Um método para extrair Pigmentos de Squid Pealeii Doryteuthis

O objetivo geral deste procedimento é descrever como extrair pigmentos localizados dentro dos grânulos nanoestruturados de lulas recém-dissecadas, cromatóforos Doryteuthis pealeii. Os cefalópodes são animais marinhos complexos que sofrem mudanças rápidas e adaptativas em sua cor dérmica. e mudanças adaptativas em sua cor dérmica.

No entanto, ainda há muito que não se sabe sobre como esses sistemas funcionam. A principal vantagem dessa técnica é que ela visa especificamente os grânulos nanoestruturados no órgão cromatóforo. Isso permitirá que os pesquisadores elucidem o mecanismo de mudança de cor originado em nanoescala.

Além de insights sobre a biologia dos cefalópodes, ele pode informar o projeto de sistemas sintéticos construídos para imitar a faixa dinâmica de cores adaptativas exibidas em cefalópodes usando nanopartículas pigmentadas pré-embaladas. Geralmente, os indivíduos novos neste método lutam porque a coleta de tecido cromatóforo puro é difícil devido à sua proximidade com o tecido circundante. Nosso método é otimizado para reduzir esses contaminantes.

Para iniciar a dissecação, primeiro despeje aproximadamente 250 mililitros de água do mar filtrada em uma panela de dissecação. Coloque um espécime na panela e usando uma tesoura de ponta fina reta de aço inoxidável, corte da base do manto ventral ao longo da face posterior do animal, terminando na região da nadadeira. Remova todos os órgãos internos levantando-os suavemente com uma pinça de dissecação e cortando o tecido conjuntivo usando a tesoura.

Descarte os órgãos em um saco de amostra. Usando pinos T de dissecação, prenda o lado da barbatana do manto para cima na almofada de dissecação. Com uma pinça, remova cuidadosamente a camada opaca da pele epidérmica, mantendo intacta a camada de pele contendo cromatóforo.

Descarte a camada epidérmica em um saco de amostra. Em seguida, remova a camada de cromatóforo. Corte o tecido cromatóforo em pequenas seções de um centímetro por um centímetro.

Coloque as seções em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, enchendo cada tubo até a metade com tecido dissecado. Por fim, adicione 500 microlitros de água do mar filtrada aos tubos. Para isolar os grânulos de pigmento, primeiro centrifugar as seções de tecido do cromatóforo por cinco minutos a 14.000 x g.

Descarte a camada superior de água do mar. Adicione 500 microlitros de solução de colagenase de papaína às amostras e vortex por um a dois minutos na configuração mais alta. Em seguida, sonice as amostras por cinco minutos a 40 kHz para dissociar as células do tecido circundante.

Centrifugar durante mais cinco minutos a 14 000 x g e rejeitar em seguida o sobrenadante. Repetir a centrifugação mais duas vezes, rejeitando o sobrenadante de cada vez. Em seguida, adicione a ressuspensão em colagenase.

Use uma pinça para remover manualmente quaisquer grandes seções de tecido restantes que não foram digeridas antes de prosseguir. A pureza da solução inicial do grânulo influencia a extração do pigmento. Portanto, é importante garantir que os materiais do cromatóforo inicial sejam totalmente digeridos.

Descobrimos que as seções de tecido em torno de um centímetro são ideais para coletar a população mais pura de grânulos. Prepare o tampão de homogeneização pegando um tubo de tampa de rosca de 150 mililitros e adicionando a quantidade apropriada de HEPES, cloreto de magnésio, aspartato de potássio e ditiotreitol. Adicione um mini comprimido comercial de inibidor de protease.

Usando um cilindro graduado, meça 100ml de água deionizada e adicione-a ao tubo contendo os sais de homogeneização. Vortex o tubo para misturar até que a solução fique límpida. Centrifugar as amostras de tecido e rejeitar o sobrenadante.

Adicione 500 microlitros de tampão de homogeneização a cada tubo e vórtice a 2 minutos para misturar bem. Sonicar as amostras durante 30 minutos a 40kHz. E então centrifugue-os novamente.

Depois de descartar o sobrenadante, repita a adição de homogeneização, sonicação e centrifugação duas a três vezes para garantir a digestão completa do tecido extracelular. Finalmente, o tubo deve conter um sobrenadante amarelo claro e um pellet de cor vermelha consistindo nos grânulos de pigmento isolados. Descarte o sobrenadante.

Primeiro, prepare o metanol ácido para extração em uma amostra de vidro com tampa de rosca adicionando 5ml de metanol e 25mcL de ácido clorídrico concentrado. Agite a solução suavemente para misturar. Separe um tubo de amostra, este será o tratamento final dos grânulos.

Remova o tampão de homogeneização de um segundo tubo contendo grânulos. Adicione 500mcL da solução ácida de metanol aos tubos restantes e vore por três a quatro minutos. Sonicar as amostras durante 10 minutos a 40 kHz e depois centrifugar durante cinco minutos a 14000 x g.

Usando uma micropipeta, colete o sobrenadante em um frasco de vidro com tampa de rosca de uma gota. Este é o pigmento e deve aparecer na cor vermelha escura. Repita as etapas de adição de metanol ácido, sonicação e centrifugação quatro a cinco vezes, coletando o sobrenadante até que nenhuma outra cor seja extraída.

O pellet incolor restante são os grânulos extraídos com pigmento. Para preparar amostras de grânulos para imagem, primeiro centrifugue a alíquota de grânulos não reagida e os grânulos extraídos com pigmento por cinco minutos a 14000 x g, descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda cada pellet em 1ml de etanol a 95%. Usando uma pipeta de transferência, coloque 2-3 gotas de cada suspensão de grânulos em um topo de SEM de alumínio separado.

Coloque as amostras no dessecador para secar durante a noite sob vácuo. Cubra os tocos com revestimento de platina dourada por 3 minutos para obter um revestimento de 15 nanômetros. Visualize as amostras usando um microscópio eletrônico de varredura.

Em seguida, use um espectrofotômetro para coletar os perfis de absorbância para os grânulos não reagidos, grânulos extraídos e pigmento extraído. Faça uma medição em branco para as amostras de grânulos adicionando 1ml de água deionizada a uma cubeta limpa. Descarte o espaço em branco em um recipiente de lixo.

Em seguida, adicione a suspensão contendo os grânulos de pigmento não reagidos à cubeta. Colete os espectros de absorção UV vis para a amostra de grânulos. Faça uma segunda medição em branco para o pigmento extraído usando 1mL de metanol ácido e uma cubeta limpa.

Finalmente, pegue o espectro absorvente UV vis para o pigmento e determine o comprimento de onda máximo de cada amostra. A microscopia eletrônica de varredura revelou que o processo de extração do pigmento reduz o diâmetro médio dos grânulos. Antes da extração, os grânulos têm um diâmetro médio de 527,3 nm.

Após o procedimento de metanol ácido, esse tamanho diminui significativamente para cerca de 202,6 nm. Uma redução que se acredita ser devido à extração do pigmento. Após a adição do metanol ácido, a cor associada aos grânulos não reagidos também reduz visivelmente.

A confirmação dessa hipótese foi obtida por espectrofotometria. Este gráfico mostra um amplo perfil de absorbância para os grânulos pré-extraídos e um perfil de intensidade igualmente amplo, mas de menor intensidade, para os grânulos pós-extraídos. Em contraste, o pigmento extraído solúvel exibe um lambda max em torno de 500 nm e um ombro distinto em torno de 380 nm.

Coletivamente, esses dados sugerem a extração bem-sucedida da cor visível dos grânulos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente quatro horas do início ao fim. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de remover completamente o tecido que contém plaquetas de proteína reflexiva que podem interferir na extração e análise.

O tecido epidérmico também pode interferir nas etapas de homogeneização e extração do pigmento. Seguindo este procedimento, outros métodos como cromatografia em camada fina e espectrometria de massa podem ser usados para purificar ainda mais os pigmentos e caracterizar sua composição. Essas etapas podem ajudar a elucidar as contribuições moleculares para a coloração em cefalópodes.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave para biólogos marinhos, químicos e engenheiros, incluindo:Qual é a composição dos pigmentos usados durante a mudança de cor? E como eles contribuem para a função e estrutura dos grânulos nanoestruturados dentro dos órgãos cromatóforos dérmicos? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair pigmento de lulas recém-dissecadas, cromatóforos doryteuthis pealeii.