Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto.

O objetivo geral deste protocolo é estabelecer culturas gliais mistas primárias de medulas espinhais de camundongos adultos para estudos in vitro. Este método nos fornece um sistema in vitro para investigar os papéis das células gliais em doenças neurológicas que envolvem alterações patológicas na medula espinhal, como dor neuropática e esclerose múltipla. A principal vantagem desta técnica é que as culturas gliais são preparadas a partir da medula espinhal de camundongos adultos, fornecendo um sistema que reflete com mais precisão as condições in vivo.

Demonstrando o procedimento estará Jennifer Malon, uma técnica do meu laboratório. Trabalhando em uma coifa de cultura de tecidos, transfira quatro medulas espinhais de camundongos para uma placa de Petri de HBSS. Use tesouras e fórceps estéreis para cortar cada uma das medulas espinhais em pedaços pequenos.

Em seguida, transfira os pedaços para um tubo cônico de 50 milímetros contendo a mistura de enzimas Papaína DNAse. Evite transferir HBSS para a mistura enzimática, pois isso pode resultar em diminuição do desempenho da enzima. É crucial que os pedaços de tecido sejam bem digeridos para obter uma única suspensão celular.

No entanto, a digestão excessiva resultará em menos células viáveis. Cada laboratório precisa realizar testes piloto para determinar o tempo exato de digestão com base no que funciona melhor para suas células. Em seguida, subtraia suavemente o tubo e incube a 37 graus Celsius por uma hora com agitação orbital a 150 rotações por minuto.

Após a incubação, faça um vórtice no tubo e, em seguida, triture vigorosamente o tecido usando uma pipeta de cinco mililitros para promover uma maior dissociação. Em seguida, transferir a suspensão da célula para um tubo de 15 mililitros e centrifugar durante 300 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Durante a centrifugação, a 300 microlitros de solução inibidora de albumina ovomucóide reconstituída para 2,7 mililitros de ABSS em um tubo estéril e misture bem.

Em seguida, adicione 150 microlitros de solução de DNAse. Após a centifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular no inibidor de albumina ovomucóide recém-preparado e na solução de DNAse. Vórtice bem para quebrar o pellet celular.

Em seguida, adicione três mililitros de solução inibidora de albumina ovomucóide reconstituída, sem DNAse, à suspensão celular. Centrifugue as células a 70 x g durante seis minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, remova o sobrenadante, que contém fragmentos de membrana, e retenha o pellet.

Para remover a mielina das células dissociadas da medula espinhal, primeiro adicione oito mililitros de meio de densidade de gradiente de 20% à temperatura ambiente no tubo que contém o pellet celular e o vórtice suavemente. Em seguida, centrifugue as células a 800 x g por 30 minutos em temperatura ambiente sem quebrar. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente a camada superior de detritos, que contém principalmente mielina e o sobrenadante, deixando o pellet.

Para remover qualquer gradiente de densidade remanescente, lave as células ressuspendendo o pellet com oito mililitros de cDMEM diluído com HBSS. Centrifugue as células a 400g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e lave as células com cDMEM diluído como antes.

Após a remoção do sobrenadante, o pellet pode ser armazenado no gelo até a semeadura das células. Quando estiver pronto para o plaqueamento, ressuspenda as células em 14 mililitros de cDMEM, suplementado com 2-mercaptoetanol. E adicione um mililitro da suspensão celular a cada poço em uma placa de 12 poços.

Poços extras de placa que podem ser usados para determinar o número médio de células por poço e o conteúdo microglial da cultura. Uma vez que as células tenham sido plaqueadas, incube as células a 35,9 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Troque o meio no dia 1, que é o dia seguinte ao revestimento.

Algumas células estão presas à placa de cultura, mas ainda são em sua maioria redondas. Existem também muitas células flutuantes e detritos significativos. Repita a mudança de meio três a quatro dias depois até que as células estejam prontas para o tratamento entre os dias 12 e 14.

Células gliais mistas de camundongos C57 pretos adultos foram cultivadas a 37 graus Celsius ou 35,9 graus Celsius e analisadas por citometria de fluxo. Como você pode ver, não há diferença óbvia no total de populações de células nessas temperaturas. Esses gráficos representativos mostram as populações de micróglia CD45 positivas para CD11b isoladas do total de populações de células mostradas anteriormente.

Este número demonstra que um conteúdo microglial mais alto pode ser obtido quando a glia mista é cultivada a 35,9 graus Celsius, em vez de 37 graus Celsius. Culturas gliais mistas da medula espinhal adulta foram preparadas a partir de seis camundongos pretos C67. Imagens representativas das células cultivadas nos dias um, quatro, oito e 12 são mostradas.

Imagens que mostram o progresso típico da cultura, além de demonstrar a importância da mídia, mudam no primeiro dia do estabelecimento pós-cultura. Uma vez dominada, a configuração inicial da cultura de células de glia mista pode ser concluída em cerca de quatro horas, se realizada corretamente. Após o estabelecimento da cultura mista da glia, as culturas empobrecidas da microglia e enriquecidas com microglia podem ser obtidas a partir dessa população mista inicial.

No entanto, o rendimento de células enriquecidas com microglia será limitado, a menos que um grande número de medulas espinhais seja usado para estabelecer culturas. Esta técnica foi inicialmente projetada para investigar os papéis das células gliais durante o desenvolvimento da dor neuropática. No entanto, pode ser usado para estudar outras doenças neurológicas que envolvem alterações patológicas na medula espinhal adulta.