Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela
14 de dezembro de 2016
Este protocolo descreve a visualização do desenvolvimento do biofilme após a exposição a fatores do hospedeiro usando um modelo de câmara de lâminas. Este modelo permite a visualização direta do desenvolvimento do biofilme, bem como a análise dos parâmetros do biofilme usando programas de software de computador.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar as alterações nos biofilmes em resposta ao escarro e antibióticos. Este método pode ser usado por pesquisadores para entender questões-chave, como como a eficácia de vários antibióticos contra biofilmes bacterianos pode ser afetada pela presença de escarro. A principal vantagem dessa metodologia é que ela permite que os indivíduos vejam as mudanças que ocorrem nos biofilmes em resposta a diferentes fatores.
Para iniciar o experimento, registre o volume da amostra de escarro obtida anteriormente. Adicione solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, adicione duas vezes o volume da amostra. Em seguida, use uma pipeta de transferência para misturar bem a amostra.
Vortex a amostra na configuração mais alta por um minuto para misturá-la completamente. Alíquota de um mililitro da mistura em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, gire os tubos.
Após centrifugação, guardar o sobrenadante e rejeitar o sedimento. Filtre esterilize o sobrenadante através de um filtro de 0,22 mícron e colete-o em um tubo de microcentrífuga limpo. Armazene o sobrenadante do escarro a 80 graus Celsius para uso futuro.
Coloque 40 microlitros de cultura previamente preparada em quatro mililitros de caldo Luria fresco, ou meio LB, e cultive as bactérias para obter uma cultura com densidade óptica de 0,55 a 600 nanômetros. Em seguida, dilua 100 microlitros de cultura 0,5 OD em 400 microlitros de filtrados de escarro a 10% preparados em LB. Use 200 microlitros da diluição para semear os poços das câmaras de lâminas. Deixe a bactéria se fixar por quatro horas a 37 graus Celsius sem tremer.
Após quatro horas, remova o meio e lave suavemente o biofilme com 1X LB fresco. Substitua o meio restante por 200 microlitros de LB fresco. Deixe os biofilmes crescerem a 37 graus Celsius sem tremer. Substitua o meio a cada 12 horas sem lavar até que o biofilme esteja pronto para microscopia. É muito importante lavar suavemente as lâminas para não interromper nenhuma bactéria presa.
Após o crescimento, remova a mídia dos poços da câmara e lave suavemente cada câmara duas vezes com 300 microlitros de PBS estéril. Em seguida, para preparar a mistura de coloração de biofilme, adicione um microlitro de cada corante fornecido no kit de viabilidade a cada mililitro de solução necessária e misture a solução. A quantidade ideal de corante e tempo de coloração é determinada empiricamente para cada organismo.
Adicione 200 microlitros da mistura de coloração a cada poço da lamínula com câmara. Incube a lamínula. Após a incubação, remova a mistura de coloração das câmaras e lave cada poço com 300 microlitros de PBS estéril.
Substitua o PBS por mídia nova. Por fim, prossiga com a visualização via microscopia confocal. Imagens representativas do complexo Burkholderia cepacia, ou isolados clínicos de CBC, após 48 horas de crescimento em lamínula com câmara isolada ou na presença de filtrados de escarro a 10%, demonstram que sua presença pode alterar a arquitetura do biofilme.
As imagens foram analisadas com o software Comstat para obter os principais parâmetros do biofilme, incluindo a espessura média do biofilme, que foi aumentada quando tratada com 10% de escarro. A fim de avaliar os efeitos dos diferentes fatores no crescimento do biofilme, os isolados clínicos foram cultivados apenas em meio ou com escarro e foram tratados com ou sem antibiótico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como formar e tratar biofilmes em vidro de cobertura com câmara e prepará-los para coloração e análise confocal.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve a visualização e quantificação do desenvolvimento de biofilme em resposta à expectoração e a antibióticos, utilizando um modelo de câmara de lâmina. Este modelo facilita a observação direta das alterações no biofilme e permite uma análise detalhada por meio de software computacional.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Pesquisa em biofilmes
- Eficácia de antibióticos
Antecedentes
- Os biofilmes são comunidades complexas de microrganismos.
- Compreender a resposta dos biofilmes aos antibióticos é essencial para estratégias de tratamento.
- O escarro pode influenciar a eficácia dos antibióticos contra biofilmes.
- Este estudo tem como objetivo visualizar efetivamente essas interações.
Objetivo do Estudo
- Visualizar alterações em biofilmes devido à exposição ao escarro e a antibióticos.
- Quantificar o impacto de fatores do hospedeiro no desenvolvimento de biofilmes.
- Aprimorar o entendimento sobre a eficácia de antibióticos contra biofilmes.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de escarro.
- Diluição do escarro com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Mistura das amostras para uniformidade.
- Visualização do desenvolvimento de biofilme utilizando um modelo de câmara de lâmina.
Resultados Principais
- Visualização direta das alterações no biofilme em resposta a antibióticos.
- Análise quantitativa de parâmetros do biofilme.
- Compreensão da interação entre o escarro e a resposta do biofilme.
- Demonstração da eficácia de diferentes antibióticos.
Conclusões
- O modelo de câmara de microscopia é eficaz para estudar a dinâmica de biofilmes.
- Fatores do hospedeiro, como escarro, afetam significativamente o comportamento do biofilme.
- Essa metodologia pode orientar estratégias futuras de tratamento com antibióticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização quantitativa do desenvolvimento de biofilmes na presença de escarro de origem hospedeira e antibióticos aborda um desafio crítico na descoberta de agentes anti-infecciosos e na fidelidade do modelo translacional. Esta abordagem permite a redução de riscos mecanicistas ao revelar como fatores do hospedeiro modulam a eficácia do antibiótico e a arquitetura do biofilme, orientando a validação precoce de alvos e estratégias de triagem. O método oferece confiança preditiva para decisões em portfólios de P&D em doenças infecciosas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relativas à influência de fatores do hospedeiro na resiliência de biofilmes.
- Apoia a desmistificação biológica ao quantificar a resposta do biofilme a antibióticos em matrizes relevantes para a doença.
- Facilita a validação funcional de alvos ao medir a viabilidade e a arquitetura do biofilme sob condições definidas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas de biofilme validados para triagem de compostos em etapas subsequentes na presença de fatores clinicamente relevantes.
- Padroniza as condições do ensaio para garantir reprodutibilidade e comparação quantitativa entre os diferentes grupos experimentais.
- Gera resultados quantitativos robustos, como espessura e viabilidade do biofilme, para avaliação confiável dos compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos de biofilme in vitro com ambientes hospedeiros relevantes para a doença, aumentando a continuidade translacional.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao revelar o desempenho de antibióticos em matrizes biológicas complexas.
- Fornece subsídios mecanicistas sobre as interações entre hospedeiro, patógeno e fármaco para desvio preditivo de riscos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de lamínula com câmara integra-se à continuidade de descoberta a pré-clínico ao permitir testes orientados por hipóteses da eficácia de antibióticos em sistemas de biofilmes que mimetizam o hospedeiro.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o impacto de fatores do hospedeiro e a elucidação de vias no desenvolvimento de biofilmes.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para a priorização de compostos em contextos de biofilme.
- Análises: Oferece medições baseadas em imagens e saídas estatísticas para comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos pré-clínicos mediante a incorporação de matrizes relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e adaptável para a avaliação repetida de estratégias anti-biofilme.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista no desenvolvimento de fármacos anti-infecciosos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios de biofilme.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento e a eficiência do capital ao revelar a eficácia do fármaco dependente do contexto.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base no desempenho em sistemas que mimetizam o hospedeiro.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultivo de biofilmes, microscopia confocal e análise quantitativa de imagens.
- Necessita de acesso a sistemas de lamínulas com câmara, kits de coloração de viabilidade e software analítico, como o Comstat.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de preparação de amostras e aquisição de imagens.
- Pode exigir adaptação para diferentes espécies bacterianas ou matrizes derivadas de hospedeiro.
- Depende da otimização empírica dos parâmetros de coloração e aquisição de imagens para cada organismo.
