Síntese de cationizada Magnetoferritin para a magnetização ultra-rápida de Células

O objetivo geral deste método é sintetizar uma nanopartícula magnética dentro de uma gaiola de proteína e, em seguida, funcionalizar a proteína de forma que ela permita a rápida ligação da nanopartícula magnética às células. Este método pode ser usado para gerar nanopartículas magnéticas que permitem a marcação magnética rápida e eficiente das células, o que é importante para aplicações como ressonância magnética ou separação de células magnéticas. A principal vantagem desta técnica é que a magnetização celular pode ser alcançada usando baixas concentrações de nanopartículas e tempos de incubação curtos, o que evita potenciais efeitos adversos devido à exposição às nanopartículas.

Para começar, desoxigene 500 mililitros de água deionizada colocando um tubo conectado a um cilindro de gás nitrogênio na água e selando o recipiente com filme plástico. Em seguida, borbulhe o gás nitrogênio por aproximadamente 60 minutos. Aqueça um banho-maria conectado ao vaso de reação com camisa dupla a 65 graus Celsius.

Em seguida, adicione 75 mililitros de tampão HEPES 50 milimolar, pH 8,6 no recipiente de reação. Feche o recipiente e desoxigene borbulhando gás nitrogênio através da solução tampão por aproximadamente 20 minutos. Ao mesmo tempo, agite a solução tampão usando um agitador magnético.

Depois de desoxigenar a solução tampão HEPES, remova o tubo de nitrogênio do tampão, mantendo-o suspenso sobre a solução para manter uma atmosfera de nitrogênio. Adicione apoferritina para atingir uma concentração final de 3 miligramas por mililitro. Continue a agitação magnética, mas reduza a velocidade de agitação se ocorrer espuma.

Para a síntese de magnetoferritina, use duas bombas de seringa para injetar simultaneamente 10,1 mililitros do precursor de ferro-cobalto e 10,1 mililitros de peróxido de hidrogênio na solução de apoferritina a uma taxa de fluxo de 0,15 mililitros por minuto. Continue com as etapas de síntese conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, carregue a amostra em uma coluna contendo uma matriz catiônica usando uma bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 10 mililitros por minuto.

Lave a coluna com aproximadamente 100 mililitros de buffer de funcionamento usando uma bomba de gradiente a uma vazão de 10 mililitros por minuto. Para eluir a proteína, lave a coluna com 150 mililitros de concentrações crescentes de cloreto de sódio e tampão tris a 10 mililitros por minuto. À medida que a proteína elui a uma concentração de cloreto de sódio de 500 milimolares, colete-a em frações de 50 mililitros usando um coletor de frações automatizado.

Concentre os 150 mililitros de magnetoferritina em um volume de aproximadamente dois mililitros usando uma unidade de filtro centrífugo de 15 mililitros seguida por uma unidade de volume de quatro mililitros. Consulte as instruções do fabricante das unidades de filtro centrífugo para obter um protocolo detalhado deste procedimento. Em seguida, carregue a amostra concentrada em uma coluna de filtração de gel usando um loop de injeção.

Lave a coluna com buffer de corrida a uma taxa de fluxo de 1,3 mililitros por minuto. Colete frações de seis mililitros usando um coletor de frações automatizado. Os monômeros de proteína eluem por último.

Neste ponto, a magnetoferritina purificada pode ser armazenada a quatro graus Celsius até a catição. Para 10 miligramas de magnetoferritina, pesar 374 miligramas de DMPA e dissolver em 2,5 mililitros de tampão MES 200 milimolar. Ajustar o pH da solução para aproximadamente sete utilizando ácido clorídrico concentrado.

Os vapores tóxicos são liberados quando você ajusta o pH da solução de DMPA com ácido clorídrico. Certifique-se de manusear esses materiais em uma capela de exaustão. Adicione 2,5 mililitros de solução de magnetoferritina a quatro miligramas por mililitro.

Adicione um agitador magnético e mexa por duas horas para equilibrar. Depois de ajustar a solução para pH 5,0, adicione 141 miligramas de pó de EDC à solução de magnetoferritina DMPA. Continue mexendo por três horas e meia.

Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,22 mícron para remover quaisquer precipitados e dialisar a proteína conforme descrito no protocolo de texto. Cultura de hMSCs conforme descrito no protocolo de texto. Lave as células revestidas com dois mililitros de PBS em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione um mililitro da solução de magnetoferritina catiônica esterilizada às células plaqueadas antes de incubar pelo período de tempo desejado. Lave as células com PBS e, em seguida, colha-as adicionando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA e incubando a 37 graus Celsius por cinco minutos. Depois de adicionar um mililitro de meio de cultura para inativar a tripsina EDTA, transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos a 524 vezes G. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 0,5 mililitros de tampão de separação magnética.

Em seguida, conecte o ímã ao suporte múltiplo e adicione uma coluna de separação magnética ao ímã. Coloque um filtro de pré-separação na coluna. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão de separação magnética ao filtro de pré-separação e deixe-o passar pelo filtro e pela coluna para lavá-los.

Em seguida, coloque um tubo de centrífuga de 15 mililitros sob a coluna e adicione 0,5 mililitros da suspensão da célula ao reservatório do filtro da coluna de separação magnética. Quando o reservatório estiver vazio, adicione 0,5 mililitros de tampão de separação magnética. Quando o reservatório esvaziar novamente, adicione mais 0,5 mililitros de tampão de separação magnética.

Repita a lavagem mais uma vez, para um volume total de tampão de separação magnética de 1,5 mililitros. Esta etapa de lavagem elui todas as células não magnetizadas da coluna. Remova a coluna do ímã e coloque-a em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Em seguida, remova o filtro do reservatório da coluna. Adicione 1 mililitro do tampão de separação magnética ao reservatório e empurre imediatamente a coluna usando o êmbolo fornecido pelo fabricante. Isso elui as células magnetizadas da coluna para o tubo da centrífuga.

Prossiga para realizar a quantificação de ferro conforme descrito no protocolo de texto. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de amostras de magnetoferritina coradas negativamente mostraram que nanopartículas se formaram dentro da gaiola de proteínas. As medições do potencial zeta confirmam que a magnetoferritina obteve uma carga superficial positiva após a cationização.

A exposição de células-tronco mesenquimais humanas à magnetoferritina catiônica por um minuto resultou na magnetização de 92% da população de células e na entrega de 3,6 picogramas de ferro por célula. Aumentar o tempo de incubação para 15 minutos resultou na magnetização de toda a população de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão de como sintetizar uma nanopartícula magnética dentro da cavidade da apoferritina adicionando sequencialmente precursores de sais metálicos à solução proteica.

E então, como catificar quimicamente a proteína usando o acoplamento TMPA. Uma vez dominada, a síntese, purificação e cátionse da magnetoferritina podem ser feitas em três dias se forem realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante evitar a contaminação por oxigênio e manter a temperatura e o pH corretos durante a síntese de magnetoferritina.

Após esse procedimento, outras cargas, como pontos quânticos ou agentes terapêuticos, podem ser encapsuladas na gaiola de apoferritina catiônica para obter uma entrega mais eficiente desses materiais às células. Essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores no campo da manipulação de células magnéticas explorarem a marcação magnética em células que exibem baixa absorção de nanopartículas ou que são muito sensíveis à exposição prolongada de nanopartículas ou concentrações elevadas de nanopartículas.