Visualizando o Tissue interrenais Steroidogenic e sua Vascular Microenvironment em Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é detectar células esteroidogênicas interrrenais diferenciadas no peixe-zebra em desenvolvimento por meio de um ensaio simples de atividade enzimática de montagem total. Este procedimento de coloração pode ajudar a responder a questões-chave sobre os mecanismos moleculares e celulares da formação e malformação da glândula interrenal. A principal vantagem deste ensaio de coloração é que ele é rápido, simples e confiável, tornando-o uma ferramenta poderosa para triagens genéticas ou químicas em peixes-zebra.

Este procedimento pode ser realizado em linhas repórteres fluorescentes transgênicas, marcando o rim e os vasos sanguíneos para que vários tecidos no mesmo embrião possam ser analisados. Em combinação com secção de vibrato, imuno-histoquímica e microscopia confocal, o microambiente vascular do tecido interrenal também pode ser visualizado. Depois de preparar soluções de estoque para três colorações de atividade beta-Hsd de acordo com o protocolo de texto, coloque embriões de peixe-zebra em desenvolvimento em 0,03% PTU em água de ovo para inibir a formação de pigmento.

Fixe embriões descorionados, ou larvas, em 2% ou 4% PFA em PBS com 0,1% Tween 20 ou PFAT. Com PBST, lave os embriões quatro vezes por 10 minutos cada, garantindo que as amostras não sequem entre as lavagens. Antes das reações de coloração, prepare as partes A e B em tubos separados, depois vortex e centrifugue as soluções.

É essencial preparar as partes A e B em tubos separados. Adicionar todos os componentes diretamente em um único tubo causará precipitação severa imediatamente. Adicione todo o tubo da parte A a todo o tubo da parte B. Misture bem e distribua imediatamente um mililitro em cada tubo de microcentrífuga contendo embriões fixos e lavados.

Use papel alumínio para embrulhar os tubos e coloque-os em temperatura ambiente em um rotador ou plataforma de balanço com agitação suave. Determine empiricamente o tempo de reação usando um microscópio para monitorar sinais cromogênicos. Pequenas precipitações se desenvolverão ao longo do tempo que não interferirão no processo de reação.

Pare a reação usando PBST para lavar os embriões quatro vezes por 10 minutos cada e, em seguida, pós-fixe os embriões corados com 4% de PFAT em temperatura ambiente por 60 minutos. Para microscopia de montagem total, use 50% de glicerol em PBS para limpar os embriões. Em seguida, depois de orientá-los com o lado dorsal voltado para cima, observe as amostras usando um microscópio vertical sob iluminação de campo claro.

Retire a gema do embrião e use-o para preparar uma montagem plana. Em seguida, capture uma imagem de alta resolução da morfologia do tecido interrenal. Para analisar o microambiente vascular do tecido esteroidogênico, pós-fixar os embriões corados com 2%PFA.

Suplemente-o com 1% de Triton X-100 a quatro graus Celsius por uma hora e use PBST-X para lavar os embriões em temperatura ambiente quatro vezes por 10 minutos cada. Para incorporar os embriões, prepare agarose 4% de baixo ponto de fusão dissolvendo a agarose em PBS a 95 graus Celsius. Em seguida, alíquota em tubos de microcentrífuga e armazene a quatro a oito graus Celsius.

Derreta uma alíquota de agarose 4% de baixo ponto de fusão a 70 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, mantenha a alíquota a 47 graus Celsius. Usando uma tampa separada de um tubo de microcentrífuga de 1,5% mililitro como molde, incorpore um embrião em agarose derretida e deixe-o esfriar até ficar sólido. Para realizar o seccionamento do vibratomo, cole um pedaço de fita adesiva na plataforma seca do vibratomo.

Em seguida, use uma lâmina de barbear para remover o bloco de agarose endurecido do molde. Aplique supercola na fita de papel na plataforma e fixe o bloco de agarose na fita de papel com o lado anterior da amostra voltado para cima. Em seguida, apare o bloco de agarose em forma de prisma trapezoidal com aproximadamente quatro a oito milímetros de cada lado das facetas superior e inferior, respectivamente.

Use um conta-gotas cheio de PBS frio com 0,5% Trident X-100 para enxaguar o bloco de agarose. Em seguida, use um vibratomo de acordo com as instruções do fabricante para preparar seções de 100 micrômetros. Com uma agulha de calibre 26, remova as seções cortadas do vibratomo e transfira-as para uma placa pontual contendo 500 microlitros de 0,5% PBST-X frio por poço.

Colete as três seções de tecido positivo para atividade beta-Hsd verificando em um microscópio de dissecção e use uma ponta de pipeta para transferir as seções para uma placa de 96 poços contendo 0,5% PBST-X frio. Pinte e crie imagens adicionais das seções de acordo com o protocolo de texto. Para determinar como o tecido interrenal esteroidogênico se desenvolve co-desenvolvimento com o glomérulo renal pronéfrico e sua vasculatura nascente, o ensaio de atividade enzimática de três beta-Hsd foi realizado em um embrião de peixe-zebra transgênico duplo, expressando fluorescência específica do rim e específica do endotélio.

Como mostrado aqui, três tecidos esteroidogênicos positivos para beta-Hsd estão localizados à direita da linha média e imediatamente se entrelaçam no glomérulo renal pronéfrico. Algumas células esteroidogênicas também começam a migrar através da linha média. Essas seções de vibratomo de embriões transgênicos expressando GFP endotelial submetidos ao ensaio de três beta-Hsd foram analisadas por imuno-histoquímica para detectar fibronectina e seu efetor a jusante, a quinase de adesão focal fosforilada.

A deposição de fibronectina na aorta peridorsal é essencial para apoiar o crescimento dos vasos interrenais. Para o embrião ou larva de peixe, a coloração histoquímica de montagem inteira pode ser feita dentro de um dia se for realizada corretamente. Embora esse método de coloração seja simples e rápido, é importante lembrar que ele está detectando apenas uma única enzima da via esteroidogênica.

Se o objetivo for uma análise do desenvolvimento do tecido interrenal, além deste ensaio, a habitação in situ terá que ser realizada para detectar a expressão de outros genes críticos envolvidos na esteroidogênese.