representam aquelas que produziram o melhor limite de detecção geral para o nosso painel. Este painel abrange uma ampla gama de alvos patogénicos e tipos de amostras que são encontrados nos testes de diagnóstico veterinário de rotina, mas na modificação dos procedimentos Pré-amplificação podem ser necessários para diferentes painéis. As condições de amplificação optimizado pelo fabricante baseiam-se num tempo real protocolo de PCR com base em sonda com um padrão de 10 min a 95 C de activação de enzimas ° seguido de desnaturação a 95 ° C e AnnEaling / extensão a 60 ° C. Os iniciadores e as sondas são pré-impresso sobre as placas também utilizando condições optimizadas pelo fabricante e, portanto, não necessitam de titulação. A combinação dos passos de transcrição reversa e de pré-amplificação de todas as amostras (independentemente do tipo de alvo) foi necessário a fim de manter a eficiência do fluxo de trabalho. Tendo em todas as amostras de transcrição reversa também é benéfico para maximizar a sensibilidade. Além disso, o uso de uma mistura principal para o pré-amplificador que é otimizado para inibidores minimizando permite versatilidade na combinação de diferentes tipos de amostras na mesma placa. O Center for Disease Control (CDC) ensaio de matriz de influenza descrito por Shu et al. 7 e adaptado aqui para reações escala nanoliter é uma gripe universal Um ensaio que é apropriado para testar amostras de seres humanos e animais de companhia. Ele foi projetado para a detecção universal do gene matriz de todos os vírus da gripe A utilizando rea escala microlitroficções. Ela tem sido usada em todo o mundo como parte de um painel de vírus CDC Influenza Humana e um Painel de gripe suína CDC. O ensaio 8 EHV-1 adaptada aqui detecta um importante patógeno respiratório de cavalos que podem causar abortos e doença neurológica (revisado por Pusterla e Hussey 10). O significado de se adaptar estes ensaios a uma plataforma de alto rendimento com um controlo interno independente da espécie é que eles podem ser incorporados em uma abordagem de vigilância OneHealth. Tendo ambos os ensaios em uma plataforma de testes de alto rendimento irá facilitar a preparação para emergências em instalações clínicas, abrigos e eventos de desempenho. Os resultados descritos acima foram representativas de todos os alvos na placa com a excepção de Mycoplasma cynos, que mostraram consideravelmente mais variação no desempenho analítico. Isto era provavelmente devido à temperatura sub-óptima de fusão (T m) dos iniciadores, o que deve ser idealmente de 58-60 &amp;# 176; C (a sonda Tm ideal é 68-70 ° C). Uma limitação desta plataforma é que ela leva mais tempo para projetar e fabricar as placas do que para encomendar sondas individuais, o que limita a capacidade de modificar rapidamente sequências. Outra limitação de PCR em tempo real, em geral, é a incapacidade de detectar novos agentes patogénicos ou inesperados. Isto pode ser ultrapassado, em certa medida através da concepção de ensaios que correspondem a sequências em várias espécies, mas metodologias baseadas inteiro de sequenciamento do genoma imparciais são mais adequados para a descoberta de novos agentes 11,12. Nanoescala PCR em tempo real permite que um novo paradigma para, em vez de testes de espécies baseada, que é útil para reduzir o custo dos reagentes e trabalhistas em diagnóstico molecular de alto rendimento à base de síndrome. Testes de painel em grande escala por esta abordagem pode facilitar os esforços de vigilância OneHealth tais como os descritos por Dunne e Gurfield 13 e Moutailler et al. 14. Recolha de amostras de esfregaço cedo,geralmente dentro de 3 dias do início clínico, proporciona a melhor oportunidade para identificar a presença de patógenos respiratórios. Infecciosa surgimento da doença é muitas vezes imprevisível, e testes que podem ser realizados em espécies diferentes sem a necessidade de modificação de reagentes são ideais para a preparação. As aplicações futuras desta tecnologia são susceptíveis de estar em tipagem patogénica, de perfis de resistência antimicrobiana, e outros painéis à base de diagnósticos clínicos da síndrome. Nanoescala PCR em tempo real é mais útil para uma rápida triagem, de alto rendimento de vários tipos de amostras e de agentes patogénicos, e serão complementadas com abordagens baseadas em seqüenciamento imparciais ou parcialmente tendenciosos para identificar novas e emergentes patógenos.

Com a demanda para a detecção rápida e abrangente de múltiplos agentes em diagnósticos clínicos para seres humanos e animais, um único organismo métodos diagnósticos moleculares para detecção de patógenos são pesados ​​a menos que usado para o grande número de amostras a ser testado para uma única doença. No contexto veterinário, metodologias de diagnóstico de elevado rendimento, são particularmente importantes devido à necessidade adicional para cobrir agentes patogénicos a partir de uma grande variedade de espécies. OneHealth abordagens para a gestão de doenças de origem alimentar e vigilância patógeno emergente são exemplos de necessidades de testes que incluem um número de bactérias, vírus (DNA ou RNA base), parasitas e fungos. O desafio de combinação de testes para vários analitos juntos (multiplexação), a fim de melhorar a eficiência do teste é uma possível perda de sensibilidade e um grande fardo para a otimização e validação de ensaios. escala nanoliter em tempo real, reação em cadeia da polimerase (PCR) é um alternativo para a prática de multiplexagem que permite muitas reacções separadas para executar simultaneamente na mesma amostra 1. A plataforma OpenArray é uma aplicação deste princípio 2; que combina a tecnologia de microarray com PCR em tempo real. Com base no conceito de multiplexagem espacial, cada amostra é testada para um grande número de alvos em separado por meio de furos de passagem. Esta plataforma foi inicialmente utilizada com a ligação de ADN de cadeia dupla baseada cyanine química 2 e está agora disponível para a química à base de sonda utilizando sondas de extinção escuros 3. Esta plataforma tem sido principalmente utilizado para a caracterização genética em seres humanos e animais 4 5. Recentemente, foi adaptado para a detecção de ADN e ARN agentes patogénicos contidos no sangue por Grigorenko et ai. 6, utilizando um procedimento em dois passos de transcrição reversa / amplificação pré-(pré- amplificador). Descrevemos aqui um procedimento baseado em pré-amplificador de um passo para a detecção de ambos os tipos de patógenos no sec respiratóriaretions e uma variedade de outros tipos de amostras que podem ser realizados inteiramente em um dia de trabalho normal. Após a conclusão do pré-amplificador de um-passo, as amostras são transferidas para uma placa de 384 poços, que é o formato aceite pelo sistema de manuseamento de líquidos automatizado que vem com este nanoescala plataforma de PCR. O sistema desenha a mistura principal e a amostra através da superfície de até quatro placas (192) amostras e controlos de cada vez. Na sequência deste processo de carregamento, nós descrevemos como amostras são amplificados e analisados ​​utilizando uma planilha macro que resume a média de 3 repetições técnicos para cada combinação de amostra / target em uma tabela que se encaixa em uma página impressa. Um método comum para a análise de ADN extraído e / ou de ARN a partir de amostras usando esta plataforma foi estabelecida. Uma grande variedade de amostras foram extraídas, sujeitos a transcrição reversa, e pré-amplificado num formato de 96 poços, minimizando o potencial de erros. amostras respiratórias testadas incluíram swab nasal, compressas faringe profundas,lavagens trans-traqueal, lavado broncoalveolar e tecido pulmonar. Uma vez que alguns dos agentes testados podem também estar presentes no sangue periférico ou fezes, que incorporou os tipos de amostras para o processo. Este fluxo de trabalho simplificado ajuda a economizar tempo e recursos em relação à execução experimentos em várias placas, permitindo testes eficiente através da detecção do gene patógeno e toxina à base de painel no lugar do teste individual. O painel respiratória demonstrado aqui teve 18 ensaios de cada um impresso em triplicado através de furos, com capacidade para até 48 amostras por placa. Os patógenos equinos detectados incluídos adenovírus eqüino 1 e 2, vírus da arterite equina, vírus da rinite equina A e B, vírus de herpes equina tipos (MAT) 1 e 4, e Streptococcus equi. Os agentes patogénicos caninos incluídos coronavírus canino respiratória (betacoronavirus), vírus da cinomose canina, adenovírus canino, vírus parainfluenza canina, pneumovírus canino, Bordetella bronchiseptica e Mycoplasma cynos. UMAUm ensaio universal da gripe e um controlo interno (MS2 ARN fago) também foram incluídos.

<table><tbody><tr><td>Reagente lítico Zap-OGlobin II</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Reagente opcional para preparação de amostras de sangue.</td></tr><tr><td>Kit de extração (Kit de Isolamento de Ácido Nucleico Total MagMAX)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>Outros kits de extração apropriados para os tipos de amostra desejados podem ser substituídos. Este kit vem com PBS, tampão de lise e tampão de lavagem.</td></tr><tr><td>2x Mistura de RT-qPCR em uma etapa (qScript XLT RT-qPCR ToughMix em uma etapa)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de primers específicos</td> para genes <td>IDT</td><td>pedido personalizado</td><td>Pode ser gerado pelo usuário ou adquirido com as placas de amplificação.</td></tr><tr><td>Mistura aleatória de primer</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td> Placa padrão de 96 poços <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>Pode ser qualquer placa que se encaixe na máquina de PCR convencional usada.</td></tr><tr><td>Mix mestre de amplificação (mix mestre OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Selo adesivo transparente</td><td>Selo Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Selo de folha</td> Placa <td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>de 384 poços</td> Placa <td>de amplificação 4482221</td><td></td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td></tr><tr><td>(placa QuantStudio 12K Flex OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Pode ser personalizado com qualquer ensaio em conformidade com as condições padrão do TaqMan.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit</td><td>de acessórios Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Contém as tampas da caixa, plugues e fluido de imersão.</td></tr><tr><td>Dicas AccuFill</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de amplificação (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de líquidos (OpenArray AccuFill System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>Este é adquirido com a máquina de amplificação.</td></tr><tr><td>Software de projeto de primer (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>Consulte as instruções do fabricante para obter especificações detalhadas do primer e da sonda.</td></tr><tr><td>Programa de análise de imagem (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Disponível em http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Programa de planilha (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Disponível em https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Disruptor de tecido (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador convencional (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Qualquer termociclador convencional com tampa aquecida pode ser usado.</td></tr><tr><td>Girador de placas PCR</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>Este dispositivo tem apenas uma velocidade (2.500 rpm); o rotor arranca quando a tampa é fechada e pára quando o botão é pressionado.</td></tr><tr><td>Tampão TE</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM Cloridrato de Tris(hidroximetil)aminometano, 1 mM Ácido etilenodiaminotetracético, pH 8,0</td></tr></tbody></table>

detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por nanoscale pcr

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

escala nanoliter PCR em tempo real usa multiplexação espacial para permitir que vários ensaios para ser executado em paralelo em uma única chapa, sem os inconvenientes típicos de combinação de reações juntos. Nós projetamos e avaliou um painel com base nesse princípio para identificar rapidamente a presença de agentes de doenças comuns em cães e cavalos com doença respiratória aguda. Este manuscrito descreve um fluxo de trabalho PCR de diagnóstico nanoescala para preparação de amostras, amplificação e análise de sequências alvo de patógenos, com foco em procedimentos que são diferentes das reações escala microlitro. No painel respiratória apresentados, 18 ensaios foram, cada um configurado em triplicado, com capacidade para até 48 amostras por placa. Um fluxo de trabalho de extração e pré-amplificação universal foi otimizado para preparação de amostras de alto rendimento para acomodar vários matrizes e DNA e RNA patógenos base. Os dados representativos são apresentados para um alvo de ARN (influenza A matriz) e um alvo de ADN (herpesvírus equino1). A capacidade de testar com rapidez e precisão para um grupo abrangente, baseada em síndrome de patógenos é uma ferramenta valiosa para melhorar a eficiência e ergonomia de testes de diagnóstico e para o diagnóstico de doença respiratória aguda e gestão.

Os resultados são mostrados nas Figuras 1 e 2 por um ensaio representativo de ARN (matriz da gripe) e ensaio de ADN (EHV-1) com uma combinação de controlos positivos e amostras clínicas enviadas para testes de diagnóstico de rotina. Os sinais de fluorescência emitidas ao longo deste reaccionais típicas estão mostradas na Figura 1, que representa graficamente os valores de fluorescência em bruto por ciclo. Todos os limiares ciclo relativa (TC) foram gerados automaticamente pelo software do aparelho de amplificação. a fluorescência de fundo foi usado como uma medida separada para avaliação da qualidade do carregamento em vez de incorporá-lo nas leituras de fluorescência antes de calcular os valores de Ct. O limite de detecção (LOD) para cada alvo foi calculada com base na média geral dos valores Ct do nível de detecção de 95% e de 2 desvios-padrão em uma associação de controlos paratodos os alvos. A diluição mais elevada em que, pelo menos, 95% das réplicas foram positivos para os ensaios representativos foi de 50 cópias; detecção de 5 cópias foi bem sucedida em 50% de repetições. Nem o ensaio foi detectada abaixo de uma cópia. Os limites de determinação para o ensaio de RNA e DNA foram calculados os valores Ct de 21,92 e 20,05. Estes valores foram considerados os pontos de corte para os valores de relatórios como positivas vs. suspeito (potencialmente não repetível). Outros aspectos do desempenho analítico dos alvos foi avaliada utilizando diluições em série de controlos positivos reunidas são executados em três dias diferentes (Figura 2). As eficiências médias dos ensaios de ARN e de ADN representativos eram 101,1% e 106,6%; a eficiência média geral para todos os alvos foi 101,3%. Os ensaios também teve boa linearidade (R 2&gt; 0,98). Variação dentro replicar orifícios tipicamente estava dentro de desvios-padrão de 0,2 para ambas as amostras clínicas ded controlos. Não foi observada nenhuma reactividade cruzada entre qualquer um dos objectivos. A planilha Resultados Finais no arquivo suplementar mostra resultados quantitativos representativos para 10 amostras de diagnóstico clínico e 4 controles. As amostras clínicas são um subconjunto dos tipos de amostras testados rotineiramente incluindo nasal / amostras de orofaringe, tecido pulmonar, e as amostras fecais. Um (equina) amostra fecal neste conjunto mostra um controlo interno MS2 falha, que indica a presença de inibidores na amostra. Isto é tipicamente controlado por diluição da amostra eluiu-se e / ou a re-extracção. Como é o caso aqui, o controlo de amplificação negativa deve ser negativo para todos os alvos, eo controle de extração negativo só deve conter o controlo interno. No conjunto clínica, amostras produziu valores Ct para betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, cinomose vírus A, vírus parainfluenza canina, pneumovírus canino, ea gripeUMA. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> Figura 1. Os gráficos de amplificação. As leituras de fluorescência são representados graficamente contra a ciclos de amplificação de RNA para o ensaio (A) e ensaio de DNA (B). Triângulos são mostrados denotando valores Ct. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> Figura 2. As curvas padrão. As curvas padrão do ensaio de RNA e DNA testado em três dias diferentes são representados, a fim de demonstrar a linearidade e gama de amplificação, utilizando os controlos positivos. Ciclo valores limiar (Ct) em função de log (10) do número de cópias de ARN (A) ou de DNA ( <strong&gt; B) padrão. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> Tabela 1. Esquema de os locais-alvo e placa de amplificação. As placas utilizadas para ensaios de PCR em tempo real nanoescala nesta plataforma de lâmina de microscópio são de tamanho e estão dispostos em 48 submatrizes de 64 furos de passagem, com um total de 3072 orifícios para as reacções individuais. Um sub-disposição é mostrado aqui, com 18 alvos, em triplicado. Cada amostra é adicionada a uma sub-disposição pelo manipulador de líquidos. As placas são revestidas com compostos hidrófilos e hidrófobos para reter os reagentes em furos de passagem através de tensão superficial. O chip de aço inoxidável é &quot;photolithographically estampados e wet-gravado para formar uma matriz rectilínea de 3072 usinado-micro, 320 mícrons diamete. r buracos de 33 nl cada &quot;2 abreviações para as metas são as seguintes: BCOR, coronavírus respiratório canino (betacoronavirus); BORD, Bordetella CAV bronchiseptica, adenovírus canino; CPIV, vírus parainfluenza canina; CPNv, pneumovírus canino; DISTA / B, canino vírus da cinomose A e B; EADV1 / 2, adenovírus eqüino 1/2; EAV, vírus eqüino arterite; EHV-1/4, eqüino tipo de herpesvírus 1/4; ERVA / B, equina vírus rinite A / B; IVM, influenza A matriz; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, controle interno (MS2 RNA fago); sequ, Streptococcus equi. <img alt="mesa 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> Tabela 2. Transferir a placa de mapa. Um mapa de transferência de placa com código de cores para a utilização de uma pipeta de 8 canais fixa para transferir a partir do pré-amplificador de placa de 96 cavidades para a placa de 384 poços é mostrado. Alternativamente, pode ser utilizada uma pipeta ajustável. O mesmo procedimento é realizado cada vez independentemente de h<html> OW muitas amostras são na placa. <img alt="Arquivo suplementar" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> Arquivo suplementar. Um arquivo de planilha habilitado para macro que contém duas macros para resultados de formatação em uma tabela de resumo (conforme descrito no protocolo) é fornecido. A tabela de resultados típico gerado pelas macros está incluído no arquivo (em Resultados Finais). As duas macros irá preencher os nomes da amostra na primeira coluna (até 48 amostras) e a média dos três valores de Ct para cada alvo para aqueles com resultados positivos; note que os alvos que não amplificam aparecem em branco nesta tabela. Isto pode ser facilmente impressa sobre um pedaço de papel e usada como uma referência para a verificação dos dados em bruto de forma eficiente. Na guia resultados finais, resultados representativos para 10 amostras clínicas e 4 controles são mostrados. Abreviações de nomes de ensaio são listados na legenda da Tabela 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para baixar esse arquivo.

testes de alto rendimento de DNA e RNA patógenos base por nanoescala PCR é descrito usando um canino sindrômica e painel de PCR respiratória equina.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

O objetivo geral desta metodologia de teste de PCR em tempo real é detectar simultaneamente patógenos baseados em DNA e RNA de maneira de alto rendimento. O ácido nucleico de espécimes clínicos será pré-amplificado com um pool comum de iniciadores carregado em uma placa OpenArray e analisado quanto à presença de patógenos. Este método pode ajudar a promover esforços de vigilância OneHealth para doenças infecciosas.Em comparação com as técnicas tradicionais, este método permite testar mais amostras para mais alvos sem que haja competição entre eles, aumentando assim a eficiência dos testes. O método utiliza uma placa de PCR personalizada em escala nanométrica. Os iniciadores e as sondas são impressos nas bordas dos orifícios passantes e as amostras são carregadas usando um manipulador de líquidos.Vamos demonstrar o método em espécimes clínicos que estão sendo testados para um painel de patógenos respiratórios de cavalos e cães. Para iniciar este procedimento, projete a placa conforme descrito no protocolo textual. A placa utilizada aqui está configurada com 18 alvos em triplicata.Adicione meio aos swabs e lavados traqueais para que haja pelo menos um a dois mililitros de líquido. Vortexe vigorosamente o swab e o DMEM no tubo. Em seguida, use uma pipeta para transferir aproximadamente 1 mililitro de meio para um novo tubo.Adicione 235 micro litros de tampão de lise e 175 micro litros da amostra a cada tubo com esferas. Prossiga com o protocolo do fabricante para extrair o ácido nucleico total. Prepare-se para a transcrição reversa e pré-amplificação do ácido nucleico ou pré-amplificação conforme descrito no protocolo textual, verificando primeiro o mapa das amostras.Adicione 8,5 µL da mistura mestra de pré-amplificação e 5,5 µL da amostra de DNA/RNA a cada poço de uma placa padrão de 96 poços, utilizando apenas o lado esquerdo da placa. Após combinar as amostras, controles positivos e controles negativos com a mistura de pré-amplificação, feche completamente a placa padrão de 96 poços com um selo adesivo transparente. Remova qualquer excesso de selo usando uma lâmina de barbear para evitar a formação de lacunas no selo durante os ciclos.Centrifugue a placa selada por 20 segundos usando um rotor para placas PCR. Verifique se todos os reagentes estão combinados no fundo dos poços da placa. Após ligar um termociclador convencional, selecione o programa de ciclagem de pré-amplificação e inicie o programa.Coloque a placa de 96 poços no termociclador somente quando a parte inferior do termociclador atingir a temperatura necessária para a produção de cDNA, monitorando a leitura de temperatura na tela. Após a conclusão da reação de pré-amplificação, verifique se a placa permaneceu selada. Depois de colocar luvas duplas e protetores de mangas, remova o selo da placa de pré-amplificação.Em seguida, remova e descarte cuidadosamente as luvas externas. Dilua os produtos de pré-amplificação de um para cinco, adicionando 56 micro litros de tampão TE a cada poço das colunas um a seis da placa de pré-amplificação de 96 poços e misturando por pipetagem para cima e para baixo. Para isso, vá apenas até o primeiro parada da pipeta, aspire a partir do fundo e libere mais acima, mas não forme bolhas.Adicione tamp&atilde;o TE a todas as seis colunas, independentemente dos po&ccedil;os n&atilde;o utilizados. Prepare-se para a transfer&ecirc;ncia para a placa de amplifica&ccedil;&atilde;o de 384 po&ccedil;os conforme descrito no protocolo textual. Ap&oacute;s a conclus&atilde;o das etapas de prepara&ccedil;&atilde;o, coloque luvas duplas novas bem ajustadas e protetores de mangas.Devido às altas taxas de evaporação durante a pipetagem de pequenos volumes, é essencial dispensar a mistura mestra e a amostra de forma eficiente e selar a placa imediatamente. Adicione 2,5 micro litros da mistura mestra de amplificação a uma placa de 384 poços. Placas brancas são usadas aqui para fins de demonstração, mas placas pretas devem ser utilizadas para reduzir a fadiga visual.Transfira 2,5 micro litros do produto pré-amplificado diluído para a placa de 384 poços de acordo com o mapa no protocolo textual. Os dados coloridos mostrados aqui ilustram a sequência de transferência para uma pipeta de canal fixo. Cubra imediatamente a placa firmemente com um selo de folha de alumínio.Descarte as luvas externas e as proteções das mangas. Centrifugue a placa de 384 poços por 20 segundos no girador de placas de PCR. Não remova o selo de folha de alumínio, mas coloque a placa de 384 poços no manipulador líquido.Abra o pacote contendo uma placa de amplificação encapsulada e coloque-a cuidadosamente no manipulador líquido no primeiro compartimento, com o número de série à direita; segure o invólucro pelas bordas sem tocar a superfície da placa. Remova o selo de folha de alumínio da placa de 384 poços dentro do manipulador líquido assim que tudo estiver posicionado. Clique em próximo e, em seguida, marque todas as caixas conforme cada etapa for concluída.Feche a porta do manipulador de líquidos e inicie imediatamente o processo de preenchimento. Permaneça ao lado do manipulador de líquidos e prossiga imediatamente para o próximo passo assim que a placa for preenchida. Enquanto o manipulador de líquidos estiver em funcionamento, remova o filme protetor da parte inferior de uma tampa do recipiente.Mantenha o filme superior no lugar. Prepare a fita vermelha puxando-a levemente para soltá-la do adesivo. Remova a placa de amplificação carregada do manipulador de líquidos e coloque-a suavemente na prensa de placas com o número de série à direita.Coloque a tampa sobre a placa com a extremidade entalhada à direita e o adesivo na parte inferior. Puxe cuidadosamente a alavanca do prensador de placas, fechando-a; a luz piscará por 20 segundos. Não toque no prensador de placas durante este período.Uma vez que a luz fique verde contínua, levante a alavanca e remova cuidadosamente a placa selada segurando-a pelas bordas. Enquanto segura a placa de amplificação selada verticalmente pelas bordas do invólucro, insira imediatamente a ponta da seringa na porta de carregamento na extremidade do invólucro e, em seguida, dispense lentamente o fluido de imersão em um único movimento suave e contínuo para preencher o espaço entre a placa e a tampa. Deixe uma pequena bolha de ar em um canto assim que a placa estiver imersa.Enquanto mantém a placa verticalmente pelas bordas, feche o orifício de carregamento inserindo a tampa no orifício e girando-a no sentido horário, aplicando pressão suficiente até que o cabo se quebre. Limpe o invólucro com um pano isento de fiapos previamente borrifado abundantemente com etanol. Para secar o invólucro, passe um pano limpo no sentido descendente.Leve a placa selada até a máquina de amplificação. Na guia do instrumento, selecione o console do instrumento. Selecione a máquina de amplificação e, em seguida, clique no botão de abrir a porta.Coloque a placa de amplificação no primeiro compartimento do adaptador de placa, verificando se o adaptador está corretamente alinhado com o número um no canto superior esquerdo. Oriente a placa com o código de barras voltado para cima e para a frente do instrumento. Após clicar no botão fechar porta, navegue até a guia inicial na parte inferior da tela.No menu de execução, selecione OpenArray. Clique em obter IDs da placa. Para iniciar a execução, clique em iniciar execução.Abra uma planilha contendo a macro de resultados. No arquivo de dados exportado, clique com o botão direito do mouse na guia na parte inferior da tela e selecione mover ou copiar. No campo para pasta de trabalho, selecione a macro de resultados.Em seguida, clique em mover para o final e marque a caixa com a legenda criar cópia. Por fim, clique em ok. Exclua a guia de exportação antiga e renomeie a guia recém-adicionada como exportação.Clique em exibir, depois em macros, selecione a macro e clique em executar. Em seguida, repita isso para Macro2 clicando em exibir, depois em macros, selecionando Macro2 e clicando em executar. No software da máquina de amplificação, verifique as curvas de cada amostra e controle em comparação com a tabela da macro selecionando análise/gráfico de amplificação no lado esquerdo da tela.Em seguida, selecione a guia amostra e clique em cada amostra para confirmar que existem duas ou três curvas de amplificação positivas para cada um dos resultados positivos na tabela. As leituras de fluorescência são plotadas em função dos ciclos de amplificação para demonstrar que a PCR em tempo real foi realizada com sucesso. A maioria das amostras atingiu níveis de limiar relativos entre os ciclos dois e 25 da reação de PCR em tempo real.Curvas-padrão realizadas em três dias diferentes são representadas graficamente para demonstrar a linearidade e a faixa de amplificação utilizando controles positivos. Os valores do ciclo limiar são representados graficamente em função do logaritmo na base 10 do número de cópias do padrão de ácido nucleico. As duas macros preencherão os nomes das amostras na primeira coluna e a média dos três valores de Ct para cada alvo daquelas com resultados positivos.Os alvos que não amplificaram aparecem em branco nesta tabela. São apresentados resultados quantitativos para 10 amostras clínicas e quatro controles de rotina; como é o caso aqui, o controle negativo de amplificação deve ser negativo para todos os alvos, e o controle negativo de extração deve conter apenas o controle interno. Uma amostra neste conjunto apresenta falha no controle interno, o que indica a presença de inibidores na amostra.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de PCR em escala nanométrica. Este procedimento facilitará a realização de painéis baseados em síndromes em diagnósticos veterinários. Este método pode ser adaptado para incluir ensaios para agentes causadores de muitas doenças infecciosas diferentes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.

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Apresentamos um protocolo que combina amplificação da polimerase recombinase com um sistema CRISPR/Cas12a para detecção de traços de vírus de DNA e constrói microscopia portátil para smartphone com uma classificação assistida por inteligência artificial para detecção de vírus de DNA no local de atendimento.

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Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e econômico para caracterizar genomas do vírus da raiva (RABV) usando a tecnologia de nanoporos. O fluxo de trabalho destina-se a apoiar a vigilância genômica informada em nível local, fornecendo informações sobre linhagens RABV circulantes e sua colocação dentro de filogenias regionais para orientar medidas de controle da raiva.

Sequenciamento do Genoma Completo para Caracterização Rápida do Vírus Rábico Utilizando Tecnologia de Nanoporos

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Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

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Detecção rápida de patógenos bacterianos que causam infecções do trato respiratório inferior por meio de amplificação isotérmica mediada por loop baseada em chip microfluídico

Aqui, descrevemos um procedimento simples e rápido para detectar DNA de patógenos de abelhas, como Lotmaria passim e Nosema ceranae, usando uma lise celular pronta para amplificação, amplificação da polimerase recombinase e ensaios CRISPR/Cas12a.

Detecção de DNA no local de parasitas tripanossomatídeos e Nosema ceranae por meio de lise alcalina acoplada ao sistema RPA/CRISPR/Cas12a

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Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

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