Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela
December 14th, 2016
Este protocolo descreve a visualização do desenvolvimento do biofilme após a exposição a fatores do hospedeiro usando um modelo de câmara de lâminas. Este modelo permite a visualização direta do desenvolvimento do biofilme, bem como a análise dos parâmetros do biofilme usando programas de software de computador.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar as alterações nos biofilmes em resposta ao escarro e antibióticos. Este método pode ser usado por pesquisadores para entender questões-chave, como como a eficácia de vários antibióticos contra biofilmes bacterianos pode ser afetada pela presença de escarro. A principal vantagem dessa metodologia é que ela permite que os indivíduos vejam as mudanças que ocorrem nos biofilmes em resposta a diferentes fatores.
Para iniciar o experimento, registre o volume da amostra de escarro obtida anteriormente. Adicione solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, adicione duas vezes o volume da amostra. Em seguida, use uma pipeta de transferência para misturar bem a amostra.
Vortex a amostra na configuração mais alta por um minuto para misturá-la completamente. Alíquota de um mililitro da mistura em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, gire os tubos.
Após centrifugação, guardar o sobrenadante e rejeitar o sedimento. Filtre esterilize o sobrenadante através de um filtro de 0,22 mícron e colete-o em um tubo de microcentrífuga limpo. Armazene o sobrenadante do escarro a 80 graus Celsius para uso futuro.
Coloque 40 microlitros de cultura previamente preparada em quatro mililitros de caldo Luria fresco, ou meio LB, e cultive as bactérias para obter uma cultura com densidade óptica de 0,55 a 600 nanômetros. Em seguida, dilua 100 microlitros de cultura 0,5 OD em 400 microlitros de filtrados de escarro a 10% preparados em LB. Use 200 microlitros da diluição para semear os poços das câmaras de lâminas. Deixe a bactéria se fixar por quatro horas a 37 graus Celsius sem tremer.
Após quatro horas, remova o meio e lave suavemente o biofilme com 1X LB fresco. Substitua o meio restante por 200 microlitros de LB fresco. Deixe os biofilmes crescerem a 37 graus Celsius sem tremer. Substitua o meio a cada 12 horas sem lavar até que o biofilme esteja pronto para microscopia. É muito importante lavar suavemente as lâminas para não interromper nenhuma bactéria presa.
Após o crescimento, remova a mídia dos poços da câmara e lave suavemente cada câmara duas vezes com 300 microlitros de PBS estéril. Em seguida, para preparar a mistura de coloração de biofilme, adicione um microlitro de cada corante fornecido no kit de viabilidade a cada mililitro de solução necessária e misture a solução. A quantidade ideal de corante e tempo de coloração é determinada empiricamente para cada organismo.
Adicione 200 microlitros da mistura de coloração a cada poço da lamínula com câmara. Incube a lamínula. Após a incubação, remova a mistura de coloração das câmaras e lave cada poço com 300 microlitros de PBS estéril.
Substitua o PBS por mídia nova. Por fim, prossiga com a visualização via microscopia confocal. Imagens representativas do complexo Burkholderia cepacia, ou isolados clínicos de CBC, após 48 horas de crescimento em lamínula com câmara isolada ou na presença de filtrados de escarro a 10%, demonstram que sua presença pode alterar a arquitetura do biofilme.
As imagens foram analisadas com o software Comstat para obter os principais parâmetros do biofilme, incluindo a espessura média do biofilme, que foi aumentada quando tratada com 10% de escarro. A fim de avaliar os efeitos dos diferentes fatores no crescimento do biofilme, os isolados clínicos foram cultivados apenas em meio ou com escarro e foram tratados com ou sem antibiótico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como formar e tratar biofilmes em vidro de cobertura com câmara e prepará-los para coloração e análise confocal.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a visualização e quantificação do desenvolvimento de biofilmes em resposta ao escarro e antibióticos usando um modelo de câmara deslizante. Este modelo facilita a observação direta das mudanças no biofilme e permite uma análise detalhada usando software de computador.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Pesquisa de biofilme
- Eficácia de antibióticos
Fundamento
- Biofilmes são comunidades complexas de microrganismos.
- Entender a resposta do biofilme aos antibióticos é crucial para estratégias de tratamento.
- O escarro pode influenciar a eficácia dos antibióticos contra biofilmes.
- Este estudo visa visualizar efetivamente essas interações.
Propósito do Estudo
- Visualizar mudanças em biofilmes devido à exposição ao escarro e antibióticos.
- Quantificar o impacto de fatores do hospedeiro no desenvolvimento do biofilme.
- Aprimorar a compreensão da eficácia dos antibióticos contra biofilmes.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de escarro.
- Diluição do escarro com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Mistura das amostras para uniformidade.
- Visualização do desenvolvimento do biofilme usando um modelo de câmara deslizante.
Principais Resultados
- Visualização direta das mudanças no biofilme em resposta aos antibióticos.
- Análise quantitativa dos parâmetros do biofilme.
- Insights sobre a interação entre o escarro e a resposta do biofilme.
- Demonstração da eficácia de diferentes antibióticos.
Conclusões
- O modelo de câmara deslizante é eficaz para estudar a dinâmica do biofilme.
- Fatores do hospedeiro como o escarro afetam significativamente o comportamento do biofilme.
- Esta metodologia pode informar futuras estratégias de tratamento antibiótico.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of biofilm development in the presence of host-derived sputum and antibiotics addresses a critical challenge in anti-infective discovery and translational model fidelity. This approach enables mechanistic de-risking by revealing how host factors modulate antibiotic efficacy and biofilm architecture, informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for portfolio decisions in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding host factor influence on biofilm resilience.
- Supports biological de-risking by quantifying biofilm response to antibiotics in disease-relevant matrices.
- Facilitates functional target validation by measuring biofilm viability and architecture under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biofilm systems for downstream compound screening in the presence of clinically relevant factors.
- Standardizes assay conditions for reproducibility and quantitative comparison across experimental arms.
- Generates robust, quantitative outputs such as biofilm thickness and viability for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant host environments, enhancing translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing antibiotic performance in complex biological matrices.
- Provides mechanistic insight into host-pathogen-drug interactions for predictive de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This chambered coverglass model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of antibiotic efficacy in host-mimetic biofilm systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on host factor impact and pathway clarification in biofilm development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound prioritization in biofilm contexts.
- Analytics: Provides image-based measurements and statistical outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by incorporating disease-relevant matrices.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated evaluation of anti-biofilm strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective R&D.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of biofilm assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by revealing context-dependent drug efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on performance in host-mimetic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biofilm culture, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to chambered coverglass systems, viability staining kits, and analytical software such as Comstat.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different bacterial species or host-derived matrices.
- Dependent on empirical optimization of staining and imaging parameters for each organism.
