Síntese de cationizada Magnetoferritin para a magnetização ultra-rápida de Células

O objetivo geral deste método é sintetizar uma nanopartícula magnética no interior de uma cápside proteica e, em seguida, funcionalizar a proteína de modo a permitir a ligação rápida da nanopartícula magnética às células. Este método pode ser utilizado para gerar nanopartículas magnéticas que permitam o marcamento magnético rápido e eficiente de células, o que é importante para aplicações como ressonância magnética ou separação celular magnética. A principal vantagem desta técnica é que a magnetização celular pode ser alcançada utilizando baixas concentrações de nanopartículas e tempos curtos de incubação, o que evita possíveis efeitos adversos decorrentes da exposição às nanopartículas.

Para começar, desoxigene 500 mililitros de água desionizada colocando um tubo conectado a um cilindro de gás nitrogênio na água e fechando o recipiente com filme plástico. Em seguida, borbulhe gás nitrogênio por aproximadamente 60 minutos. Aqueça um banho-maria conectado ao vaso reacional de dupla camisa a 65 graus Celsius.

Em seguida, adicione 75 mililitros de tampão HEPES 50 milimolar, pH 8,6, ao vaso de reação. Feche o vaso e desoxigene borbulhando gás nitrogênio pela solução tampão por aproximadamente 20 minutos. Ao mesmo tempo, agite a solução tampão usando um agitador magnético.

Após desoxigenar a solução tampão de HEPES, remova o tubo de nitrogênio do tampão, mantendo-o suspenso sobre a solução para preservar uma atmosfera de nitrogênio. Adicione apoferritina para atingir uma concentração final de 3 miligramas por mililitro. Continue a agitação magnética, mas reduza a velocidade de agitação caso ocorra formação de espuma.

Para a síntese de magnetoferritina, utilize duas bombas de seringa para injetar simultaneamente 10,1 mililitros do precursor de ferro-cobalto e 10,1 mililitros do peróxido de hidrogênio na solução de apoferritina, a uma taxa de fluxo de 0,15 mililitros por minuto. Prossiga com as etapas de síntese conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, carregue a amostra em uma coluna contendo uma matriz catiônica utilizando uma bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 10 mililitros por minuto.

Lave a coluna com aproximadamente 100 mililitros de tampão de corrida utilizando uma bomba de gradiente com uma vazão de 10 mililitros por minuto. Para eluir a proteína, lave a coluna com 150 mililitros de concentrações crescentes de cloreto de sódio e tampão tris a 10 mililitros por minuto. Como a proteína é eluída numa concentração de cloreto de sódio de 500 milimolar, colete-a em frações de 50 mililitros usando um coletor automático de frações.

Concentre os 150 mililitros de magnetoferritina até um volume de aproximadamente dois mililitros utilizando uma unidade de filtração centrífuga de 15 mililitros, seguida por uma unidade de volume de quatro mililitros. Consulte as instruções do fabricante das unidades de filtração centrífuga para um protocolo detalhado deste procedimento. Em seguida, aplique a amostra concentrada em uma coluna de filtração em gel usando um loop de injeção.

Lave a coluna com o tampão de corrida a uma taxa de fluxo de 1,3 mililitros por minuto. Colete frações de seis mililitros utilizando um coletor de frações automatizado. Os monômeros proteicos eluem por último.

Neste ponto, a magnetoferritina purificada pode ser armazenada a quatro graus Celsius até a cationização. Para 10 miligramas de magnetoferritina, pese 374 miligramas de DMPA e dissolva em 2,5 mililitros de tampão MES 200 milimolar. Ajuste o pH da solução para aproximadamente sete usando ácido clorídrico concentrado.

São liberados vapores tóxicos ao ajustar o pH da solução de DMPA com ácido clorídrico. Certifique-se de manipular esses materiais em uma capela de exaustão. Adicione 2,5 mililitros de solução de magnetoferritina a quatro miligramas por mililitro.

Adicione um agitador magnético e agite por duas horas para equilibrar. Após ajustar a solução ao pH 5,0, adicione 141 miligramas de pó de EDC à solução de magnetoferritina DMPA. Continue agitando por três horas e meia.

Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,22 mícrons para remover quaisquer precipitados e diализar a proteína conforme descrito no protocolo do texto. Cultive os hMSCs conforme descrito no protocolo do texto. Lave as células em plaque com dois mililitros de PBS à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione um mililitro da solução esterilizada de magnetoferritina cationizada às células cultivadas antes de incubar pelo período de tempo desejado. Lave as células com PBS e, em seguida, recolha-as adicionando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA e incubando a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após adicionar um mililitro de meio de cultura para inativar a tripsina-EDTA, transfira a solução para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos a 524 vezes G. Descarte o sobrenadante e reconstitua o pellet celular em 0,5 mililitros de tampão de separação magnética.

Em seguida, fixe o ímã no suporte múltiplo e adicione uma coluna de separação magnética ao ímã. Coloque um filtro de pré-separação sobre a coluna. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão de separação magnética ao filtro de pré-separação e deixe escorrer pelo filtro e pela coluna para lavá-los.

Em seguida, posicione um tubo de centrífuga de 15 mililitros sob a coluna e adicione 0,5 mililitros da suspensão celular ao reservatório do filtro da coluna de separação magnética. Quando o reservatório estiver vazio, adicione 0,5 mililitros de tampão de separação magnética. Quando o reservatório esvaziar novamente, adicione mais 0,5 mililitros de tampão de separação magnética.

Repita a lavagem mais uma vez, para um volume total de 1,5 mililitro de tampão de separação magnética. Este passo de lavagem elui todas as células não magnetizadas da coluna. Remova a coluna do ímã e coloque-a em um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, remova o filtro do reservatório da coluna. Adicione 1 mililitro do tampão de separação magnética ao reservatório e, imediatamente, empurre através da coluna utilizando o êmbolo fornecido pelo fabricante. Isso elui as células magnetizadas da coluna para o tubo de centrífuga.

Prossiga para realizar a quantificação de ferro conforme descrito no protocolo textual. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de amostras de magnetoferritina coradas negativamente mostraram que nanopartículas se formaram no interior da gaiola proteica. Medidas de potencial zeta confirmam que a magnetoferritina adquiriu uma carga superficial positiva após a cationização.

Expor células-tronco mesenquimais humanas à magnetoferritina cationizada por um minuto resultou na magnetização de 92% da população celular e na entrega de 3,6 picogramas de ferro por célula. Aumentar o tempo de incubação para 15 minutos resultou na magnetização de toda a população celular. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como sintetizar uma nanopartícula magnética dentro da cavidade da apoferritina adicionando sequencialmente precursores de sal metálico à solução proteica.

E então, como cationizar quimicamente a proteína utilizando o acoplamento com TMPA. Uma vez dominada, a síntese, purificação e cationização da magnetoferritina podem ser realizadas em três dias, se realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante evitar a contaminação por oxigênio e manter a temperatura e o pH corretos durante toda a síntese da magnetoferritina.

Após este procedimento, outras cargas, como pontos quânticos ou agentes terapêuticos, podem ser encapsuladas na jaula de apoferritina cationizada para alcançar uma entrega mais eficiente desses materiais às células. Esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de manipulação magnética celular explorarem a marcação magnética em células que apresentam baixa captação de nanopartículas ou que são muito sensíveis à exposição prolongada a nanopartículas ou a concentrações elevadas dessas partículas.