Name: Transiente Artéria Cerebral Média Oclusão Modelo de AVC neonatal em ratos P10 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda o modelo de oclusão transitória da artéria cerebral média em ratos neonatos P10 para pesquisa de AVC. Este método reproduz isquemia focal com reperfusão, permitindo estudar mecanismos de lesão e reparo cerebral.

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O financiamento foi fornecido pelas doações NIH K08 NS064094 e UCSF REAC. Os autores gostariam de agradecer a Nikita Derguin, Zinalda Vexler e Joel Faustino por sua assistência no desenvolvimento desta técnica.

Toda a pesquisa animal foi aprovado pela Universidade da Califórnia, o Comitê de San Francisco em Pesquisa Animal e foi realizada de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Departamento de Saúde e Serviços Humanos, Publicação No. 85-23, 1985 EUA ). Os animais foram acompanhados de perto por veterinários da Comissão de UCSF Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC), credenciado pela AAALAC. Obteve-se uma fêmea Sprague-Dawley com uma maca oito dias de idade (10 filhotes por ninhada). A mãe e seus filhotes receberam comida e água ad libitum e alojados em uma instalação de cuidados de animais com temperatura e luz controlada com o enriquecimento diário, por protocolo IACUC, até que os filhotes foram 10 dias de idade. Todos os instrumentos cirúrgicos utilizados neste procedimento foram autoclavados para garantir a esterilidade. Sterility de dicas de instrumento é mantida durante toda a cirurgia. 1. Oriente oclusão da artéria cerebral <ol><li> Pesar o filhote e assegue que é o peso adequado (19-21 g). Anestesiar a cinzento em 3% de isoflurano em 100% de O2 e assegurar que não há resposta a uma pitada pé. Manter a temperatura da superfície do corpo entre 35,5 ° C e 37 ° C com o uso de uma almofada de aquecimento sob o estrado cirúrgico. </li><li> Garantir o animal em decúbito dorsal com fita adesiva em todas as regiões do ombro. Usando cotonetes estéreis, pincelar a área cervical anterior com uma solução de povidona-iodo seguido por uma haste de 70% de etanol em água destilada duas vezes, alternando entre cada solução durante quatro cotonetes totais. </li><li> Localmente infiltrar bupivacaína a 0,25% para o local da incisão planeada. Usando um estereoscópio, fazer uma linha média incisão cervical de 5 a 7 mm anterior para expor a artéria carótida comum (ACC). Coloque 2-4 retratores para manter a cavidade aberta ea artéria exposta. </li><li> Localizar a artéria carótida interna (ICA), artéria occipital (OA), e a artéria carótida externa (ECA). Noivo artérias para obter uma visão clara. Seja de carroeful para não perturbar o nervo vago. NOTA: Para filhotes sham-operado, o inicision é deixada em aberto e as artérias estão expostos, após o qual a incisão é suturada fechada. O tempo total de anestesia é equivalente ao da cirurgia de oclusão. </li><li> Cortar 1,5 cm de seda 6-0 fio trançado de sutura. Unbraid a sutura, puxando cadeias simples. Certifique-se de que as cadeias simples são puros e não desgastado. NOTA: Se necessário, alisar as extremidades desgastadas por imersão a cadeia simples em ua estil e preparar o filamento com pontas fórceps. </li><li> Enquanto segura o fio de sutura com uma pinça de 45 graus, mova a pinça em um movimento de arco varrendo para ir ao abrigo do AIC para que as pontas fórceps emergir entre o ICA e OA. NOTA: Se a dissecção é bem feito, esta etapa será relativamente fácil. Se o ICA e OA se tocam, ter cuidado para não romper as artérias ao usar a pinça para isolar o ICA. Se ocorre sangramento, aplicar pressão à artéria com a pinça atéo sangramento pára. Absorver o sangue com uma zaragatoa estéril. </li><li> Agarre o fim do fio de sutura que é realizada pelas pinças e puxá-lo para que o final é de fácil acesso. Libertar a cadeia a partir dos fórceps e voltar a pinça para fora de debaixo da AIC, invertendo o movimento no passo 1.5 (Figura 1A). </li><li> Amarrar uma ligadura temporária em torno do ACI na base, mais próxima de onde ele se separa do CCA. NOTA: É importante para o nó de modo a que a extremidade do fio que irá ser puxada para remover o nó é o tempo suficiente (superior a 1 mm, menos do que 3 mm) para agarrar facilmente com uma pinça, assegurando ao mesmo tempo que há uma quantidade apropriada de fio de sutura sobre o outro lado do nó para retracção. </li><li> Cuidadosamente retrair o ICA lateralmente e usar um grampo para prender o fio para o excesso de pele perto da região da axila do lado oposto ao da incisão. Certifique-se de que esta cadeia de retracção é tenso suficiente para parar o fluxo de sangue antes de prosseguir para o próximo passo, aminimizar o risco de sangramento descontrolado. Observa-se que a artéria é plana e pálido. NOTA: Não excesso de retração, pois pode causar uma ruptura parcial ou total do ICA. A retracção pode ser ajustado apenas antes de fazer a arteriotomia puxando sobre o fio, no lado oposto ao grampo. </li><li> Usar 45 ° pinça para agarrar um outro fio de sutura soltos e ciclo-lo sob e em torno do ACI, como no passo 1.5. Posicionar este cordão lateralmente à cadeia de retracção (Figura 1B). NOTA: Este passo também pode ser feito antes de retração. Se não tiver certeza sobre a qualidade da retração, este nó pode ser muito vagamente amarrado antes da próxima etapa. </li><li> Cortar uma arteriotomia a meio caminho entre os 0,2 milímetros e amarradas ligaduras não ligados, erring mais perto da ligadura amarrado. NOTA: O sangue restante na artéria amarrado-off pode esvaziar por meio da arteriotomia, mas não deve ser superior a 5 mL. Se a hemorragia persistir, puxar cuidadosamente o fio de retracção para aumentar a retracção, com o cuidado de umvazio danificar a artéria a partir de uma tensão excessiva. </li><li> Usando uma régua métrica, medir a sutura de oclus e cortar o fio de sutura com uma redução adicional de 2-3 mm para a remoção do oclusor durante a reperfusão. Segure o oclusor com uma pinça de 45 graus e utilize uma pinça reta para criar uma curva no comprimento adequado para chegar ao MCA, marcando um ponto de parada para o avanço. NOTA: Um comprimento de oclus 10 mm a partir da extremidade da ponta de silicone para a curvatura é usado para P10 Sprague Dawley ou ratos Long Evans crias nesta gama de peso. </li><li> Usando fórceps 45 °, alimentar a sutura oclusão de nylon revestido a silicone para o arteriotomia e avançar o fio de sutura para a curvatura que marca a distância pré-determinada para a MCA (Figura 1C). Certifique-se de que o avanço é suave; parar imediatamente o avanço se sentir resistência. Durante o avanço, o objectivo da sutura numa direcção que é paralela ao CC / CEA, para a cabeça. NOTA: Se a sutura é dorsalmente avançado, em direçãoespinha do animal, ele pode ser executado na artéria pterigopalatina (PTA). Se houver resistência depois de 3-5 mm de avanço, a sutura tenha atingido a junção PTA. Cópias do oclusor para fora da artéria até que a cabeça de silicone é perto da arteriotomia antes de ajustar a direcção do avanço. Não é necessário para remover completamente o oclusor da arteriotomia. </li><li> Fixar o oclusor atando uma ligadura temporária, utilizando o filamento a partir do passo 1.10 (Figura 1D). </li><li> Remova o clipe afastador. Aparar os fios de ambas as ligaduras temporárias de modo que a cadeia do nó que é puxada para remover o nó é fácil de agarrar com fórceps rectas e é mais longo do que o cordão que é puxada para apertar o nó. NOTA: Os fios devem ser curto o suficiente para que eles não se enredar na cavidade após o encerramento. </li><li> Retire os retratores e fechar a cavidade utilizando seda 6-0 trançado para criar três a quatro suturas interrompidas. </li><li> Remover o filhote deanestesia e colocá-lo em uma almofada de aquecimento em ar ambiente. Monitorar o filhote até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal e garantir que ele está totalmente recuperado antes de voltar para a represa. Certifique-se de que o cachorro mantém uma temperatura da superfície do corpo entre 35,5 ° C e 37 ° C. </li><li> Durante a oclusão, imagens de ressonância magnética ponderadas por difusão (DW-MRI) sob anestesia com isoflurano pode ser utilizado para verificar a iniciação adequada de lesão. A Figura 2 demonstra a lesão isquémica em curso detectada por DW-MRI durante tMCAO 9. NOTA: A difusão ponderada rotação de imagem planar eco é realizada 10-15 minutos antes da reperfusão. Todo o cérebro é representada por imagem com secções coronais de 2 mm de espessura em série usando as seguintes configurações de sequências de pulso: TR / TE = 5000/60 ms, 4 médias, campo de visão = 35 mm, matriz de dados = 128x128, duração gradiente de difusão = 20 ms, a separação = 29,7 ms, de amplitude = 70mT / m, e b-factor = 1,045 s / mm 2.Os animais que exibem uma falta de envolvimento cortical ou lesão isquémica atípica, tal como na base do cérebro, estão excluídos. </li></ol> 2. A reperfusão NOTA: A oclusão é realizada durante 3 horas para fazer com que uma quantidade moderada a grave de lesões envolvendo o corpo estriado e ctex. <ol><li> Em cerca de 2 h e 50 min após a oclusão da MCA, anestesiar a cinzento em 3% de isoflurano em 100% de O2. Manter uma temperatura de superfície corporal entre 35,5 ° C e 37 ° C com o uso de uma almofada de aquecimento sob o estrado cirúrgico. </li><li> Retirar as suturas interrompidas a partir do passo 1.16 e localizar a junção, que é marcada por as duas ligaduras e a extremidade de cauda da sutura de oclus. NOTA: animais sham-operados são induzidas e permanecem sob anestesia por um período de tempo equivalente ao dos animais obstruídos. A incisão é novamente aberta e suturada fechada. Para os animais sham-operado, vá para o passo 2.11. </li><li> cuidadosamente desataro nó mais lateral previamente amarrados no passo 1.14, puxando o fio mais longo. NOTA: Se houver resistência em desatar o nó, pare para garantir que o fio correto do nó está sendo puxado. Se a resistência continua, aumentar a ampliação para uma melhor visualização. Seja cauteloso quando desatar, como é possível danificar a artéria durante esta etapa. </li><li> Remover o fio de sutura a partir da cavidade. </li><li> No exactamente 3 h após a oclusão MCA, lentamente para trás a sutura de oclus para fora da artéria. Não haverá resistência. NOTA: Na maioria dos casos, não haverá sangramento. Se uma pequena quantidade de hemorragia ocorre, aplicar pressão com a artéria no local da arteriotomia. </li><li> Utilizar uma pinça para aplicar pressão à arteriotomia, como o passo seguinte restaura o fluxo de sangue para ICA reperfusão. </li><li> Cuidadosamente desatar o nó medial utilizando o mesmo método que no passo 2.3. </li><li> Remover o fio de sutura a partir do corpo e aplicar um agente hemostático para o arteriotomia para parar a hemorragia. </li&gt; <li> Certifique-se de que o sangramento parou. NOTA: O Retorno de forma original da artéria e cor vermelha confirma que o fluxo sanguíneo ICA foi restaurado. </li><li> Retire os retratores e fechar a cavidade com três a quatro suturas interrompidas de seda 6-0 trançado. </li><li> Remover o filhote da anestesia e colocá-lo em uma almofada de aquecimento em ar ambiente. Monitorá-lo até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal e garantir a recuperação total antes de voltar para a represa. Certifique-se de que o cachorro mantém uma temperatura da superfície do corpo entre 35,5 ° C e 37 ° C. </li><li> Inspeccionar os filhotes por dia durante 5 dias. Recprd seus pesos e inspecionar os locais de incisão de perto para a cura apropriada. Retirar as suturas após 7-14 dias. Lesão pós-tMCAO pode ser trabalhada com MRI, se desejado 9. NOTA: Os animais podem perder até 1 g de peso no primeiro dia, mas normalmente recuperar o peso sem intervenção e estar dentro de um semelhante pesart gama de controlos por dia 4-5. Raramente, um cachorro pode perder o excesso de peso ou têm dificuldades de alimentação, o que requer sonda oral alimenta durante 2-3 dias. </li><li> Em P21, as lesões podem ser fiavelmente avaliada com testes comportamentais sensório-motores, tais como a criação de rotarod ou cilindro. Testes cognitivos pode ser realizado tão cedo quanto 4-6 semanas de idade usando avaliações tal como novo reconhecimento de objectos ou do labirinto de água de Morris 13. </li><li> Eutanásia os ratos por injecção intraperitoneal de Euthasol (50 mg / kg) para a colheita cérebro 11, 12. </li><li> A análise histológica para avaliar o volume da lesão ou resposta a intervenções podem ser realizadas com violeta de cresilo ou coloração de H &amp; E (Figura 3) 10. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

passos críticos dentro do protocolo Em primeiro lugar, é importante para manutenção da temperatura a partir do início da anestesia até à recuperação total, como não são conhecidos os efeitos de ambos hipotermia 17 e hipertermia 18 sobre a progressão da lesão cerebral, tanto em animais imaturos e maduros. Em segundo lugar, ao mesmo tempo garantir o animal e retracção da incisão, o posicionamento ideal para monitorizar a respiração e para assegurar que a traqueia é livre de compressão é essencial. Terceiro, evite espremer ou esticar o nervo vago, pois isso pode causar alterações na frequência cardíaca com a estimulação vagal. Em quarto lugar, porque a retracção da ICA é necessário para controlar a hemorragia durante a arteriotomia, deve ser dada atenção ao grau de tensão durante a retracção para evitar danificar a artéria. Se a artéria se rasgue de retracção, ou se existe um mau incisão arteriotomia, o animal deve ser excluída da análise devido ao riscode hemorragia e pobre reperfusão. Modificações e solução de problemas Usando MRI como um guia, o comprimento do fio de sutura pode ser optimizada para garantir que a ponta de silicone oclui adequadamente a MCA para criar a isquemia focal. Se MRI não está disponível, os filhotes podem ser sacrificados antes da reperfusão para dissecação para visualizar a colocação da sutura. Ajustar o comprimento de fio de sutura, conforme necessário. O peso das crias altamente correlacionado com os requisitos de comprimento de sutura de oclus. O tempo de oclusão pode ser modificado para ajustar o grau de severidade da lesão. Além disso, a forma e comprimento da sutura são críticos. Para P10 ratos Sprague-Dawley e Long Evans pesando 19-21 g, 10 mm é o comprimento óptimo da inserção na nossa experiência. Além disso inserção da sutura de oclus pode resultar na perfuração da MCA. Além disso, a consistência da forma do filamento de oclus em cada cirurgia irá resultar num aumento da consistência da lesão pattern 19, 20. Por este motivo, recomendamos utilizando suturas profissionalmente-fabricados para esse fim específico. Também é importante notar que o padrão de lesão podem diferir entre os profissionais, devido às diferenças aparentemente hora em técnica. Limitações da técnica Realizar esta técnica em uma pequena, desenvolvendo roedor requer experiência significativa. Se realizada corretamente, o cirurgião é capaz de causar um padrão de lesão muito consistente entre animais de diferentes tamanhos e atingir uma taxa de sobrevivência superior a 95%. Além disso, ferramentas cirúrgicas adequadas são essenciais. Os instrumentos cirúrgicos devem ser bem conservado para garantir que todas as dicas de instrumentos aproximar corretamente. Significado desta técnica no que diz respeito aos métodos existentes ou alternativos Enquanto a hipóxia-isquémia, ou o arroz-Vannucci modelo dois </sup&gt;, é mais comummente utilizado para estudar lesão hipóxico-isquémica no cérebro em desenvolvimento, é importante notar que este modelo de tMCAO é distinto de HI em que não é a isquemia focal transiente sem hipoxia global, seguido de uma fase de reperfusão, quando o obstrução seja removida e o fluxo sanguíneo é restaurado. Isto provoca uma lesão mais consistente e reprodutível e é mais clinicamente translação, fazendo com que um padrão de lesão similar à observada em acidente vascular cerebral neonatal a termo. Isto permite o estudo de padrões de danos focais e respostas compensadoras em tecido não lesado. As aplicações futuras Depois de dominar esta técnica Este modelo é semelhante ao a causa mais comum de acidente vascular cerebral em recém-nascidos humanos, um trombo oclusiva transitória que ocorre durante o período perinatal 11, 21. A etiologia não é totalmente clara e é mais provável multifatorial, mas presume-se, na maioria dos casos tO resultado de êmbolos que passam a partir da placenta 11. Além disso, muitos recém-nascidos com AVC perinatal presume frequentemente presentes com actividade convulsiva ou posterior exame neurológico focal subtil anormalidades 22. Isso faz com que o uso de um modelo de lesão consistente, translacional para identificar mecanismos de progressão de lesões e possíveis estratégias terapêuticas cruciais.

Acidente vascular cerebral durante o período neonatal é uma importante causa de morte e incapacidade, ocorrendo em até 1 em 2.300 nascidos vivos 1. Isto leva ao desenvolvimento do sistema nervoso central alterada e o aumento da morbidade a longo prazo, incluindo o aumento da incidência da epilepsia, da paralisia cerebral, retardo mental cerebral, e outros tipos de motor ou disfunção cognitiva. Os efeitos ao longo da vida de acidente vascular cerebral precoce fazer modelos animais translacionais essencial para examinar os mecanismos de lesão e reparação nesta população, incluindo estratégias para proteger o cérebro ferido ou para melhorar a reparação. Diferentes modelos de isquemia têm sido utilizados para estudar a lesão cerebral em animais adultos, e enquanto o arroz-Vannucci (modificação Levine) 2 procedimento é comummente utilizado para estudar lesão hipóxico-isquémica no cérebro em desenvolvimento, focal isquemia-reperfusão é um mecanismo distinto da lesão causando lesão focal, com um núcleo de feridos e Penumbra e tecido remoto ileso. Os Koizumi 3 e 4 Longa modelos foram desenvolvidos em ratos adultos para atingir a oclusão da artéria cerebral média transiente através da artéria carótida comum (ACC) e a artéria carótida externa (ECA), respectivamente. Em ambos os modelos, a ligação permanente e cauterização dos ramos da artéria são importantes para minimizar o sangramento e para agilizar o procedimento cirúrgico, o que também provoca efeitos adversos sobre a capacidade do animal para se alimentar e ganho de peso após a lesão. Por outro lado, existem mecanismos de lesão distintos no cérebro imaturo e padrões específicos de lesão vistos como um resultado. Mais recentemente, acidente vascular cerebral photothrombotic (método de Rose Bengal-) 5 e permanente ligadura MCA 6 têm sido usados para estudar acidente vascular cerebral neonatal e adulto. Ambos acidente vascular cerebral photothrombotic e MCA ligadura criar alterações permanentes no fluxo sanguíneo cerebral que resultam numa falta de reperfusíon. A reperfusão é um componente crítico no desenvolvimento e progressão da lesão focal, com o aumento da excitotoxicidade, formação de radicais livres, e produção de óxido nítrico, levando à morte celular retardada que envolve a cascata de sinalização que são distintas a partir da fase isquémica 7. Hipóxia-isquemia envolve permanente ligação da carótida unilateral seguido por hipoxia global, que também difere da causa de lesão hipóxico-isquêmica em seres humanos e não causa um padrão de lesão focal consistente, fazer estudo do núcleo ferido e penumbra mais desafiador. Foi anteriormente descrito um modelo de acidente vascular cerebral isquemia-reperfusão não-hemorrágica no rato imaturo usando a oclusão da artéria cerebral média transiente (MCAO) 8, 9, 10. Este é um método menos invasivo que acede e provoca a oclusão da ACM através da artéria carótida interna sem ligati permanenteon ou cauterização. Isto fornece um modelo de lesão semelhante à causa mais comum de acidente vascular cerebral no período perinatal 11, 12. Este modelo de isquemia-reperfusão dos resultados de lesão em danos para o corpo estriado ipsilateral e córtex parietal e temporal. Este modelo de tMCAO também permite o controle sobre a gravidade da lesão através da variação da duração da oclusão. O exame das vias de sinalização e alterações histológicas no núcleo lesionado e penumbra e no tecido não lesionado contralateral e ipsilateral pode adicionalmente elucidar os mecanismos de lesão e reparação no cérebro imaturo. Este estudo irá demonstrar este modelo lesão importante para o desenvolvimento cerebral.

<table><tbody><tr><td>Isoflourano</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td>anestésico, a 3%&nbsp;</td></tr><tr><td>Cirurgioscópio Trinocular</td><td>World Precision Instruments</td><td>PSMT5N</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td> configuração <td>baixa a média</td></tr><tr><td>Termômetro IR</td><td>Extech Instruments</td><td>72-5270</td><td></td></tr><tr><td>Kit de retração para pequenos animais&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>CermaCut Tesouras</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de #5SF Dumont</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>112522-00</td><td>2x</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11251-35</td><td>2x</td></tr><tr><td>B-2 Micro Grampo</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts para Aplicação de Grampo</td><td>Fino Ferramentas de Ciência</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vannas Tesoura</td> Ferramentas de <td>Ciência Fina</td><td>15000-03</td> Suturas de Oclusão de <td>Borda de Corte de 2mm</td></tr><tr><td></td><td>Doccol</td><td>602123PK10</td><td>701712PK5Re</td></tr><tr><td>Régua</td> Ferramentas de <td>Ciência</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fina Agente Hemostático&nbsp;</td><td>Avitene</td><td>DVL1010590</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSutura</td><td>Ethicon</td><td>769G</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>0,22 mL/kg</td></tr><tr><td>Aplicadores com Ponta de Algodão</td><td>Henry Schein</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Laboratório</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr></tbody></table>

transiente artéria cerebral média oclusão modelo de avc neonatal em ratos p10

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Vários modelos animais têm sido usados para estudar lesão hipóxico-isquêmica, lesão traumática, hipóxia global ou isquemia permanente no cérebro imaturo e maduro. O AVC ocorre comumente no período perinatal em humanos, e a isquemia-reperfusão transitória é a forma mais comum de AVC em neonatos. A fase de reperfusão é um componente crítico da progressão da lesão, que ocorre ao longo de um período de dias a semanas, e da resposta endógena à lesão. Este modelo de rato pós-natal dia 10 (p10) de oclusão transitória da artéria cerebral média (tMCAO) cria uma lesão focal de isquemia-reperfusão unilateral e não hemorrágica que pode ser utilizada para estudar os mecanismos de lesão focal e reparo no cérebro equivalente a termo. O padrão de lesão produzido pelo tMCAO é consistente e altamente reprodutível e pode ser confirmado com ressonância magnética ou análises histológicas. A gravidade da lesão pode ser manipulada por meio de mudanças no tempo de oclusão e outros métodos que serão discutidos.

A gravidade da lesão causada por tMCAO é altamente dependente tanto o tempo de oclusão e da experiência do cirurgião. A 90-minutos de oclusão, muitas vezes produz um padrão de lesão ligeira a moderada, enquanto 3 h produz uma lesão moderada a grave. A gravidade da lesão pode ser avaliada através de uma variedade de métodos, incluindo ressonância magnética, histologia, ou análises de comportamento de curto ou de longo prazo. Figura 2 demonstra um exemplo de DW-RM realizada 75 min para uma oclusão de 90 minutos, confirmando a lesão isquémica envolvendo o hemisfério ipsilateral. Difusão de imagem ponderada demonstra um aumento da difusão no estriado ipsilateral e a maior parte do córtex ipsilateral, sem alterações contralateral, durante a fase aguda isquémica. Isso se correlaciona com um nível moderado de danos a longo prazo que envolve tanto o córtex ea substância cinzenta profunda. Oclusão dos resultados da ACM emmorte celular que começa no striatum de lesão menos grave e desenvolve agravamento lesões corticais e do hipocampo para tempos de oclusão mais longos e lesão mais grave. Durante a optimização da técnica cirúrgica, tal como a determinação do comprimento de inserção da sutura, RM é altamente recomendada, uma vez que permite a confirmação da colocação do fio de sutura adequado e visualização de edema e progressão da lesão durante a oclusão 14, 15, 16. Se IRM não está disponível, H &amp; E ou coloração com violeta de cresilo são métodos histológicos simples e fiáveis ​​para determinar a morfologia lesão e pode ser usado em ambos os pontos de tempo precoces e tardios após a tMCAO. Figura 3 demonstra um padrão de lesão moderada a grave no exame histopatológico após uma oclusão 3 h, demonstrando a formação de cistos e o volume do corpo estriado ipsilateral e córtex. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" quantifica estereologia imparcial de sec cresilo-violeta-coradas para calcular a rela ipsilateral ao volume hemisf contralateral confirma les isqu e reperfus ipsilateral. especificamente ap anestesiar os animais com euthasol o c foi colhido por perfus transcard em m pbs paraformalde seguindo postfixation durante noite equil sacarose todo foram seccionados um intervalos cada xii seleccionado montadas coradas violeta cresilo>10. Mesmo com lesão leve, alterações do aparelho locomotor, tal como circulando e hemiparesia, são observadas durante o período de oclusão. Com lesão mais grave, estas mudanças irão persistir após a reperfusão. teste comportamental adicional pode ser usado para avaliar a gravidade da lesão, incluindo rotarod ou cilindro testes de criao para função sensório-motora e o labirinto de água de Morris parafunção cognitiva 13. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg"> Figura 1: Imagens cirúrgicas ao vivo do Procedimento tMCAO. (A) A primeira cadeia de sutura está enrolado em torno do ACI, como detalhado no passo 1.6. (B) A primeira ligadura temporária está ligado e o ICA é retraído. O segundo fio de sutura está enrolado em torno do ACI, lateral para o primeiro fio de sutura, tal como descrito na etapa 1.9. (C) O silicone revestido sutura oclusão é alimentado para o local da arteriotomia, como detalhado no passo 1.12. (D) A segunda ligadura temporária está ligado para assegurar a oclusão no lugar, tal como detalhado no passo 1.14. Escala da barra = 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg"> Figura 2: RM Durante OCCLusion Demonstra o apropriado lesão unilateral. Anterior para posterior, as fatias de imagem coronais do DW-MRI, realizados durante um 90 minutos de oclusão, demonstram o aumento de difusão envolvendo o hemisfério ipsilateral (setas), o que é consistente com a lesão isquémica em curso na fase aguda. Reproduzido com permissão do curso 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg"> Figura 3: unilateral lesão envolvendo o estriado e córtex em 4 semanas seguintes tMCAO. Posterior para anterior, cresilo-coradas com violeta secções cerebrais coronais (cada 50 um) colhidos a partir de P38 animais demonstram lesão bastante grave (as setas mostram a formação de cistos ipsilateral e reduzida e corticalo volume do corpo estriado) na sequência de um 3 h tMCAO em P10. O orifício redondo no lado esquerdo representa um identificador hemisfério contralateral. Barra de escala = 5 mm. Reproduzido com permissão do Neurobiology of Disease 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O AVC neonatal é uma causa significativa de lesão cerebral precoce, exigindo um modelo translacional com padrões consistentes de lesão focal e alta reprodutibilidade para permitir o estudo. Este estudo descreve o procedimento cirúrgico detalhado para a criação de uma lesão de isquemia-reperfusão focal unilateral não hemorrágica em roedores equivalentes a termo.

Transiente Artéria Cerebral Média Oclusão Modelo de AVC neonatal em ratos P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

O objetivo geral da oclusão transitória da artéria cerebral média em ratos neonatais é fornecer um modelo translacional de AVC em neonatos a termo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da lesão cerebral isquêmica neonatal, entendendo os mecanismos de lesão e reparo no cérebro em desenvolvimento e como podemos modificá-los com diferentes estratégias terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um modelo fisiologicamente preciso de AVC isquêmico arterial focal em neonatos e também inclui um componente de reperfusão, que é uma parte importante da progressão da lesão em neonatos humanos.A demonstração visual desse modelo é fundamental, porque as etapas dessa cirurgia podem ser muito difíceis de aprender. As representações bidimensionais da anatomia arterial nem sempre demonstram adequadamente a natureza complexa da ramificação 3-D no rato. Comece pesando o filhote para garantir que ele esteja entre 19 e 21 gramas.Depois de anestesiar o filhote com isoflurano inalado de acordo com os protocolos aprovados, certifique-se de que não haja resposta a um beliscão no pé. Mantenha a temperatura da superfície corporal com o uso de uma almofada de aquecimento durante a fase cirúrgica. Prenda o animal em decúbito dorsal com fita adesiva nas regiões dos ombros.Use cotonetes estéreis para esfregar a área cervical anterior com etanol a 70%, seguido por um cotonete de solução de iodopovidona. Em seguida, infiltre localmente 0,25% de bupivacaína no local da incisão planejada. Em seguida, enquanto trabalha com um estereoscópio, faça uma incisão cervical anterior de cinco a sete milímetros na linha média para expor a artéria carótida comum.Coloque dois a quatro afastadores para manter a cavidade aberta e a artéria exposta. Em seguida, localize a artéria carótida interna, a artéria occipital e a artéria carótida externa. Remova o tecido conjuntivo e a gordura das artérias para obter uma visão clara.Depois de cortar 1,5 centímetros de fio de sutura trançado de seda 6-0, destrance a sutura, puxando fios simples. Certifique-se de que os fios individuais estejam limpos e não desgastados. Enquanto segura o fio de sutura dentro de uma pinça de 45 graus, varra a pinça em um arco sob a ACI para que as pontas surjam entre a ACI e a OA. Em seguida, pegue a ponta do fio de sutura e puxe-o para que a extremidade seja de fácil acesso.Solte o fio da pinça e retire a pinça de baixo do ICA, invertendo o movimento anterior. Amarre uma ligadura temporária ao redor do ICA na base mais próxima de onde ele se separa do CCA. Retraia cuidadosamente a ACI lateralmente e, em seguida, use um clipe para prender o fio retrátil ao excesso de pele próximo à região da axila no lado oposto à incisão.Certifique-se de que o fio retrátil esteja esticado o suficiente para interromper o fluxo sanguíneo antes de prosseguir para a próxima etapa. A artéria deve ser plana e pálida. Use uma pinça de 45 graus para segurar outro fio de sutura não trançado e enrole-o sob e ao redor da ACI como antes.Posicione este fio lateralmente ao fio de retração. Em seguida, corte uma arteriotomia de 0,2 milímetro no meio do caminho entre as ligaduras amarradas e desamarradas, errando mais perto da ligadura amarrada. Agora, usando uma régua métrica, meça 10 milímetros de sutura de náilon revestida de silicone como sutura de oclusão.Corte a sutura com uma permissão extra de dois a três milímetros para remoção durante a reperfusão. Segure a sutura de oclusão com uma pinça de 45 graus e use uma pinça reta para criar uma curva, marcando o ponto de parada do avanço. Introduza a sutura de oclusão na arteriotomia, apontando-a paralelamente à ECA e em direção à cabeça.Avance suavemente a sutura até que a dobra seja alcançada. Em seguida, use a mecha posicionada lateralmente à fita de retração para amarrar uma ligadura temporária para prender a sutura da oclusão. Remova o clipe retrator e, em seguida, apare os fios de ambas as ligaduras temporárias, deixando o fio que será usado para remover o nó mais longo do que o fio usado para apertá-lo.Remova os afastadores e feche a cavidade usando seda trançada 6-0 para criar três ou quatro suturas interrompidas. Remova o filhote da anestesia e coloque-o em uma almofada de aquecimento em ar ambiente. Monitore o filhote até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e certifique-se de que ele esteja totalmente recuperado antes de devolvê-lo à barragem.Durante a oclusão, a ressonância magnética ponderada em difusão pode ser usada para verificar a indução apropriada da lesão. Essas imagens mostram lesão isquêmica contínua, indicada pela seta, detectada por DW-MRI durante MCAO transitória. Aproximadamente duas horas e 50 minutos após a oclusão da ACM, prepare os materiais cirúrgicos e, em seguida, inicie o procedimento de reperfusão anestesiando como antes.Remova as suturas interrompidas e localize a junção, que é marcada pelas duas ligaduras e pela extremidade da cauda da sutura de oclusão. Desamarre cuidadosamente o nó mais lateral da ligadura temporária puxando o fio mais longo e remova o fio de sutura da cavidade. Exatamente três horas após a oclusão da ACM, retire lentamente a sutura de oclusão da artéria.Não deve haver resistência. Use uma pinça para aplicar pressão na arteriotomia e, em seguida, desamarre cuidadosamente o nó medial para restaurar o fluxo sanguíneo. Depois de remover o fio de sutura do corpo, aplique um agente hemostático na arteriotomia para parar o sangramento.O retorno da forma original da artéria e da cor vermelha confirma que o fluxo sanguíneo da ACI foi restaurado. Remova os afastadores e feche a cavidade usando seda trançada 6-0 para criar três ou quatro suturas interrompidas. Remova o filhote da anestesia e deixe-o se recuperar com monitoramento como antes antes de devolvê-lo à gaiola doméstica.Inspecione os filhotes diariamente por cinco dias. Registre seus pesos e inspecione os locais da incisão de perto para uma cicatrização adequada. Essas seções cerebrais coronais coradas com violeta cresil de 50 mícrons posteriores a anteriores colhidas de animais P-38 demonstram lesões bastante graves após um TMCAO de três horas em P-10.A seta indica formação de cisto ipsilateral e redução do volume cortical e estriado. O orifício redondo no lado esquerdo representa um identificador de hemisfério contralateral. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, embora este procedimento seja conceitualmente simples, o sucesso e o domínio podem levar horas de otimização e prática.Uma vez dominada, a oclusão pode ser concluída em menos de 10 minutos, enquanto a reperfusão pode ser concluída em menos de cinco minutos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Indução cirúrgica de uma lesão cerebral isquêmico no rato é um modelo amplamente utilizado para a pesquisa acidente vascular cerebral. Aqui nós demonstram a indução de isquemia cerebral focal por oclusão da artéria cerebral média. Visualização do infarto resultantes de coloração histológica e ressonância magnética também é mostrada.

Modelo de isquemia focal cerebral por oclusão Suture Endovascular da artéria cerebral média no Rat

Demonstramos no vídeo um método para produzir uma oclusão da artéria cerebral média em ratos adultos utilizando um monofilamento intraluminal. Também mostramos como avaliar a extensão do infarto cerebral por 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto de coloração (TTC).

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Fonte: Larpthaveesarp, A., et. al. Modelo transitório de oclusão da artéria cerebral média de acidente vascular cerebral neonatal em ratos P10. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o estabelecimento do modelo de oclusão da artéria cerebral média em um filhote de rato. A artéria carótida interna (ACI) é exposta e uma ligadura é fixada para restringir a inundação do sangue. Um ocluído é inserido através da ACI para atingir a Artéria Cerebral Média. O filhote é então autorizado a se recuperar...

Gerando uma oclusão da artéria cerebral média em um filhote de rato para induzir isquemia cerebral local

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Permanente oclusão vascular cerebral<em&gt; Via</em&gt; Dupla ligadura e transecção

Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Diferentes modelos de oclusão da artéria cerebral média (MCAo) são usados em pesquisas experimentais de derrame. Aqui, é descrito um modelo experimental de AVC de MCAo transitório através da artéria carótida externa (ECA), que visa imitar o AVC humano, no qual o trombo cerebrovascular é removido devido à lise espontânea de coágulo ou terapia.

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Transiente Artéria Cerebral Média Oclusão Modelo de AVC neonatal em ratos P10

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