Name: Um método para extrair Pigmentos de Squid Pealeii Doryteuthis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprenda a extrair pigmentos de cromatóforos de Doryteuthis pealeii usando dissecação, digestão enzimática e extração com metanol ácido. Este método revela mecanismos de mudança de cor em cefalópodes.

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Os autores agradecem o uso das instalações da Universidade de New Hampshire, incluindo o Centro de Instrumentação da Universidade. Este trabalho foi apoiado pela Universidade de New Hampshire, Departamento de Química.

estudos com animais invertebrados aqui realizados não são regulamentados nos Estados Unidos; Por conseguinte, o Comité Cuidado e Uso Institucional animal não tem autoridade para revisão de tais protocolos. Em vez de estes não estão sob a jurisdição da regulação nos Estados Unidos, os autores declaram que estes estudos foram realizados com esforço sincero para o uso ético, cuidado e tratamento destes animais, o número de indivíduos foi minimizado e estes esforços são consistentes com a Declaração de Basileia e do Conselho Internacional para a Ciência animal Laboratory (ICLAS) diretrizes de ética. 1. Doryteuthis pealeii (pealeii D.) Dissection <ol><li> Compra lulas decapitado D. pealeii do Departamento de Recursos Marinhos no Laboratório de Biologia Marinha de Woods Hole, MA ou de qualquer mercado de peixe fresco. Não utilizar amostras que foram filetes ou previamente alteradas, a fim de aplicar este procedimento. Especificamente, a cromacamada tophore deve ainda estar intacto na amostra. <ol><li> Se os animais não são utilizados imediatamente, armazená-las a -20 ° C até à sua utilização. Para descongelar os espécimes, colocá-los em água a temperatura ambiente por 1 hora antes da dissecção. </li></ol></li><li> Usando aço inoxidável retas tesouras de dissecação de ponta fina, cortados ao longo do lado posterior do animal. Comece na base do manto ventral, e termina na região fin. </li><li> Remover todos os órgãos internos (estômago, de emalhar, glândula de tinta, órgãos reprodutores, coração sistêmica e coração braquial), levantando-los com dissecando uma pinça e cortar seu tecido conjuntivo usando tesouras de dissecação. Descarte órgãos em um saco de amostra. </li><li> Use dissecando T-pinos para fixar o manto (lado fin-se) em um padrão 11-1 / 2 &quot;x 7-1 / 2&quot; x 1-1 / 2 &quot;pan dissecção de alumínio contendo uma almofada dissecção flexível. Mergulhe o tecido em 250 ml de água do mar que foi filtrada através de um sistema de filtração em vácuo de poliestireno descartáveiscontendo 0,2 uM tamanhos de poro. </li><li> Remova cuidadosamente a camada de pele epidérmico (cor opaca) com uma pinça de dissecação, mantendo a camada de pele chromatophore contendo intacta. Uma vez que a camada epidérmica é removido, descartá-lo num saco de amostra. </li><li> Dissecar pequenas seções (1 cm x 1 cm) da camada chromatophore com uma pinça e tesouras de dissecação. Recolher amostras de 1,5 ml em tubos de micro-centrifugação (preencher uma metade de cada tubo vazio com o tecido dissecado). </li><li> Adicionar 500 uL de água do mar filtrada para o tecido contendo tubos. As amostras podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2. Isolando chromatophore Pigment Granulados <ol><li> digestão do tecido <ol><li> Preparação da papaína / colagenase <ol><li> Pesar 30 mg de colagenase e 5 mg de papaína usando um &quot;x 4&quot; baixo teor de azoto 4 pesar papel. Transferi-los em um 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno com tampa de rosca. </li><li> Medir 10 ml de deionizágua ed usando uma pipeta graduada. Adicionar directamente ao frasco contendo papaína / colagenase. Vortex na configuração mais alta até que a solução é clara. </li></ol></li><li> Remoção de tecido extracelular <ol><li> Centrifuga-se o tecido recolhido a partir do passo chromatophore 1,7 durante 5 min a 14.000 x g. Descartar a camada superior da água do mar em um balde de resíduos de plástico. </li><li> Adicionar 500 ul da solução de papaína / colagenase ao tecido usando uma P1000 de volume variável único canal micropipeta. Vortex cada amostra por 1-2 min na potência máxima. </li><li> Sonicar as amostras durante 5 minutos a uma frequência de 40 kHz para dissociar as células a partir do tecido circundante. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 14.000 x g. Descartar o sobrenadante em um balde de resíduos de plástico. </li><li> Centrifuga-se o tecido recolhido chromatophore durante 5 min a 14.000 x g. Descartar a camada superior da água do mar em um balde de resíduos de plástico. Repita mais uma vez. </li><li> remover manualmente qualquer sec tecido grande restantesções que não digerem neste processo com uma pinça antes de prosseguir para o passo seguinte. </li></ol></li></ol></li><li> Isolando o pigmento Granulados <ol><li> Preparação de tampão de homogeneização <ol><li> Pesar 2,38 g de (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico) (HEPES, 100 mM), 0,095 g de cloreto de magnésio (10 mM), 0,856 g de potássio-aspartato (50 mM), e 0,015 g de ditiotreitol (1 mM). Transferir para um recipiente de poliestireno de 150 ml com uma tampa de rosca. Adicionar um mini-inibidor de protease tablet comercial. </li><li> Medir 100 mL de água desionizada usando um cilindro graduado. Adicionar directamente ao recipiente que contém os sais de homogeneização. Vortex até a solução ficar clara. </li></ol></li><li> Homogeneização dos grânulos de pigmento <ol><li> Centrifugar cada amostra a partir do passo 2.1 a 14000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante em um balde de resíduos de plástico. Essa amostra deve ser vazio de tecido extracelular. </li><li> Adicionar 500 &amp;# 181; l de tampão de homogeneização e a cada tubo de vórtice durante 1-2 min cada para misturar bem as amostras. Sonicate as amostras para 30 min (~ 40 kHz) e seguir com 5 min de centrifugação a 14.000 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico, e repetir a etapa anterior de 2-3 vezes para assegurar a digestão completa do sáculo e chromatophore proteína amarras. O restante da solução deve conter um sobrenadante de cor amarela clara e um pelete de cor vermelha contendo os grânulos de pigmento isolado. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Pigment Extração <ol><li> Preparação de metanol ácido (HCl-MeOH) <ol><li> Adicionar cuidadosamente 25 mL de concentrado (36,5-38% (w / w)) de ácido clorídrico (HCl) a 5 ml de metanol (MeOH). Guardar a solução HCl-MeOH num frasco de amostra de vidro com tampa de rosca. Agite cuidadosamente para misturar uniformemente a solução. NOTA: O mais ácida à solução, a mais pigmento será extraído durante o fiextração de primeira. </li></ol></li><li> Extracção de Pigmento <ol><li> Centrifugar a suspensão de pigmento de grânulos (a partir de 2.2.2) durante 5 min a 14000 xg e desprezar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico. </li><li> Adicionar 500 ul da solução de HCl-MeOH e agitar com vortex para cada amostra de ~ 3-4 min. Sonicar as amostras durante 10 min (~ 40 kHz), depois centrifugar durante 5 min a 14.000 x g. </li><li> Usando uma pipeta, recolher o sobrenadante num frasco com tampa de vidro de 1 dram. O sobrenadante deve ser vermelho escuro na cor. </li><li> Repita o 3.2.2 etapa de extração até que este é extraído (~ 4-5 lavagens). NOTA: Cada extracção irá produzir ~ 1,5 mL de pigmento. O sedimento incolor remanescente é extraída os grânulos de pigmento. NOTA: Ambos os grânulos incolores e pigmentos extraídos podem ser armazenados em água a 4 ° C até uso posterior. </li></ol></li></ol> 4. Caracterização ao longo Processo de Extracção <ol><li> digitalização Electron Microscopia <ol><li> Imagem dos grânulos (que não reagiram a partir do passo 2.2.1 e 3.2.3 do passo extraiu-pigmento) usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para verificar a pureza do processo de extração. </li><li> Para preparar as amostras de grânulos para imagiologia, primeiro de centrifugação tanto grânulos que não reagiram e de pigmento extraído grânulos durante 5 min a 14.000 xg, e desprezar o sobrenadante para um balde de desperdícios de plástico. Re-suspender estes em 1 ml de etanol, e depósito de 2-3 gotas da suspensão de grânulos Onto topos de alumínio SEM utilizando uma pipeta de transferência. </li><li> Depois de se secar as amostras durante a noite, revestir com revestimento de ouro-platina durante 3 min para obter um revestimento de 15 nm. </li><li> Imagem usando um MEV com um emissor de Schottky e um detector de electrões secundário. Use uma tensão feixe de 5-7 kV e uma distância de trabalho entre 8 e 9 mm para a imagem destes materiais. </li></ol></li><li> Usando espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-VIS) <ol><li> Monitorar o pro absorçãoarquivos para todas as 3 condições (grânulos que não reagiu a partir 2.2.2, pigmento extraído do 3.2.3, e pigmento extraído grânulos de 3.2.4) usando um espectrofotômetro de feixe duplo 200-800 nm. </li><li> Recolha uma medição em branco utilizando água desionizada numa cuvete de 1 mL para os grânulos que não reagiram e os grânulos de pigmento extraído. Recolha espectros de absorção UV-Vis para ambas as amostras. </li><li> Recolha uma medição em branco utilizando a solução de metanol ácido numa cuvete de 1 ml para o pigmento extraído. Recolha espectro de absorção UV-Vis para a amostra. </li><li> Determinar o comprimento de onda máximo de cada amostra por meio da identificação do comprimento de onda em que o pico de absorvância atinge a sua altura máxima relativa. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Nós demonstramos um método para extrair pigmentos a partir de grânulos chromatophore lula. Alvejando especificamente os grânulos, o nosso objectivo é determinar seu papel na mediação coloração adaptativa. Este método difere relatórios anteriores concebidos para caracterizar pigmentos cefalópodes utilizando amostras de tecidos em massa 14 ou liofilizados pele 15. Embora este protocolo é eficaz na extração de pigmentos chromatophore, ela é limitada a pequenas escalas de r...

Cefalópodes, tais como lulas, chocos, polvo e tem a capacidade de alterar dinamicamente a sua aparência para camuflar e sinalização. 1-6 Esta capacidade é apoiado em parte pela expansão de área seletiva de órgãos pigmentadas conhecidos como cromatóforos. 4,7-9 Cromatóforos são actuadores macias que contêm uma rede de grânulos de pigmento nanoestruturados confinados dentro de uma sáculo cytoelastic que está ancorado radialmente por fibras musculares. 1,3 Como eles são actuados, chromatophores expandir por 500% da área de superfície apresentada a distribuição dos grânulos durante todo o órgão. 3,7 , 10,11 Quando esta acção concertada ao longo de um número de chromatophores, a coloração geral do animal é alterada. Embora se saiba que os grânulos de pigmento contribuir para esta mudança de cor, a sua composição permanece desconhecido. Descreve-se um processo para isolar e purificar chromatophore pigmentos que podem ser adaptados para futuros estudos de composição. 3,12 chromatophore tecido contendo é colhido através de extirpação cuidado do cefalópode. Um processo de digestão e homogeneização é então utilizado para dissociar o tecido circundante e separar as células chromatophore. Os grânulos nanoestruturados são, em seguida, isolado e purificado a partir das chromatophores restantes usando sonicação e centrifugação repetida. Após purificação, os pigmentos são extraídos a partir dos grânulos em um processo que é uma adaptação da extracção de cor visível de asas de borboleta usando soluções de metanol ácidas. Microscopia de electrões 13 de varredura (SEM) e espectrofotometria são usados para confirmar que os pigmentos chromatophore são extraídas com sucesso usando Este processo. Este método descreve o isolamento de grânulos chromatophore que é usado para explorar as contribuições para C molecularesoloration em cefalópodes. 12 extrações de moléculas pequenas de animais inteiros muitas vezes pode ser um processo longo e tedioso. O objetivo aqui é informar futuros pesquisadores de um protocolo eficaz e fácil para a aquisição de pigmentos a partir dos grânulos nanoestruturados em cefalópodes.

<table><tbody><tr><td>Colagenase</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>Sem perigo</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>Irritante, toxicidade aguda</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>Irritante leve</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>EMD Chemicals</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>K-Aspartato</td> corrosivo <td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>Reage violentamente com oxidantes</td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Irritante ocular leve</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>Altamente inflamável</td></tr><tr><td>Mini comprimido inibidor de doenças</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>Corrosivo para metal e pele</td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>Irritante&nbsp;</td></tr></tbody></table>

um método para extrair pigmentos de squid<em&gt; pealeii doryteuthis</em

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Os cefalópodes podem sofrer mudanças rápidas e adaptativas na coloração dérmica para fins de detecção, comunicação, defesa e reprodução. Essas capacidades são apoiadas em parte pela expansão e retração da área de órgãos pigmentados conhecidos como cromatóforos. Embora se saiba que os cromatóforos contêm uma rede amarrada de grânulos pigmentados, suas propriedades estrutura-função não foram totalmente detalhadas. Descrevemos um método para isolar os grânulos nanoestruturados em cromatóforos de lula Doryteuthis pealeii e demonstramos como seus pigmentos associados podem ser extraídos em solventes ácidos. Para conseguir isso, o cromatóforo contendo a camada dérmica é primeiro isolado manualmente usando uma dissecção superficial e os grânulos de pigmento são removidos usando ciclos de sonicação, centrifugação e lavagem. Os pigmentos confinados dentro dos grânulos purificados são então extraídos por meio de soluções ácidas de metanol, deixando nanoestruturas com diâmetros menores que não têm cor visível. Este procedimento de extração produz um rendimento de 58% de pigmentos solúveis isolados de grânulos. Usando este método, a composição dos pigmentos cromatóforos pode ser determinada e usada para fornecer informações sobre o mecanismo de coloração adaptativa em cefalópodes.

Cromatóforos são dissecados a partir do D. pealeii manto dorsal (Figura 1A, 1B). Uma vez que são removidas, chromatophores são lisadas e purificada utilizando ciclos de centrifugação e lavagem para isolar os grânulos pigmentados (Figuras 2A, 2B). Soluções de metanol ácido (HCl-MeOH) são usadas para extrair o pigmento a partir dos grânulos (Figura 2C), obtendo-se um extracto de pigmento solúvel e...

Um protocolo para a extração de pigmentos a partir dos grânulos nanoestruturados em lulas Doryteuthis pealeii cromatóforos é apresentado.

Um método para extrair Pigmentos de Squid<em&gt; Pealeii Doryteuthis</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever como extrair pigmentos localizados dentro dos grânulos nanoestruturados dos cromatóforos de lula recém-dissecada, Doryteuthis pealeii. Cefalópodes são animais marinhos complexos que passam por mudanças rápidas e adaptativas em sua coloração dérmica e alterações adaptativas em sua cor da pele.No entanto, ainda há muito que se desconhece sobre como esses sistemas funcionam. A principal vantagem dessa técnica é que ela direciona especificamente os grânulos nanoestruturados no órgão cromatóforo. Isso permitirá aos pesquisadores elucidar o mecanismo da mudança de cor que se origina em escala nanométrica.Além de fornecer informações sobre a biologia dos cefalópodes, isso pode orientar o design de sistemas sintéticos desenvolvidos para imitar a amplitude dinâmica da coloração adaptativa exibida pelos cefalópodes, utilizando nanopartículas pigmentadas pré-embaladas. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque a coleta de tecido de cromatóforo puro é difícil devido à sua proximidade com os tecidos circundantes. Nosso método é otimizado para reduzir esses contaminantes.Para iniciar a dissecação, despeje aproximadamente 250 mililitros de água do mar filtrada em uma bandeja de dissecação. Coloque um espécime na bandeja e, com uma tesoura fina de ponta reta em aço inoxidável, corte desde a base da bolsa ventral ao longo do lado posterior do animal, terminando na região da nadadeira. Remova todos os órgãos internos levantando-os suavemente com pinça de dissecação e seccionando o tecido conjuntivo com a tesoura.Descarte os órgãos em um saco para espécimes. Usando pinos em forma de T para dissecação, fixe o manto com a barbatana voltada para cima no suporte de dissecação. Com uma pinça, remova cuidadosamente a camada opaca da pele epidérmica, mantendo intacta a camada da pele que contém os cromatóforos.Descarte a camada epidérmica em um saco para amostras. Em seguida, remova a camada de cromatóforos. Corte o tecido de cromatóforos em pequenos segmentos de um centímetro por um centímetro.Coloque as seções em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, preenchendo cada tubo até a metade com o tecido dissecado. Por fim, adicione 500 microlitros de água do mar filtrada aos tubos. Para isolar os grânulos de pigmento, primeiramente centrifugue as seções de tecido dos cromatóforos por cinco minutos a 14.000 × g.Descarte a camada superior de água do mar. Adicione 500 microlitros de solução de colagenase de papaína às amostras e vortexe por um a dois minutos na velocidade máxima. Em seguida, sonique as amostras por cinco minutos a 40 kHz para dissociar as células do tecido circundante.Centrifugue por mais cinco minutos a 14.000 x g e, em seguida, descarte o sobrenadante. Repita a centrifugação mais duas vezes, descartando o sobrenadante a cada vez. Em seguida, adicione a ressuspensão em colagenase.Use pin&ccedil;as para remover manualmente quaisquer se&ccedil;&otilde;es grandes de tecido remanescentes que n&atilde;o foram digeridas antes de prosseguir. A pureza da solu&ccedil;&atilde;o inicial de gr&acirc;nulos influencia a extra&ccedil;&atilde;o de pigmento. Portanto, &eacute; importante garantir que os materiais iniciais de cromat&oacute;foros sejam completamente digeridos.Verificamos que seções de tecido de aproximadamente um centímetro são ideais para coletar a população mais pura de grânulos. Prepare o tampão de homogeneização utilizando um tubo de tampa rosqueável de 150 mililitros e adicionando as quantidades apropriadas de HEPES, cloreto de magnésio, aspartato de potássio e ditiotreitol. Adicione um comprimido mini comercial de inibidor de protease.Usando um cilindro graduado, meça 100 ml de água desionizada e adicione ao tubo contendo os sais de homogeneização. Vortexe o tubo para misturar até que a solução fique clara. Centrifugue as amostras de tecido e, em seguida, descarte o sobrenadante.Adicione 500 microlitros de tampão de homogeneização a cada tubo e vortexie por 2 minutos para misturar completamente. Sonique as amostras por 30 minutos a 40 kHz. Em seguida, centrifugue-as novamente.Após descartar o sobrenadante, repita a adição da homogeneização, sonicação e centrifugação duas a três vezes para garantir a digestão completa do tecido extracelular. Por fim, o tubo deve conter um sobrenadante levemente amarelado e um pellet de cor vermelha, composto pelos grânulos de pigmento isolados. Descarte o sobrenadante.Primeiro, prepare metanol ácido para extração em um frasco de amostra de vidro com tampa rosqueável adicionando 5 ml de metanol e 25 µL de ácido clorídrico concentrado. Agite suavemente a solução para misturar. Reserve um tubo de amostra, este será o tratamento de grânulos reagidos finais.Remova o tampão de homogeneização de um segundo tubo contendo grânulos. Adicione 500 mcL da solução de metanol ácido aos tubos restantes e vortexie por três a quatro minutos. Sonique as amostras por 10 minutos a 40 kHz e, em seguida, centrifugue por cinco minutos a 14000 x g.Usando uma micropipeta, colete o sobrenadante em um frasco de vidro com tampa rosqueável de um dram. Este é o pigmento, que deve apresentar coloração vermelha-escura. Repita as etapas de adição de metanol ácido, sonicacao e centrifugação quatro a cinco vezes, coletando o sobrenadante, até que nenhuma cor adicional seja extraída.O pellet incolor restante corresponde aos grânulos com pigmento extraído. Para preparar as amostras de grânulos para imagem, primeiramente centrifugue tanto a alíquota de grânulos não reagidos quanto os grânulos com pigmento extraído por cinco minutos a 14000 x g, descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda cada pellet em 1 ml de etanol 95%. Usando uma pipeta de transferência, coloque 2-3 gotas de cada suspensão de grânulos em suportes separados de alumínio para MEV.Coloque as amostras em um dessecador para secar durante a noite sob vácuo. Revesta os suportes com revestimento de ouro-platina por 3 minutos para obter um revestimento de 15 nanômetros. Obtenha imagens das amostras utilizando um microscópio eletrônico de varredura.Em seguida, utilize um espectrofotômetro para coletar os perfis de absorvância dos grânulos não reagidos, grânulos extraídos e pigmento extraído. Faça uma medida em branco para as amostras de grânulos adicionando 1 ml de água deionizada a uma cubeta limpa. Descarte o branco em um recipiente de resíduos.Em seguida, adicione a suspensão contendo os grânulos de pigmento não reagidos à cubeta. Colete os espectros de absorção UV-vis para a amostra de grânulos. Faça uma segunda medida em branco para o pigmento extraído utilizando 1 mL de metanol ácido e uma cubeta limpa.Por fim, obtenha o espectro de absorção UV-vis do pigmento e, em seguida, determine o comprimento de onda máximo de cada amostra. A microscopia eletrônica de varredura revelou que o processo de extração do pigmento reduz o diâmetro médio dos grânulos. Antes da extração, os grânulos possuem um diâmetro médio de 527,3 nm.Após o procedimento com metanol ácido, esse tamanho diminui significativamente para cerca de 202,6 nm. A redução é atribuída à extração do pigmento. Com a adição do metanol ácido, a coloração associada aos grânulos não reagidos também diminui visivelmente.A confirmação dessa hipótese foi obtida utilizando espectrofotometria. Este gráfico mostra um perfil de absorvância amplo para os grânulos pré-extraídos e um perfil similarmente amplo, mas de menor intensidade, para os grânulos pós-extraídos. Em contraste, o pigmento solúvel extraído exibe um lambda máximo em torno de 500 nm e um ombro distinto em torno de 380 nm.Coletivamente, esses dados sugerem a extração bem-sucedida da cor visível a partir dos grânulos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em aproximadamente quatro horas, do início ao fim. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de remover completamente o tecido que contém plaquetas de proteína refletora, as quais podem interferir na extração e na análise.O tecido epidérmico também pode interferir nas etapas de homogeneização e na extração de pigmentos. Após este procedimento, outros métodos como cromatografia em camada delgada e espectrometria de massas podem ser utilizados para purificar ainda mais os pigmentos e caracterizar sua composição. Essas etapas podem ajudar a elucidar as contribuições moleculares para a coloração em cefalópodes.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais para biólogos marinhos, químicos e engenheiros, tais como: Qual é a composição dos pigmentos utilizados durante a mudança de cor? E como eles contribuem para a função e estrutura dos grânulos nanoestruturados dentro dos órgãos dérmicos cromatóforos? Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair pigmento dos cromatóforos de lula recém-dissecada, Doryteuthis pealeii.

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