Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

O objetivo geral desta metodologia de teste de PCR em tempo real é detectar patógenos baseados em DNA e RNA juntos de maneira de alto rendimento. O ácido nucléico de amostras clínicas será pré-amplificado com um pool de primers comum carregado em uma placa OpenArray e analisado quanto à presença de patógenos. Esse método pode ajudar a promover os esforços de vigilância do OneHealth para doenças infecciosas.

Comparado com as técnicas tradicionais, esse método permite que mais amostras sejam testadas para mais alvos sem competir entre si, melhorando assim a eficiência do teste. O método usa uma placa PCR personalizada em nanoescala. Os primers e sondas são impressos nas bordas dos orifícios passantes e as amostras são carregadas usando um manipulador de líquidos.

Demonstraremos o método em amostras clínicas sendo testadas para um painel de patógenos respiratórios de cavalos e cães. Para iniciar este procedimento, projete a placa conforme descrito no protocolo de texto. A placa usada aqui é configurada com 18 alvos em triplicado.

Adicione mídia aos cotonetes e lavagens traqueais para que haja pelo menos um a dois mililitros de líquido. Vortex o cotonete e DMEM vigorosamente no tubo. Em seguida, use uma pipeta para transferir aproximadamente 1 mililitro de mídia para um novo tubo.

Adicione 235 micro litros de tampão de lise e 175 micro litros de amostra a cada tubo de cordão. Prossiga com o protocolo do fabricante para extrair o ácido nucléico total. Prepare-se para a transcrição reversa e pré-amplificação de ácido nucléico ou pré-amplificador, conforme descrito no protocolo de texto, verificando primeiro o mapa de amostra.

Adicione 8,5 micro litros de master mix de pré-amplificador e 5,5 micro litros de amostra de DNA/RNA a cada poço de uma placa padrão de 96 poços usando apenas o lado esquerdo da placa. Depois de combinar as amostras, controles positivos e controles negativos com a mistura de pré-amplificador, sele completamente a placa padrão de 96 poços com um selo adesivo transparente. Remova qualquer excesso de vedação usando uma lâmina de barbear para evitar a formação de folgas de vedação durante o ciclo.

Centrifugue a placa selada por 20 segundos usando um centrifugador de placas de PCR. Verifique se todos os reagentes estão combinados no fundo dos poços da placa. Depois de ligar um termociclador convencional, selecione o préampprograma de ciclagem e inicie o programa.

Coloque a placa de 96 poços no termociclador somente quando a parte inferior do termociclador atingir a temperatura necessária para a produção de cDNA, monitorando a leitura da temperatura na tela. Quando o préamp está concluído, verifique se a placa permaneceu selada. Depois de colocar luvas duplas e capas de manga, remova a vedação do préamp placa.

Em seguida, remova e descarte cuidadosamente as luvas externas. Dilua os produtos do pré-amplificador de um a cinco, adicionando 56 microlitros de buffer TE a cada poço das colunas de um a seis do pré-amplificador de 96 poços e misturando pipetando para cima e para baixo. Para isso, vá apenas até a primeira parada da pipeta, aspire por baixo e dispense mais acima, mas não crie bolhas.

Adicione buffer TE a todas as seis colunas, independentemente dos poços não utilizados. Prepare-se para a transferência de 384 poços para a placa de amplificação, conforme descrito no protocolo de texto. Após a conclusão das etapas de preparação, coloque novas luvas duplas e capas de manga bem ajustadas.

Devido às altas taxas de evaporação durante a pipetagem de pequenos volumes, é fundamental dispensar a mistura principal e a amostra com eficiência e selar a placa imediatamente. Adicione 2,5 micro litros de master mix de amplificação a uma placa de 384 poços. Placas brancas são usadas aqui para fins de demonstração, mas placas pretas devem ser usadas para reduzir o cansaço visual.

Transfira 2,5 micro litros do produto pré-amplificador diluído para a placa de 384 poços de acordo com o mapa no protocolo de texto. Os dados coloridos mostrados aqui ilustram a sequência de transferência para uma pipeta de canal fixo. Cubra imediatamente a placa firmemente com um selo de alumínio.

Descarte as luvas externas e as capas das mangas. Centrifugue a placa de 384 poços por 20 segundos no centrifugador de placas de PCR. Não remova a vedação da folha, mas coloque a placa de 384 poços no manipulador de líquidos.

Abra a embalagem que contém uma placa de amplificação encapsulada e coloque-a cuidadosamente no manipulador de líquidos no primeiro slot com o número de série à direita, segure a caixa pelas bordas sem tocar na superfície da placa. Remova a vedação da folha da placa de 384 poços dentro do manipulador de líquidos quando tudo estiver no lugar. Clique em Avançar e marque todas as caixas à medida que cada etapa é concluída.

Feche a porta do manipulador de líquidos e inicie imediatamente o processo de enchimento. Fique ao lado do manipulador de líquidos e prossiga imediatamente para a próxima etapa assim que a placa estiver cheia. Enquanto o manipulador de líquidos estiver funcionando, remova a película protetora da parte inferior da tampa da caixa.

Deixe o filme superior no lugar. Prepare a fita vermelha puxando levemente para soltá-la do adesivo. Remova a placa de amplificação carregada do manipulador de líquidos e coloque-a com cuidado na prensa de placas com o número de série à direita.

Coloque a tampa em cima da placa com a extremidade entalhada à direita e o adesivo na parte inferior. Puxe para baixo a alavanca de pressão da placa fechando-a cuidadosamente, a luz piscará por 20 segundos. Não toque na prensa de chapa durante este tempo.

Quando a luz ficar verde sólida, levante a alavanca e remova cuidadosamente a placa selada, segurando-a nas bordas. Enquanto segura a placa de amplificação selada verticalmente pelas bordas da caixa, insira imediatamente a ponta da seringa na porta de carregamento na extremidade da caixa e, em seguida, distribua o fluido de imersão lentamente em um movimento contínuo suave para preencher o espaço entre a placa e a tampa. Deixe uma pequena bolha de ar no canto assim que a placa estiver imersa.

Enquanto continua a segurar a placa verticalmente pelas bordas, vede a porta de carregamento inserindo o plugue na porta e girando o plugue no sentido horário, aplique pressão suficiente até que a alça se quebre. Limpe a caixa com um pano sem fiapos que tenha sido completamente borrifado com etanol. Para secar o estojo, limpe-o para baixo com um pano limpo.

Traga a placa selada para a máquina de amplificação. Na guia do instrumento, selecione o console de instrumentos. Selecione a máquina de amplificação e clique no botão de porta aberta.

Coloque a placa de amplificação no primeiro slot do adaptador de placa, verificando se o adaptador está alinhado corretamente com um no canto superior esquerdo. Oriente a placa com o código de barras voltado para cima e para a frente do instrumento. Depois de clicar no botão fechar porta, navegue até a guia inicial na parte inferior da tela.

No menu de execução, selecione OpenArray. Clique em obter IDs de placa. Para iniciar a execução, clique em iniciar execução.

Abra uma planilha contendo a macro de resultados. No arquivo de dados exportado, clique com o botão direito do mouse na guia na parte inferior da tela e selecione mover ou copiar. No campo para reservar, selecione a macro de resultados.

Em seguida, clique em mover para o final e marque a caixa rotulada criar cópia. Por fim, clique em OK. Exclua a guia de exportação antiga e renomeie a guia recém-adicionada como exportação.

Clique em exibir, depois em macros, selecione macro e clique em executar. Em seguida, repita isso para Macro2 clicando em exibir e depois em macros, selecionando Macro2 e clicando em executar. No software da máquina de amplificação, verifique as curvas de cada amostra e controle em relação à tabela macro selecionando o gráfico de análise/amplificação no lado esquerdo da tela.

Em seguida, selecione a guia de amostra e clique em cada amostra para confirmar se há duas ou três curvas de amplificação positivas para cada um dos resultados positivos na tabela. As leituras de fluorescência são plotadas em relação aos ciclos de amplificação para ilustrar que a PCR em tempo real foi realizada com sucesso. A maioria das amostras atingiu níveis de limite relativos entre os ciclos dois e 25 da reação de PCR em tempo real.

Curvas padrão executadas em três dias diferentes são plotadas para demonstrar a linearidade e a faixa de amplificação usando controles positivos. Os valores limite do ciclo são plotados em relação à base logarítmica 10 do número de cópias do padrão de ácido nucleico. As duas macros preencherão os nomes das amostras na primeira coluna e a média dos três valores de Ct para cada alvo para aqueles com resultados positivos.

Os alvos que não amplificaram aparecem em branco nesta tabela. São mostrados resultados quantitativos para 10 amostras clínicas e quatro controles de rotina, como é o caso aqui, o controle de amplificação negativa deve ser negativo para todos os alvos e o controle de extração negativo deve conter apenas o controle interno. Uma amostra neste conjunto mostra um controle interno com falha, o que indica a presença de inibidores na amostra.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de PCR em nanoescala. Este procedimento facilitará a execução de painéis baseados em síndrome em diagnósticos veterinários. Este método pode ser adaptado para incluir ensaios para agentes causadores de muitas doenças infecciosas diferentes.