SILAC Based proteômica Caracterização de exossomas de HIV-1 células infectadas

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar o proteoma exossômico de células infectadas pelo HIV-1. Este método pode ajudar a responder à questão-chave no campo da biologia dos exossomos, como o efeito de tensões externas na composição do proteoma do exossomo. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aprendida mesmo com uma formação limitada em proteômica e biologia de exossomos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a infecção pelo HIV, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como infecções bacterianas. A linhagem celular H9 é usada neste experimento, embora várias linhas celulares possam ser usadas, desde que estejam em estágio de proliferação ativa e sejam suscetíveis à condição de teste de escolha. Semear duas vezes 10 até ao sexto estádio nove células em cada um dos dois frascos de cultura de células.

Cultive uma população em 10 mililitros de meio rotulado contendo 10% de FBS estilizado, 100 miligramas por litro de L-lisina marcada com C13 e 100 miligramas por litro de L-arginina marcada com C13 e N15. Aumente a outra população em 10 mililitros de meio não rotulado com 10% de FBS estilizado, L-lisina e L-arginina. Cultive as células por seis duplicações, ponto em que as proteínas das células no meio marcado são mais de 99% marcadas com aminoácidos pesados.

Adicione novas mídias ou altere as mídias em intervalos de tempo regulares, dependendo do tipo de células. No final da rotulagem, aumente o volume da cultura para 30 mililitros para acomodar o crescimento de mais células. Infecte as células marcadas com a cepa NL4-3 do HIV-1 usando um protocolo padrão de infecção por HIV-1.

Adicione uma quantidade apropriada de vírus às células e incube por 48 horas enquanto as células não marcadas continuam a crescer em meio não marcado sem infecção pelo HIV-1. No final da infecção pelo HIV-1, os sobrenadantes de ambas as populações de células são colhidos para isolamento de exossomos. Coletar os sobrenadantes das culturas em tubos cônicos de 50 mililitros, evitando as células.

Centrifugue por 10 minutos a 300 vezes g e quatro graus Celsius para remover as células restantes. Recolher os sobrenadantes em novos tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugar durante 10 minutos a 2 000 vezes g para remover as células mortas. Transfira os sobrenadantes resultantes para tubos comerciais compatíveis com rotor que sejam capazes de suportar a ultracentrifugação.

Certifique-se de equilibrar os tubos da ultracentrífuga. Centrifugue os tubos por 30 minutos a 10.000 vezes g para remover os detritos celulares. Recolher os sobrenadantes em novos tubos de ultracentrifugação.

Centrifugue durante 70 minutos a 100 000 vezes g. Rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda cada pellet rico em exossomos em cinco mililitros de PBS fresco e transfira a solução para um tubo de ultracentrífuga novo.

Centrifugue novamente por 70 minutos a 100.000 vezes g. Após o giro final, descarte o sobrenadante. Os pellets de células estão agora prontos para extração de proteínas.

Para iniciar este procedimento, dissolva cada pellet exossômico isolado em 100 a 200 microlitros de fer-pa-lai-ses e tampão de extração com inibidores de protease adicionados que podem inibir uma gama completa de proteases. Centrifugar as soluções dissolvidas durante 10 minutos a 13 000 vezes g e a quatro graus Celsius. Transfira os sobrenadantes limpos para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Depois de quantificar a concentração de proteína de cada amostra por ensaios padrão, misture quantidades iguais de proteínas das amostras marcadas e não rotuladas. Execute a mistura igual em um gel de quatro a 20% SDS-PAGE por 30 minutos. Manchar o gel com azul de Coomassie seguido de descoloração.

Usando uma lâmina de barbear, corte a faixa de amostra do gel e, em seguida, corte a faixa de gel em 10 a 15 pedaços iguais. Coloque cada peça em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para um total de 10 a 15 tubos e continue com o procedimento de extração de proteínas conforme descrito no protocolo de texto. Os procedimentos para análise de dados proteômicos não serão demonstrados, mas estão resumidos neste fluxograma.

As proteínas extraídas são primeiro analisadas por cromatografia líquida, espectroscopia de massa em tandem e a qualidade dos dados é avaliada. Em seguida, os dados são pré-tratados removendo proteínas que possuem menos de dois peptídeos quantificados. Proteínas significativamente reguladas positivamente e negativamente são então identificadas.

Finalmente, as réplicas dos candidatos significativos são comparadas para obter consistência e os dados de todas as réplicas são mesclados. Para iniciar a caracterização das proteínas identificadas, use seus números de acesso do GenBank ou IDs UniProt para pesquisar nos bancos de dados de exossomos atuais. A ExoCarta será usada nesta demonstração.

Clique em query e insira o nome do gene ou proteína ou o número de acesso. Qualquer evidência em exossomos verifica que as proteínas candidatas foram encontradas anteriormente em exossomos e adiciona uma camada de confiança de que as candidatas estão de fato em exossomos. Em seguida, pesquise os candidatos no banco de dados de interação entre HIV-1 e proteína humana.

Na entrada do nome de domínio da proteína, insira os nomes ou números de acesso do candidato e clique em pesquisar. Os resultados da pesquisa podem fornecer informações sobre as interações entre o HIV-1 e os candidatos a proteínas e sugerir quais dos candidatos podem estar verdadeiramente associados ao HIV-1. O terceiro passo é obter uma visão global sobre os candidatos usando uma ontologia genética ou software de análise GO, como o fun-brich.

Em análise de enriquecimento, clique em adicionar conjunto de dados e carregue os números de acesso do GenBank ou IDs UniProt dos candidatos e, em seguida, selecione o tipo de gráfico para visualizar a análise GO. Os resultados da análise GO são visualizados na forma de gráficos de pizza que fornecem informações sobre as proteínas candidatas nas áreas de processo biológico, componente celular e função molecular. O próximo passo é identificar termos GO estatisticamente super-representados por meio da análise DAVID.

Clique na ferramenta de anotação funcional, insira a lista de candidatos e selecione o identificador do gene, como o UniProt ID.Selecione a lista de genes e pesquise. Quando a pesquisa estiver concluída, clique na página de resultados do resumo da anotação na categoria ontologia genética para visualizar os termos GO enriquecidos, valores-p e outros parâmetros. Finalmente, investigue possíveis interações proteína-proteína e possíveis vias bioquímicas usando o banco de dados STRING de acesso aberto.

Insira o ID ou sequência da proteína na caixa de pesquisa designada e selecione a espécie correta para análise. Clique em pesquisar. Os resultados fornecerão informações sobre associações diretas e indiretas.

As 10 principais correspondências conhecidas para o candidato exossômico exibidas nos resultados devem ser consideradas para uma seleção significativa de candidatos. São mostrados resultados representativos de uma análise DAVID de um conjunto de 14 proteínas. O enriquecimento do processo biológico indicou que os processos relacionados à morte celular são significativamente enriquecidos.

O enriquecimento do componente celular mostra muitas proteínas com origem intracelular, e o enriquecimento da função molecular identificou um papel na ligação às proteínas para a maioria dos candidatos. A cadeia da L-lactato desidrogenase B ou LDHB foi selecionada como a candidata mais significativa, e a análise STRING identificou os 10 principais parceiros interagentes da LDHB. A maioria dos parceiros LDHB também estava funcional e localmente relacionada aos exossomos no HIV-1.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de executar cada etapa na temperatura e condição corretas. Seguindo este procedimento, outros métodos, como o isolamento de afinidade, podem ser realizados para confirmar as previsões da análise bioinformática.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo exossômico explorarem as mudanças no proteoma exossômico associadas às infecções por HIV-1 em biologia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o exossomo da cultura de células, analisar seus proteomas e investigar sua associação com o HIV. Não se esqueça, trabalhar com HIV ou outro agente infeccioso pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.