Name: Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar mudanças em biofilmes em resposta a escarro e antibióticos usando um modelo de câmara de lâmina. Este método permite observar diretamente alterações na arquitetura do biofilme e analisar parâmetros como espessura média.

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TB reconhece uma bolsa de pesquisa da Fibrose Cística no Canadá.

Note-se que Conselho de Ética em Pesquisa (REB) é necessário para coletar e armazenar amostras de escarro de seres humanos. Esses estudos foram aprovados pelo Hospital para Crianças Doentes REB # 1000019444. 1. preparação de amostras de expectoração CF <ol><li> Recolher amostra de escarro de pacientes durante as visitas de rotina à clínica fibrose cística e manter em gelo. </li><li> Transporte de amostra de escarro no gelo dentro da primeira hora da coleta, para o laboratório de pesquisa, submeter-se a tratamento. </li></ol> 2. escarro Processing <ol><li> Registrar o volume da amostra de expectoração obtidos. Adicionar salina tamponada com fosfato (PBS) para 2x o volume da amostra (isto é, 2 partes de PBS, uma parte de amostra). </li><li> Misturar a amostra bem com uma pipeta de transferência. Vortex da amostra na potência máxima por 1 min para misturar completamente. </li><li> Aliquota de 1 ml da mistura acima referida sobre o número 1,5 ml tubos de microcentrífuga adequadas e girar a 5000 xg durante20 min a 4 ° C. </li><li> A seguir à centrifugação, o sobrenadante remover e descartar o sedimento. </li><li> Filtrar esterilizar o sobrenadante através de um filtro de 0,22? M e recolher num tubo de microcentrífuga limpo. NOTA: A esterilidade do filtrado é testado por plaqueamento em LB agar e inocular meio líquido. </li><li> Armazenar o sobrenadante expectoração a -80 ° C para uso futuro. NOTA: O escarro de vários pacientes também podem ser agrupados seguindo filtração. </li><li> Antes de utilizar, dilui-se expectoração filtrado 10/1 v / v (100 ul de expectoração, a 900 ul de meio), em meio desejado. NOTA: Aqui, foi utilizado caldo lysogeny padrão (LB) de mídia. </li></ol> 3. Chambered Método lamela para formação de biofilme <ol><li> Cresça isolado bacteriano de interesse durante a noite em meio desejado a 37 ° C com agitação (200 rpm). Nota: Um número de bactérias diferentes foram usados, incluindo isolados clínicos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Complexo Burkholderia cepacia e Achromobacter xylosoxidans. Escolha dos meios depende tensões e condições de interesse, no entanto meio LB podem ser utilizados em experiências iniciais. </li><li> A partir da cultura durante a noite, colocar 40 mL de cultura em 4 ml de meio fresco e crescer durante 3-4 horas a 37 ° C com agitação (200 rpm) para se obter uma cultura com uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de cerca de 0,5 -0.6. </li><li> Dilui-se a cultura a partir do passo 3.2 a 1/5 na mídia desejada com 10% filtrado escarro ou sem filtrado escarro (como controle). Outros concentração do filtrado expectoração pode ser testado (isto é, 50% ou 100%). </li><li> Utilizar 200 ul da diluição para semear poços das câmaras de deslizamento. </li><li> Permitir que as bactérias aderir durante 4 h a 37 ° C sem agitação. </li><li> Após 4 horas, remova a mídia e lavar cuidadosamente o biofilme por meio fresco 1x. Substitua por 200 mL de mídia fresco. NOTA: Para estudar os efeitos do escarro no biofilme, os fresh mídia deve conter escarro sobrenadante. </li><li> Permitir biofilmes a crescer para a quantidade desejada de tempo a 37 ° C sem agitação, substituindo todos os meios de comunicação 12 horas, sem a lavagem até que o tempo para microscopia. NOTA: Para estudar o efeito de sobrenadantes de escarro na susceptibilidade aos antibióticos biofilme, os antibióticos são adicionados à mídia após 24 horas de crescimento do biofilme e são mantidos nos meios de comunicação até a coloração e imagens de biofilmes. </li></ol> 4. Os biofilmes de coloração e microscopia confocal <ol><li> Seguindo tempo de crescimento desejado (24-48 h, funciona melhor), remova a mídia de poços de câmara e lavar cuidadosamente cada câmara duas vezes com 300 ul de PBS estéril. </li><li> Prepare a mistura de coloração de biofilme por mistura de 1 mL de cada corante (fornecido no kit de viabilidade) por cada ml de solução necessário. Fazer a tintura em água ou meios solução. NOTA: A água é recomendado pelo fabricante. </li><li> Adicionar 200 ul de mistura de corante a cada cavidade de covergla septadasSS e incubar à temperatura ambiente, no escuro, durante 45 min. </li><li> Remover mistura de coloração das câmaras e lavagem de cada poço com 300 ul de PBS estéril. Remover PBS e substituir com água doce ou de mídia. </li><li> Proceda com visualização de biofilme através de microscopia confocal. </li></ol> 5. Visualizando biofilmes com microscopia confocal <ol><li> Leia biofilmes manchado em câmaras imediatamente após a coloração (dentro de 1 hora). Minimizar atraso na visualização das lâminas por coloração de 1 a 2 câmaras de 8 poços de cada vez. </li><li> Realizar imagem usando microscópio confocal com lasers para excitação e filtros de conjuntos para a aquisição. NOTA: Aqui, o sistema confocal disco giratório com lasers borealis espectrais (verde: 491nm, Vermelho: 561 nm) foram utilizados para a excitação. conjuntos de filtros de emissão de 515/40 e 624/40 foram usadas para visualizar as manchas do kit de viabilidade do biofilme. </li><li> Captar imagens utilizando uma objectiva de água 25X no microscópio confocal com câmera. </li><li&gt; Use Z-Pilhas para modelar o biofilme. Captar imagens a cada 0,5-1 mm a partir do primeiro plano em foco para o último quadro em foco do biofilme (tipicamente abrangendo 30-80 mm para 48 biofilmes hr) </li><li> Tome 3-5 imagens de cada poço. NOTA: Assim, para um 8 lamela bem câmaras, serão gerados 24-40 imagens. </li><li> Salvar imagens para análise. NOTA: As imagens devem ser salvas como arquivos OME-TIFF a ser analisado usando COMSTAT 18,19. Instruções para a análise de imagem do biofilme pode ser encontrada em http://www.comstat.dk/. Uma vez que as imagens são importadas, parâmetros como a espessura média, biomassa e cobertura de superfície para cada canal (vermelho e verde) podem ser analisados. </li></ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation%3A+a+clinically+relevant+microbiological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
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<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
<li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Adv%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).</li>
<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
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<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

Os métodos aqui descritos permitem a visualização de biofilmes bacterianas cultivadas na presença de produtos exógenos. Não surpreendentemente, a produção dos exoproducts é de importância quando se utiliza este tipo de sistema. Por exemplo, ditiotreitol (DTT), é frequentemente utilizado em amostras de saliva humana para ajudar a liquefazer as amostras. No entanto, o efeito do DTT sozinho pode diminuir o desenvolvimento do biofilme e a viabilidade (dados não mostrados). Assim, controles adequados para todas as condições ...

biofilmes bacterianas são grupos de microrganismos que estão ligados uns aos outros e incorporados numa matriz auto-secretado. 1,2 Classicamente, eles representam bactérias fisicamente ligados a uma superfície abiótica ou biótico formado sob condições de fluxo. Os biofilmes também têm sido mostrados para crescer em condições estáticas (ausência de fluxo) e distal de superfícies, tais como na interface ar-líquido de piscinas termais ou películas formadas nos tubos de ensaio. Estes biofilmes têm sido reconhecidos no meio ambiente e são um grande prejuízo para processos industriais, como eles podem se formar em reservatórios de água ou em tubos, resultando em biofouling, corrosão e entupimentos. 3,4 Os biofilmes também são críticas em ambientes de cuidados de saúde, como têm sido mostrado estar envolvidas em infecções relacionadas com cateteres, infecções pulmonares em doentes com fibrose cística, bem como em numerosas outras infecções. 5,6 Uma das marcas de infecções biofilme é a devincado susceptibilidade das bactérias aos antibióticos e auditivos depuração pelo sistema imune inato. 7-9 O mais bem estudadas, cenários clinicamente relevantes envolvendo infecção baseada biofilme ocorre em pacientes com fibrose cística (FC), que estão cronicamente infectados com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa podem ser submetidos a uma série de alterações durante o estabelecimento da infecção crónica que tornam muito difíceis de tratar. 10,11 biofilmes pode diferencialmente ativar a imunidade inata e conduzir a inflamação. 12-14 Como estas infecções levar ao aumento da morbidade e mortalidade em pacientes com FC, é crucial para entender fatores que podem afetar o desenvolvimento do biofilme neste contexto. Um estudo recente sugere que hospedeiras-factores são importantes na formação de agregados de biofilme de P. aeruginosa. 15 Estes biofilmes contribuir para a redução da susceptibilidade aos antibióticos e os mecanismos de defesa do hospedeiro. o preseNCE de factores derivados do hospedeiro, tais como a elastase de neutrófilos, assim como produtos secretados a partir de microrganismos presentes no pulmão CF, tem o potencial de modular significativamente a formação de biofilme e de desenvolvimento. 16 Além disso, os biofilmes interagir com o hospedeiro para modular a expressão de numerosos caminhos e iniciar a inflamação. Enquanto os métodos de alto rendimento, tal como o ensaio de violeta de cristal padrão, podem fornecer alguma informação no que diz respeito ao processo de biofilme, a visualização do biofilme em resposta a estes factores proporcionam mais informação em profundidade. Nesse artigo, nós descrevemos um método para a utilização de factores de expectoração de pacientes com FC para estudar o desenvolvimento de biofilmes in vitro. Este método permite a rápida visualização de biofilme expostos a expectoração contendo factores do hospedeiro, utilizando um kit comercial viabilidade do biofilme. Esta técnica pode ser usada para identificar visualmente as alterações que ocorrem durante o crescimento de biofilme, na presença de exógenonos produtos, e representa um método melhorado para analisar as alterações no desenvolvimento de biofilme sob várias condições.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Lamínula com câmara, borosilicato #1.5, 8 poços</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Kit de Viabilidade de Biofilme Vivo/Morto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ágar sangue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Confirmando a viabilidade via contagens de UFC ou selecionando colônias para inoculação</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Software disponível online</td><td></td><td>COMSTAT é um software para analisar imagens de biofilme. Disponível www.comstat.dk&nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Caldo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Mídia padrão para crescimento noturno de gowth/biofilme</td></tr><tr><td>Filtros de seringa Millex-GV</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtragem de supernantes de escarro</td></tr><tr><td>Tamponado com fosfato Salino (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Lavagem de câmaras de biofilme após remoção de mídia</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD QS</td><td>Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectral Boreal</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>As instruções para este software podem ser encontradas em: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

visualizando os efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo chambered lamela

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Os biofilmes consistem de grupos de bactérias embebidas em uma matriz auto-secretado. Eles desempenham um papel importante na contaminação industrial, bem como no desenvolvimento e persistência de muitas infecções relacionadas com a saúde. Um dos biofilmes mais bem descrita e estudada em doenças humanas ocorre na infecção pulmonar crónica de pacientes com fibrose cística. Ao estudar biofilmes no contexto do hospedeiro, muitos factores que podem influenciar a formação e desenvolvimento de biofilme. A fim de identificar como factores do hospedeiro pode afetar a formação de biofilme e desenvolvimento, foi utilizado um método lamela chambered estática para crescer biofilmes na presença de fatores derivados do hospedeiro na forma de sobrenadantes de escarro. As bactérias são semeadas em câmaras e expostos a filtrados de expectoração. Na sequência de 48 horas de crescimento, os biofilmes estão manchadas com um kit de viabilidade de biofilme comercial antes da microscopia confocal e análise. Após a aquisição das imagens, as propriedades do biofilme pode ser avaliada através de diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar as propriedades fundamentais do crescimento do biofilme na presença de diferentes substâncias, incluindo antibióticos.

A concepção geral da experiência está representada na Figura 1. A utilização deste protocolo fornece um método conveniente para visualizar as alterações em biofilmes cultivadas por diferentes períodos de tempo (por exemplo, 24, 48 ou 72 horas). Importante, sinais exógenos, tais como expectoração filtrados, pode ser adicionado para visualizar as alterações no desenvolvimento de biofilme. Como pode ser visto na Figura 2, a presença de 10% filtrado...

Este protocolo descreve a visualização do desenvolvimento do biofilme após a exposição a fatores do hospedeiro usando um modelo de câmara de lâminas. Este modelo permite a visualização direta do desenvolvimento do biofilme, bem como a análise dos parâmetros do biofilme usando programas de software de computador.

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar alterações em biofilmes em resposta à expectoração e a antibióticos. Este método pode ser utilizado por pesquisadores para compreender questões fundamentais, como a forma pela qual a eficácia de diversos antibióticos contra biofilmes bacterianos pode ser afetada pela presença de expectoração. A principal vantagem desta metodologia é que ela permite que os pesquisadores observem as alterações que ocorrem nos biofilmes em resposta a diferentes fatores.Para iniciar o experimento, registre o volume da amostra de escarro previamente obtida. Adicione salina tamponada com fosfato, ou PBS, na quantidade de duas vezes o volume da amostra. Em seguida, use uma pipeta de transferência para misturar completamente a amostra.Vortexe a amostra na configuração mais alta durante um minuto para misturá-la completamente. Aliquote um mililitro da mistura em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue os tubos.Após a centrifugação, guarde o sobrenadante e descarte o precipitado. Estérilize o sobrenadante por filtração através de um filtro de 0,22 mícron e colete-o em um tubo de microcentrífuga limpo. Armazene o sobrenadante de escarro a 80 graus Celsius para uso futuro.Coloque 40 microlitros de cultura previamente preparada em quatro mililitros de caldo Luria fresco, ou meio LB, e cultive as bactérias para obter uma cultura com densidade óptica de 0,55 a 600 nanômetros. Em seguida, dilua 100 microlitros de cultura com OD 0,5 em 400 microlitros de filtrados de escarro 10% preparados em LB. Utilize 200 microlitros da diluição para semear os poços das câmaras de lâmina. Deixe as bactérias aderirem por quatro horas a 37 graus Celsius sem agitação.Após quatro horas, remova o meio e lave suavemente o biofilme com LB fresco 1X. Substitua o meio restante por 200 microlitros de LB fresco. Deixe os biofilmes crescerem a 37 graus Celsius sem agitação. Substitua o meio a cada 12 horas sem lavar até que o biofilme esteja pronto para microscopia. É muito importante lavar as lâminas suavemente para não perturbar as bactérias aderidas.Após o crescimento, remova o meio dos poços da câmara e lave suavemente cada câmara duas vezes com 300 microlitros de PBS estéril. Em seguida, para preparar a mistura de coloração do biofilme, adicione um microlitro de cada corante fornecido no kit de viabilidade a cada mililitro da solução necessária e misture bem. A quantidade ideal de corante e o tempo de coloração são determinados empiricamente para cada organismo.Adicione 200 microlitros da mistura de coloração a cada poço do lamínula com câmara. Incube o lamínula. Após a incubação, remova a mistura de coloração das câmaras e lave cada poço com 300 microlitros de PBS estéril.Substitua o PBS por meio fresco. Por fim, prossiga com a visualização por meio de microscopia confocal. Imagens representativas do complexo Burkholderia cepacia, ou isolados clínicos de BCC, após 48 horas de crescimento em lamínulas com câmara contendo apenas meio ou na presença de filtrados de escarro a 10%, demonstram que sua presença pode alterar a arquitetura do biofilme.As imagens foram analisadas com o software Comstat para obter parâmetros-chave de biofilme, incluindo a espessura média do biofilme, que aumentou quando tratada com 10% de escarro. A fim de avaliar os diferentes efeitos dos fatores sobre o crescimento do biofilme, isolados clínicos foram cultivados em meio apenas ou com escarro, sendo tratados ou não com antibiótico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como formar e tratar biofilmes em lamínulas com câmara e prepará-los para coloração e análise confocal.

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In vitro a formação de biofilme em um slide Câmara de 8 poços

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizando os efeitos do escarro no desenvolvimento de biofilme usando um modelo de vidro coberto com câmara. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o uso de um coverglass com câmara para estudar o efeito dos fatores do hospedeiro do escarro derivados do paciente com fibrose cística no desenvolvimento de biofilme bacteriano.

Um método de coverglass com câmara para formação in vitro de biofilmes bacterianos

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizando os efeitos do escarro no desenvolvimento de biofilme usando um modelo de vidro coberto com câmara. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um método in vitro para avaliar como a fibrose cística derivada do paciente influencia a formação de biofilmes bacterianos. Utilizando lâminas de câmara, coloração fluorescente e microscopia confocal, revela espessura aumentada, arquitetura alterada e maior biomassa viável em biofilmes cultivados com escarro,...

Imagem Confocal de Biofilmes Bacterianos Induzidos por Filtrados de Escarro em Pacientes com Fibrose Cística

Protocolos para o estudo da formação de biofilme em um dispositivo microfluídico que imita meios porosos são discutidos. O dispositivo microfluídico consiste em uma matriz de micro-pilares e a formação de biofilme por Pseudomonas fluorescens neste dispositivo é investigada.

Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Este estudo apresenta o desenvolvimento de metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilme e seus efeitos sobre a multicelularidade de Bacillus subtilis.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

O muco das vias respiratórias ligado de fibrose cística (FC) pacientes são um ambiente ideal para agentes patogénicos microbianos prosperar. O manuscrito descreve um novo método para estudar a microbiome CF pulmão num ambiente que imita onde causam doença e como alterações de condições químicas pode conduzir dinâmica microbianas.

O Modelo WinCF - Um Microcosmo barato e tratável de um muco Plugged Bronquíolo para estudar a Microbiologia do Pulmão Infecções

Este protocolo descreve o uso de um dispositivo personalizável microfluidic automatizado para visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans sob condições fisiológicas do hospedeiro.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Descrevemos a montagem, operação, e limpeza de um aparelho de fluxo projetado para formação de biofilmes fúngicas de imagem em tempo real enquanto sob fluxo. Também fornecemos e discutir algoritmos quantitativos para ser usado nas imagens adquiridas.

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

As alterações induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme de Pseudomonas aeruginosa diferem entre os isolados clínicos cultivados de pacientes com fibrose cística e infecção pulmonar crônica. Após a microscopia confocal, o software COMSTAT pode ser utilizado para quantificar variações na arquitetura do biofilme (por exemplo, área de superfície, espessura, biomassa) para isolados individuais para avaliar a eficácia de agentes anti-infecciosos.

Quantificando os efeitos dos antimicrobianos na arquitetura de biofilme in vitro usando o software COMSTAT

Aprenda a visualizar e quantificar mudanças em biofilmes em resposta a escarro e antibióticos usando um modelo de câmara de lâmina. Este método permite observar diretamente alterações na arquitetura do biofilme e analisar parâmetros como espessura média.

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

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