Name: A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprenda a desenvolver um imunoensaio baseado em nanopartículas de ouro utilizando espectroscopia UV-Vis e Raman. Este método valida ensaios com dupla detecção óptica e permite personalização para diversas aplicações de pesquisa em nanotecnologia.

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Este trabalho foi apoiado por um Prêmio Catalisador de Pesquisa da Universidade Estadual de Utah. Os autores gostariam de agradecer a Annelise Dykes, Cameron Zabriskie e Donald Wooley por suas contribuições.

1. Preparação de buffers <ol><li> Tampão fosfato salino (PBS) <ol><li> Dilui-se 50 ml de 10x PBS com 450 mL de água de grau HPLC para fazer uma concentração de 1 x PBS. Filtrar em condições estéreis a solução com um filtro de 0,22 um. </li><li> Guardar a solução à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparação de solução salina tamponada TRIS + Tween 20 (TBST) <ol><li> Dilui-se 50 ml de 10x tampão salino Tris (TBS) com 450 ml de água de grau HPLC para fazer uma concentração 1x. Adicionar 250 ul de Tween-20 para uma 0,05% (v / v) de Tween-20. Filtrar em condições estéreis a solução com um filtro de 0,22 um. </li><li> Armazenar em temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparação de Albumina de Soro Humano (HSA) solução de bloqueio <ol><li> Pesar 0,45 g de HSA em 15 ml de PBS estéril filtrada 1x para fazer um 3% w / v de solução de HSA. solução de HSA Vortex até estar completamente dissolvido. </li><li> Loja solução de HSA a 4 ° C. NOTA: Albumina de Soro Bovino(BSA) também pode ser usado como uma solução de bloqueio. </li></ol></li><li> Preparação de anticorpo PEGuilado (PEG-Ab) NOTA: A solução de anticorpo deve ser isento de transportador ou de estabilização de proteínas, tais como BSA, que possam interferir com reacções de conjugação competindo para o n-hidroxissulf (NHS) sítios de ligação. Se o anticorpo entra em uma solução de Tris ou tampão de glicina, ela deve ser submetida a uma permuta de tampão para evitar que as aminas ou sais de amónio de interferir com a reacção de conjugação NHS. Se o anticorpo está numa forma liofilizada, que pode ser novamente suspenso de acordo com a recomendação do fabricante, a uma concentração de 1-10 mg / ml. <ol><li> Para os anticorpos em um tampão Tris ou glicina, realizar uma permuta de tampão de bicarbonato de sódio a 100 mM usando uma coluna de dessalinização. Utilizar o tampão 100 mM para aumentar o pH para aproximadamente 8,5 a acelerar a reacção de conjugação. </li><li> Hidrato de orto-piridildissulfureto-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) com 100 mM soídio bicarbonato para um volume de 1 ml a uma concentração de 1 mg / ml ou maior. NOTA: OPSS-PEG-NHS deve ser feita e usada dentro de aproximadamente 20 min. O grupo NHS do OPSS-PEG-NHS tem uma meia-vida de aproximadamente 20 min, numa solução aquosa a pH 8,5. </li><li> Adicionar OPSS-PEG-NHS para a solução de anticorpo a uma proporção 2: 1 (PEG: Anticorpo) proporção de conjugação para ser utilizado para as amostras de teste. Num tubo de microcentrífuga separados, adicionar OPSS-PEG-NHS para a solução de antigénio numa proporção de 2: 1 a conjugação a ser utilizado para o controlo. NOTA: A proporção de 2: 1 está assumindo uma eficiência de 50% a conjugação. O objectivo é o de identificar cada anticorpo com uma cadeia de PEG. Nesta etapa, o excesso de rotulagem é melhor do que sob a rotulagem. Utilize a seguinte equação para determinar os volumes apropriados de OPSS-PEG-NHS e solução de anticorpo: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> em que V é o volume, C é a concentração expressa em moléculas ou umtibodies por ml. Subscritos PEG e Ab são OPSS-PEG-NHS e anticorpo, respectivamente. O volume final deve ser de aproximadamente 250 ul. </li><li> Incubar solução de PEG-Ab a 4 ° C durante 8 horas ou durante a noite. solução de loja em alíquotas de aproximadamente 25 ul trabalhando a -20 ° C para limitar os ciclos de descongelamento congelamento e certifique-se de usar tubos de ligação baixas. </li></ol></li></ol> 2. Prepare UV-Vis / Raman Sondas <ol><li> Preparar a solução AUNP nua <ol><li> Prepara-se uma solução de AuNPs 2 ml com uma concentração de aproximadamente 1 x 10 11 partículas por ml. <ol><li> Se os AuNPs precisa de ser concentrada, encher tubos de centrifugação de baixa ligação com 2.000 ul de estoque AUNP e centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos ou até que o sobrenadante é clara. Retire o sobrenadante por pipetagem, tomando cuidado para não perturbar o pellet AUNP. </li><li> Juntar as soluções AUNP restantes em um tubo e estimar a Concentração mediante a obtenção de uma medição de UV-Vis e comparando os valores de concentrações conhecidas como esta é uma relação linear. </li></ol></li></ol></li><li> Determinar a proporção rotulagem repórter adequado Raman <ol><li> Preparar uma solução de trabalho do repórter de Raman dissolvido em metanol. Esta concentração irá ser dependente do repórter utilizada. Neste trabalho, preparar iodeto de 3,3&#39;-diethylthiatricarbocyanine (DTTC) a uma solução de trabalho de 200? M. </li><li> Assumindo um volume final de 100 uL de cada poço, adicione uma quantidade de solução de trabalho repórter a cada cavidade da primeira fileira de uma placa de 96 poços de modo a que o repórter Raman irá variar em concentrações de 0,2 uM a 10 uM. Adicionar água suficiente qualidade para HPLC a cada cavidade tal que o volume é de 80 ul. Adicionar 20 ul de cada poço AUNP para fazer um volume final de 100? L para cada cavidade. Um exemplo é apresentado na Tabela 1. </li><li> Medir a espectros UV-Vis a partir de 400 a700 nm utilizando uma placa de leitura de UV-Vis. A concentração adequada é a concentração mais elevada com picos definidos para os espectros de UV-Vis. Repita o passo 2.2.2 em concentrações crescentes até o mais alto índice de concentração de repórteres Raman para AuNPs é encontrado. NOTA: O corante e o AUNP forma, tamanho, e fabricante influenciar a concentração apropriada. Por conseguinte, os passos indicados devem ser avaliados e alterada, dependendo dos componentes usados. Este protocolo envolve a utilização de um corante com carga positiva. Como tal, a ligação entre o AUNP e repórter foi melhorada através da utilização AuNPs carregados negativamente. Isso foi feito através da utilização de citrato tampado AuNPs. Consulte a seção de discussão para mais detalhes. </li></ol></li><li> Encadernação repórter Raman e PEG-Ab para AUNP <ol><li> Preparar dois lotes de 1,5 ml AUNP repórter e Raman, na concentração previamente determinada, permitindo que o repórter Raman para se ligar aos AuNPs durante 30 min à temperatura ambiente.</li><li> Adicionar o anticorpo PEGuilado (PEG-Ab) para um lote de solução repórter AUNP e Raman para criar um 200: 1 razão de anticorpos às partículas. Esta solução será para as amostras de teste. Num tubo de microcentrífuga separados, adicionar o antigénio PEGuilado para o outro lote da solução repórter AUNP e Raman de cada 200: 1 razão de anticorpo de partículas para ser utilizado como o controlo. Incubam-se as soluções durante 30 minutos a temperatura ambiente. NOTA: O rácio de anticorpos às partículas serão específicos para os AuNPs e corante utilizado e deve ser optimizada para cada caso individual. O objectivo aqui é o de ter a maior proporção de anticorpos para as sondas AUNP para se ligar a, evitando a agregação das partículas. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados para adicionar juntos: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> em que V é o volume, C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. a barbatanavolume de al deve ser de aproximadamente 1,5 ml. </li></ol></li><li> Bloco restantes locais na superfície da AUNP com mPEG-SH. <ol><li> Prepare mPEG-SH por dissolução de sólido metoxi polietileno glicol tiol a uma concentração de 200 pM utilizando água. Vortex a solução até mPEG-SH está completamente dissolvido. </li><li> Adicionar mPEG-SH num 40.000: 1 razão para a solução AUNP-PEG-Ab feita no passo 2.3. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 minutos para assegurar que os locais remanescentes no nanopartículas de ouro são bloqueados. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados para adicionar juntos: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> em que V é o volume, C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. O volume final deve ser de aproximadamente 1,5 ml. </li></ol></li><li> Recuperar sondas Raman funcionalizados. <ol><li> partículas de centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos em baixa de ligação centrifuge tubos ou até que o sobrenadante é clara. Retire o sobrenadante por pipetagem tomando cuidado para não perturbar os AuNPs. </li><li> Ressuspender as partículas com 1 ml de solução de PBS 1x que foi feita previamente. Estimar a concentração AUNP por uma medição de UV-Vis de um pequeno volume de solução (3 mL) e comparar os resultados com as medições de concentração AUNP conhecido. Ajustar o volume de tal modo que a solução final é de pelo menos 1 x 10 11 partículas por ml. </li><li> soluções armazenar a 4 ° C até que seja utilizado para a funcionalização da placa de imunoensaio. Use as soluções dentro de uma semana. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Volumes a adicionar de cada componente (ml) </td></tr><tr><td> DCTC concentração final (mM) </td><td> Solução de trabalho de DTTC (200 mM) </td><td> AUNP </td><td> água </td></tr><tr><td> 0,2 </td&gt; <td> 0,1 </td><td> 20 </td><td> 79,9 </td></tr><tr><td> 0,6 </td><td> 0,3 </td><td> 20 </td><td> 79,7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 20 </td><td> 79,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1.0 </td><td> 20 </td><td> 79 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2.5 </td><td> 20 </td><td> 77,5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 3,5 </td><td> 20 </td><td> 76,5 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 75 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. DCTC exemplo diluição. Várias diluições de DCTC e os volumes associados de estoque DCTC, solução de nanopartículas de ouro e água. 3. Imunoensaio placa preparação <ol><li> Ligar o antigénio desejado para a placa de imunoensaio. <ol><li> Prepare antigénio diluído suficiente (50 ug / ml) para encher os poços de poliestireno. Vortex a solução,e adicione imediatamente a solução para os poços da placa. Permitir que o antigénio para se ligar às placas durante 1 hora à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavar antígenos não ligados. <ol><li> Remover a solução com excesso de antigénio pelo dumping solução em um recipiente adequado e batendo a placa contra uma mesa de papel-coberto de toalha. </li><li> Adicionar TBST aos poços para lavar a superfície, em seguida, remover a lavagem da mesma maneira como indicado previamente. Repita este passo mais duas vezes. </li></ol></li><li> Bloco restantes locais de ligação na placa para evitar a ligação não específica. <ol><li> Adicionar 70 ul de solução de bloqueio de HSA a cada poço da placa e incubar à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Remover e lavar a placa usando o mesmo procedimento, tal como especificado no passo 3.2. Cobrir a placa e seco para guardar a 4 ° C até que esteja pronto para uso posterior. </li></ol></li><li> Funcionalizar placa de imunoensaio. <ol><li> Adicionar 70 ul de tele sondar nanopartículas preparada na secção 2 para a primeira coluna de uma placa de 96 poços e diluir colunas subsequentes usando uma diluição de 1: 2 em série. Permitir que a placa a incubar durante pelo menos 1 h. Um exemplo de como preparar a placa de imunoensaio é dada na Figura 3. </li><li> Lavar a placa com TBST cinco vezes, conforme detalhado nas etapas 3.2, certificando-se de dispor dos AuNPs adequadamente. Após a lavagem final, adicionar 70 ul de 1x PBS a cada poço e cobrir com um selo de placa. NOTA: As amostras de controlo deve ser clara. Se tiver ocorrido a ligação não específica, as amostras de controlo terá uma cor semelhante à das amostras de ensaio. </li></ol></li><li> Teste de sensibilidade do ensaio por UV-Vis e espectroscopia Raman. <ol><li> Para cada poço, medir o espectro de UV-Vis que varia de 400 a 700 nm utilizando uma placa de leitura de UV-Vis. </li><li> Utilizando um microscópio invertido de Raman, concentrar o objectivo para a superfície do poço que tem as sondas AUNP. obtain um espectro de Raman do bem. Recolhe um espectro variando de 1.800 cm-1 e 400 cm-1. Repita este passo para todos os poços. </li><li> Usando um software de espectro adequado, executar uma ordem de correção de linha de base polinomial 11 th para os espectros Raman e uma polinomial de 3ª ordem para o UV-Vis. </li><li> Usando um software de espectro adequado, normalizar o Raman e UV-Vis. Defina o valor máximo a 1 e escalar todos os outros valores em conformidade. Para normalizar os espectros Raman, selecione um pico de poliestireno única e defini-lo igual a 1 e escalar todos os outros valores em conformidade. </li><li> Usando um software de espectro adequado, realizar a integração de pico para cada espectro. Para espectros de Raman, o pico representando o repórter Raman deve estar ausente numa região de picos de poliestireno. Para realizar a integração de pico, especifique os limites integrais para o pico desejado e gravar a área do pico desejado para todas as amostras, incluindo os controles. </li><li> Plot a área média de pico de interesse como uma função do log da concentração AUNP com barras de erro para cada ponto indicando o seu desvio padrão associado. Encaixe estes pontos de calibração para uma curva logística de 4 parâmetros. </li><li> Determinar o valor médio da peça em bruto através da média da área do pico de interesse para uma amostra em branco. Determinar o desvio padrão destas áreas; este é o desvio padrão da peça em bruto. </li><li> Para o mesmo pico analisados ​​na etapa anterior, encontrar o desvio padrão do que a área de pico para a concentração mais baixa. </li><li> Calcular o limite do limite branco e inferior de detecção, conforme especificado na seção de resultados Representante. Use esses valores com as curvas de calibragem 4PL para determinar a LLOD em termos de concentração AUNP. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

No protocolo detalhado, existem vários pontos críticos para tratar. Uma questão é a escolha do repórter Raman e nanopartículas de ouro. Embora o protocolo foi escrito para ser adaptado para o uso individual, a Raman DCTC repórter foi utilizada como um exemplo. DTTC é um repórter carregado positivamente e se liga a superfícies tais como citrato tampado AuNPs carregado negativamente. Este protocolo pode ser adaptado para repórteres negativamente carregados usando nanopartículas de ouro com uma carga de superfície positiva...

imunoensaios de sanduíche típicos indirectamente detectar a presença de um antigénio utilizando dois anticorpos. O anticorpo de captura está ligada a uma superfície sólida e forma um complexo anticorpo-antigénio quando em proximidade com um antigénio apropriado. Um anticorpo de detecção é então introduzida e liga-se ao antigénio. Após a lavagem, o anticorpo / antigénio / anticorpo e continua a ser complexo é detectada pelo anticorpo de detecção marcado, como demonstrado na Figura 1A. Detecção típica é feita por um detector fluorescente ou colorimétrico, o que limita a multiplexagem 10 substância a analisar devido aos picos largos espectrais 2,3. Em contraste, os sistemas baseados em Raman têm picos de emissão muito estreitos, resultando em capacidades de multiplexação reforçadas com fontes que reivindicam a detecção simultânea de até 100 analitos 2,3. Muitas fontes bibliográficas estão disponíveis, que abrangem aspectos importantes relacionados com imunoensaios 4-6, como passo-a-passodetalhes para criar kits personalizados ELISA. Infelizmente, estes protocolos são para a detecção fluorescente ou colorimétrico, limitando a capacidade de multiplexação de imunoensaios personalizadas. Para atender a essa necessidade, apresentamos um procedimento detalhado para fabricar o UV-Vis / Raman imunoensaio publicado anteriormente 7 para um imunoensaio directo conforme ilustrado na figura 1B. Este protocolo inclui a fabricação de sondas de nanopartulas de ouro baseia-funcionalizado, ilustrada na Figura 2. O procedimento para fazer as sondas / UV-Vis Raman começa pela ligação repórteres Raman para a superfície de nanopartículas de ouro (AuNPs). Os AuNPs são depois funcionalizadas com anticorpos que estão associadas com polietileno glicol (PEG). Os restantes locais de ligação no AuNPs são bloqueadas por ligação tiol metoxi polietileno glicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar a ligação não-específica subsequente durante a análise. As sondas AUNP preparadas são testada por ligação a antigéniosfixa-se aos poços de uma placa de poliestireno, tal como ilustrado na Figura 1B. Após lavagem da placa, as sondas AUNP são detectados utilizando espectroscopia de UV-Vis, enquanto os repórteres Raman associados são detectados com espectroscopia de Raman. Combinando os dados UV-Vis e Raman espectral fornece dois métodos de análise, reforçando as capacidades deste imunoensaio.

<table><tbody><tr><td>Nanopartícula de ouro de 60 nm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>Estas são nanopartículas de ouro com tampa de citrato. Por favor, veja a discussão para a relação entre o repórter Raman e a carga de superfície AuNP e sua importância para a seleção adequada do repórter AuNP e / ou Raman.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Salino Tamponado (10x) pH 7.5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtração Superior de Garrafa</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polissorbato 20)</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>Usado como agente emulsificante para etapas de lavagem.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 10x concentrado, pH 7.4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>Tubo LoBind de Proteína 2.0&nbsp; ml</td><td>Eppendorf Tubes</td><td>22431102</td><td>tubos LoBind evitam a ligação de proteínas e AuNPs às superfícies dos tubos.</td></tr><tr><td>Tubo LoBind de Proteína 0.5&nbsp; ml</td><td>Eppendorf Tubes</td><td>22431064</td><td>tubos LoBind evitam a ligação de proteínas e AuNPs às superfícies dos tubos.</td></tr><tr><td>Dispositivos de microplaca UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>Usado para selar e armazenar placas funcionalizadas.</td></tr><tr><td>Placa de ensaio, com tampa de baixa evaporação, 96 poços de fundo plano</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>HPLC grau de água</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Dietiltiatricarbocianina iodeto (DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>Raman repórter</td></tr><tr><td>mPEG-Thiol, MW 5.000 - 1 grama</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1&nbsp; grama</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td><td>OPSS-PEG-SVA tem uma extremidade do NHS.</td></tr><tr><td>IgG de camundongo, controle de molécula inteira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>Antígeno</td></tr><tr><td>Cabra anti-IgG de camundongo (H + L) Anticorpo secundário adsorvido cruzado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31164</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Solução de bloqueio de albumina de soro humano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1887-1G</td> A <td>albumina de soro bovino pode ser usada em seu lugar.</td></tr><tr><td>Mini Centrífuga</td><td>Fisher Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de Dessalinização</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>Construído internamente 785&nbsp; unidade de microscópio Raman invertido nm</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Um microscópio Raman invertido é melhor para focalização adequada na superfície da placa do poço. Caso contrário, uma ampliação muito baixa será usada devido à altura da placa de 96 poços. Um sistema construído internamente foi usado, pois era mais barato do que comprar de um fornecedor. No entanto, qualquer sistema de microscópio Raman invertido disponível comercialmente pode ser usado.</td></tr></tbody></table>

a fabricação de um uv-vis e espectroscopia raman de plataforma imuno

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Os imunoensaios são usados ​​para detectar as proteínas com base na presença de anticorpos associados. Devido à sua ampla utilização na pesquisa e na clínica, uma grande infra-estrutura de instrumentos e materiais de imunoensaio pode ser encontrado. Por exemplo, 96 e 384 poços placas de poliestireno estão disponíveis comercialmente e têm um desenho padrão para acomodar máquinas de espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-VIS) de vários fabricantes. Além disso, uma grande variedade de imunoglobulinas, etiquetas de detecção, e os agentes de bloqueio para os desenhos de imunoensaio personalizadas, tais como ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) estão disponíveis. Apesar da infra-estrutura existente, kits de ELISA convencionais não satisfazem todas as necessidades de pesquisa, o que requer o desenvolvimento de imunoensaio individualizado, o que pode ser caro e demorado. Por exemplo, kits de ELISA têm baixa multiplexação (detecção de mais do que um analito ao mesmo tempo) como capacidades que geralmente dependem de fluorescência ou colorimetric métodos para a detecção. Colorimétrico e análises fluorescentes baseados em ter capacidades de multiplexação devido a grandes picos espectrais limitados. Em contraste, os métodos baseados em espectroscopia Raman tem uma capacidade muito maior para a multiplexação devido a picos de emissão estreitas. Outra vantagem da espectroscopia Raman é que os repórteres Raman experimentar significativamente menos fotodegradação do que marcadores fluorescentes 1. Apesar das vantagens que os repórteres Raman têm mais de marcadores fluorescentes e colorimétricos, protocolos para fabricar imunoensaios baseados em Raman são limitadas. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para preparar sondas funcionalizadas para usar em conjunto com placas de poliestireno para detecção direta de analitos por análise de UV-Vis e espectroscopia Raman. Este protocolo permitirá aos investigadores ter uma abordagem do-it-yourself para a detecção futuro multi-analito enquanto capitalizando sobre a infra-estrutura pré-estabelecida.

Neste estudo, 60 nm de partículas de ouro foram utilizados para a espectroscopia UV-Vis. UV-Vis espectros de absorção de 400 a 700 nm foram recolhidos e as áreas dos picos correspondentes a cada concentração AUNP foram determinados utilizando um software de análise espectral de fonte aberta 8. Antes de se atingir o pico de integração, os espectros recolhidos foram submetidos a correcção da linha de base utilizando um ajuste polinomial de três pontos. As áreas de pico foram usadas para gerar uma curva de calib...

As sondas ópticas baseadas em nanopartículas foram projetadas como um veículo para detectar antígenos usando espectroscopia Raman e UV-Vis. Aqui descrevemos um protocolo para preparar tais sondas para um imunoensaio de espectroscopia UV-Vis / Raman de forma a incorporar futuros recursos de multiplexação.

A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar o desenvolvimento de um imunoensaio personalizável baseado em nanopartículas de ouro, capaz de ser analisado por espectroscopia UV-Visível e Raman. O uso de dois métodos ópticos fornece validação interna do ensaio e aumenta a sua flexibilidade. Este método responde a questões fundamentais sobre o desenvolvimento de um imunoensaio baseado em nanopartículas de ouro.Explica como a funcionalização da nanopartícula é usada neste ensaio e influenciará a absorção óptica e a dispersão da luz. Este protocolo é único porque incorpora materiais encontrados em laboratórios de pesquisa típicos para fabricar uma plataforma de imunoensaio que pode ser personalizada de acordo com as necessidades individuais de pesquisa. O imunoensaio baseia-se na espectroscopia UV-Vis e na espectroscopia Raman.A utilização da espectroscopia Raman é superior aos métodos fluorescentes ou colorimétricos, pois possui bandas mais estreitas, permitindo a detecção de múltiplos biomarcadores simultaneamente. Para começar, hidrate o agente bifuncional de reticulação ou o PEG-NHS de pirodil dissulfeto em 100 mL de bicarbonato de sódio. A extremidade orto-piridílica se ligará à superfície da nanopartícula de ouro e a extremidade NHS reagirá com amina primária na superfície da proteína após a ativação.Certifique-se de preparar a solução de reticulação cerca de 20 minutos antes de utilizá-la. Em seguida, adicione o reticulador bifuncional à solução de anticorpo numa proporção de conjugação de 2 para 1. Certifique-se de que a solução de anticorpo esteja livre de proteínas carreadoras que possam interferir na reação.Em um tubo de microcentrífuga separado, adicione o cross-linker bifuncional à solução de antígeno na mesma proporção que será utilizada para o controle. A proporção de 2 para 1 assume uma eficiência de conjugação de 50%. O objetivo é marcar cada anticorpo com uma única cadeia de peg.Nesta etapa, é melhor rotular em excesso do que rotular insuficientemente. Por fim, incubar a solução de anticorpo pegilado a quatro graus Celsius por oito horas. Armazenar alíquotas de 25 microlitros da solução em tubos de baixa ligação a menos 20 graus Celsius para limitar os ciclos de congelamento e descongelamento.Utilize cada alíquota conforme necessário. Para preparar as sondas de Raman, primeiro prepare dois lotes de 1,5 mL de nanopartículas de ouro sobre o repórter de Raman com as concentrações determinadas conforme descrito no protocolo de texto complementar. Isso é feito combinando as soluções do repórter de Raman e das nanopartículas de ouro e permitindo que se liguem por trinta minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione a solução de anticorpo pegilado a uma das soluções de nanopartículas de ouro ligadas ao marcador para criar uma proporção de 200 para 1 de anticorpos em relação às partículas. Essa solução será utilizada para as amostras de teste. Em um tubo microcentrífugo separado, adicione um antígeno pegilado à outra solução de nanopartículas de ouro ligadas ao marcador numa proporção de 200 para 1 de antígeno em relação às partículas, a ser utilizada como controle.Incube ambas as soluções por trinta minutos à temperatura ambiente. Em seguida, bloqueie os sítios remanescentes na superfície da nanopartícula. Para isso, primeiramente dissolva o tiol de metoxipolietileno glicol sólido até uma concentração de 200 micromolar utilizando água HPLC.Vortex a solução até que o tiol esteja completamente dissolvido. Em seguida, adicione a solução de tiol em uma proporção de 40.000 para 1 às soluções de anticorpos pegilados ligados a nanopartículas e incube a mistura à temperatura ambiente por dez minutos para garantir que os sítios remanescentes na nanopartícula de ouro sejam bloqueados. A seguir, recupere as sondas Raman funcionalizadas por centrifugação das partículas em tubos de centrifugação de baixa ligação, de modo que o sobrenadante fique límpido.Remova o sobrenatante por pipetagem, mas tenha cuidado para não perturbar as nanopartículas. Em seguida, re-suspenda as nanopartículas com 1 mL de PBS. Estime a concentração das nanopartículas de ouro realizando uma medida no espectro visível-UV a partir de cerca de 3 microlitros da solução e compare os resultados com os obtidos a partir de uma concentração conhecida de nanopartículas de ouro, pois essa é uma relação linear.Se as nanopartículas não forem bloqueadas adequadamente, elas irão se aglomerar devido às forças de adesão entre partículas, o que indica que os reagentes foram adicionados em concentrações incorretas. Normalmente, a solução apresenta uma coloração vermelha intensa, mas a aglomeração produz uma tonalidade acinzentada. Ajuste os volumes de modo que as soluções finais tenham pelo menos 1 × 10¹¹ partículas por mililitro e armazene as soluções a quatro graus Celsius até que sejam utilizadas para funcionalizar a placa do ensaio amino.Utilize estas soluções dentro de uma semana. Primeiro, prepare uma quantidade suficiente do antígeno diluído para preencher as cavidades de poliestireno. Em seguida, agite a solução em vórtex e adicione-a imediatamente às cavidades da placa.Deixe o antígeno ligar-se às placas por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução em excesso do antígeno descartando-a e batendo a placa contra uma superfície coberta com toalha de papel. Adicione TBST aos poços para lavar a superfície e, então, remova a solução de lavagem descartando-a novamente e batendo a placa contra uma superfície coberta com toalha de papel.Em seguida, bloqueie os sítios de ligação remanescentes na placa para prevenir ligação não específica, adicionando 70 microlitros de solução bloqueadora de HSA a cada poço da placa e incubando a placa em temperatura ambiente por trinta minutos. Em seguida, remova a solução bloqueadora e lave a placa três vezes com TBST, conforme demonstrado anteriormente. Após remover a última lavagem, cubra a placa e armazene-a seca a quatro graus Celsius até seu uso posterior.Adicione 140 microlitros das nanopartículas do marcador previamente preparadas na primeira coluna de uma placa de 96 poços. Coloque as nanopartículas de teste nas cinco primeiras linhas e, em seguida, as nanopartículas controle nas três últimas linhas. Adicione 70 microlitros de PBS a todas as demais colunas.Dilua cada coluna utilizando uma diluição serial de 1 para 2. Comece retirando 70 microlitros da primeira coluna e misturando com a segunda. Em seguida, retire 70 microlitros da segunda coluna e adicione à terceira, e assim por diante.Deixe a placa incubar por pelo menos uma hora. Em seguida, remova as sondas de nanopartículas não ligadas e lave a placa cinco vezes com TBST, conforme demonstrado anteriormente. Após a última lavagem, adicione 70 microlitros de PBS a cada poço e cubra a placa com um selante para placas.Verifique se as amostras controle estão claras. Se houver ligação não específica, as amostras controle terão uma cor semelhante à das amostras de teste. Para cada poço, utilize um espectrofotômetro UV-Visível de leitura em placa para medir os espectros no intervalo de 400 a 700 nanômetros.Usando um microscópio Raman invertido, foque o objetivo na superfície do poço que contém as sondas de nanopartículas de ouro. Obtenha um espectro Raman do poço. Colete um espectro variando de 1800 cm⁻¹ a 400 cm⁻¹ e repita isso para cada poço.Por fim, siga os passos na seção final do protocolo de texto acompanhante para determinar a sensibilidade da montagem. Partículas de ouro de 60 nanômetros foram preparadas conforme descrito neste vídeo. Em seguida, foram analisadas utilizando espectroscopia UV-Visível e espectroscopia Raman.As áreas dos picos onde cada concentração de nanopartículas de ouro foi determinada foram analisadas utilizando um software aberto de análise espectral e foram usadas para gerar uma curva de calibração logarítmica como a mostrada aqui. Com base nesses dados, o limite inferior de detecção foi determinado em 3,5 picomolar para a detecção UV-Visível e 1,7 picomolar ao utilizar espectroscopia Raman. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como personalizar ensaios imunoenzimáticos baseados em sondas de nanopartículas utilizando espectroscopia UV-Vis e Raman.

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Biochemistry

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