Name: Medição de diferencialmente metilada INS Espécies DNA em amostras de soro humano como um Cell Death Biomarcador de Ilhota β (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a medir espécies de DNA de preproinsulina diferencialmente metilada em soro humano como biomarcador de morte de células β usando PCR digital. Este método permite detectar precocemente a progressão do diabetes tipo 1.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (para RGM). Gostaríamos de agradecer a assistência do Núcleo de Tradução do Centro de Pesquisa em Diabetes de Indiana, apoiado pelo National Institutes of Health grant P30 DK097512.

Declaração de ética: Os protocolos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Indiana. Os pais dos sujeitos forneceram consentimento informado por escrito e as crianças com mais de 7 anos forneceram consentimento para sua participação.
1. Processamento de soro
NOTA: O ensaio descrito foi rigorosamente testado usando soro humano isolado da seguinte forma.
<ol>
	<li>Colete sangue em um tubo de coleta de sangue vermelho (sem aditivo; sem revestimento).</li>
	<li>Deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min para permitir a formação do coágulo.</li>
	<li>Tubo de centrífuga a 2.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante (soro) para um novo tubo designado para armazenamento de soro (tubos de rosca de polipropileno, tamanho dependente das amostras).</li>
	<li>Armazenar as amostras a -80 ºC até estarem prontas para o isolamento do ADN.</li>
</ol>
2. Extração de DNA sérico
NOTA: O DNA é extraído com um kit de extração de DNA usando 50 μl de soro (recomendado), seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.
<ol>
	<li>Preparar 200 μl de tampão de lise + 1 μl de poli(A) (5 μg) por amostra num tubo de microcentrífuga. Vórtice por 15 seg. Reserve até a Etapa 2.3.</li>
	<li>Colher amostras de soro do congelador a -80 ºC e descongelar à temperatura ambiente. Aumente o volume da amostra de soro até 200 μl no total usando solução salina tamponada com fosfato (PBS, com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio).</li>
	<li>Lise a amostra adicionando 20 μl de protease (1,4 unidades Anson/ml) à amostra, seguida de 200 μl de tampão de lise / mistura de poliA (da Etapa 2.2) e vórtice por 8 segundos. Incube a amostra a 56 ° C por 10 min e, em seguida, centrifugue brevemente por 7 segundos em velocidade máxima em uma microcentrífuga (>10.000 x g).</li>
	<li>Precipite o DNA adicionando 230 μl de etanol 100% à amostra e vórtice por 8 segundos. Centrifugue brevemente por 7 segundos na velocidade máxima (>10.000 x g).</li>
	<li>Aplique o DNA na coluna de centrifugação adicionando 600 μl de mistura de amostra à mini coluna de centrifugação. Centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo e coloque a coluna em um tubo limpo.</li>
	<li>Lave o DNA adicionando 500 μl de tampão de lavagem 1 à coluna. Centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo e coloque a coluna em um tubo limpo. Adicione 500 μl de tampão de lavagem 2 à coluna e centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 3 min. Coloque a coluna em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugue novamente em velocidade máxima por 1 min.</li>
	<li>Eluir o ADN colocando a coluna num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionando 60 μl de tampão de eluição directamente no filtro. É importante trocar as pontas entre as amostras para evitar a contaminação cruzada. Incube em temperatura ambiente por 5 min e depois centrifugue a 6.000 x g por 1 min. Adicione mais 60 μl de tampão de eluição e centrifugue a 6.000 x g por 1 min. </li>
	<li>Armazenar o ADN a -20 ºC para utilização posterior ou proceder imediatamente à conversão do bissulfito.</li>
</ol>
3. Conversão de bissulfito
NOTA: A conversão de bissulfito é realizada usando um kit de conversão de bissulfito, seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.
<ol>
	<li>Para converter citosinas não metiladas em uracilas, adicione 130 μl de reagente de conversão de bissulfito a 20 μl de DNA da etapa 2.7 em um tubo de PCR (tubo de PCR único de 0,2 ml ou tubos de PCR de 8 tiras). Guardar os restantes 40 μl de ADN para utilização futura ou utilizar em reacções replicadas. Misture 20 vezes pipetando para cima e para baixo e centrifugue brevemente para garantir que não haja gotas nas laterais ou na tampa. Incubar em banho-maria ou termociclador da seguinte forma: 98 °C durante 8 min, 54 °C durante 60 min, 4 °C durante 5 min.
	<ol>
		<li>Prossiga para a etapa 3.2 ou armazene a 4 °C por até 20 horas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adicione 600 μl de tampão de ligação à coluna de centrifugação e coloque a coluna no tubo de coleta fornecido. Aplique o DNA bissulfito na coluna e misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.</li>
	<li>Lave o DNA adicionando 100 μl de tampão de lavagem à coluna e centrifugue na velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.</li>
	<li>Realizar a dessulfonação para remover o grupo sulfonato para finalizar a conversão de citosinas não metiladas em uracila, adicionando 200 μl de tampão de dessulfonação à coluna. Deixe repousar em temperatura ambiente por 20 min e, em seguida, centrifugue em velocidade máxima (>10.000 x g) por 30 segundos.</li>
	<li>Lavar o ADN adicionando 200 μl de tampão de lavagem à coluna e centrifugar à velocidade máxima durante 30 segundos. Rejeitar o fluxo e repetir esta etapa de lavagem.</li>
	<li>Colocar a coluna num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluir o DNA adicionando 10 μl de tampão de eluição diretamente ao filtro de coluna. Incubar por 1 min. Centrifugue por 30 s em velocidade máxima para eluir o DNA. Quantificar o DNA recuperado por espectrofotometria em A260. 
	NOTA: O DNA detectado por espectrofotometria representa principalmente o DNA poliA portador que foi adicionado no passo 2.3 acima. Normalmente, a recuperação de poliA é de ≥85% da entrada (>4,25 μg).</li>
	<li>Conservar o ADN a -20 °C até estar pronto para prosseguir com a PCR digital.</li>
</ol>
4. PCR digital multiplex
<ol>
	<li>Faça uma mistura mestre com solução suficiente para cada amostra e controle. Incluir pelo menos uma amostra contendo água (controlo negativo), uma amostra de um plasmídeo contendo INS não metilado (1 pg, controlo positivo), uma amostra de plasmídeo contendo INS metilado (1 pg, controlo positivo) e uma amostra contendo uma mistura de plasmídeos 1:1.
	<ol>
		<li>Para preparar a mistura principal de PCR, adicione 12,5 μl por reação de tampão de PCR (por exemplo, 125 μl por 10 amostras), 1,25 μl por mistura de primer/sonda de reação (por exemplo, 12,5 μl por 10 amostras), 8,25 μl por água de reação (por exemplo, 82,5 μl por 10 amostras), 0,5 μl por enzima EcoR1 de reação (por exemplo, 5 μl por 10 amostras). 
		NOTA: Os primers e sondas usados aqui são os seguintes: Primer direto: 5'-GGAAATTGTAGTTTTAGTTTTTTTTTTTTGT-3'; Primer reverso: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configure a reação de PCR multiplex em uma placa de 96 poços. Adicione 19,5 μl de master mix a cada poço. Adicionar 2,5 μl de amostra de ADN convertida em bissulfito em cada alvéolo adequado (guardar os restantes 7,5 μl de ADN convertido em bissulfito ou utilizar em reacções replicadas). Misture pipetando para cima e para baixo várias vezes. 
	NOTA: Todos os 8 poços em uma linha devem conter controle de amostra ou tampão.</li>
	<li>Sele com um selo de alumínio usando um selador de placas e centrifugue em um girador de placas até que não haja líquido nas laterais dos poços.</li>
	<li>Configure o gerador de gotículas automatizado na tela sensível ao toque. 
	NOTA: Todos os 8 poços do cartucho devem conter sample ou controle tampão.
	<ol>
		<li>Defina o número de linhas que estão sendo usadas tocando na(s) linha(s) em que as amostras são carregadas na placa de 96 poços da etapa 4.2 e realce a linha em azul para indicar uma linha ativa.</li>
		<li>Carregue os consumíveis de trás para frente para evitar contaminação. Para começar, adicione cartuchos ao longo da fileira de trás do instrumento. Coloque as pontas na linha central do instrumento. 
		NOTA: Os cartuchos só podem caber nos suportes na orientação correta.</li>
		<li>Coloque a placa de 96 poços no instrumento. Remova um bloco frio do freezer a -20 ° C e coloque uma nova placa de 96 poços com rodapé nele. Coloque-o dentro do instrumento ao lado da placa de 96 poços carregada com amostra.</li>
		<li>Adicione óleo ao dispensador na frente do instrumento. Selecione o tipo de óleo na tela sensível ao toque.</li>
		<li>Toque no botão azul Iniciar para iniciar a corrida. Confirme a configuração da placa e toque no botão iniciar execução para começar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Quando terminar, remova a placa de 96 poços que contém as gotículas recém-formadas e sele com uma vedação de alumínio usando um selador de placas.</li>
	<li>Realize a PCR10 em um termociclador usando o seguinte programa: 95 °C por 10:00 min; 40 ciclos a: 94 °C por 00:30 min, 57,5 °C por 01:00 min; 98 °C por 10:00 min; 12 °C por 10 min ou até 24 horas.</li>
	<li>Coloque a placa no leitor de gotículas e configure o leitor.
	<ol>
		<li>Clique na guia de configuração. Abra um novo modelo clicando em modelo > novo. Insira um nome de arquivo.</li>
		<li>Use o editor de poços para definir os parâmetros para cada amostra. Dê a cada amostra um nome exclusivo, defina o experimento como Detecção de Eventos Raros (R-RED) e defina o master mix para a mixagem usada na etapa 4.1.</li>
		<li>Dê um nome ao Alvo 1 (ou seja, não metilado) e defina o Alvo 1 como desconhecido (U). Dê um nome ao Alvo 2 (ou seja, metilado) e defina o Alvo 2 como referência (R).</li>
		<li>Clique na guia Executar para iniciar a execução. Na janela de opções de execução, selecione o produto químico de detecção (FAM/VIC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Análise dos dados
<ol>
	<li>Abra os resultados na guia analisar e analise usando o gráfico 2D com base em controles positivos (consulte a Figura 1).</li>
	<li>Exporte o arquivo CSV gerado pelo leitor de gotículas para um programa de planilha para análise de dados.</li>
	<li>Para gerar "cópias por μl" de soro, use a fórmula: (concentração * 250) / (volume de soro usado para isolamento de DNA em μl). 6 
	NOTA: Os dados são normalmente convertidos em log10 quando adquiridos do soro humano para garantir a distribuição normal. Alternativamente, os dados podem ser plotados em uma escala de log10 e analisados por estatísticas não paramétricas.</li>
</ol>
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</style>

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<li>Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR+unraveled%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR unraveled.</a> Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+methylation-specific+polymerase+chain+reaction+method+for+monitoring+beta+cell+death+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes.</a> PloS One. 7 (10), 47942(2012).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Sozzi, G., Roz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+storage+of+whole+plasma+or+isolated+plasma+DNA+on+the+results+of+circulating+DNA+quantification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays.</a> J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A metilação de citosinas de ADN metiltransferases permite o controlo da transcrição epigenética em muitos genes. O gene INS em seres humanos é expressa quase exclusivamente em células ilhéu β, e parece haver uma correlação entre a frequência de metilação de citosinas no gene INS para o silenciamento de 11 a sua transcrição. Como tal, a maioria dos tipos de células apresentam frequências substancialmente mais elevados de metilação do gene INS em vários citosinas, em comparação com cé...

A diabetes de tipo 1 (DM1) é uma doença auto-imune que se caracteriza pela destruição do produtoras de insulina β células por células T auto-reactivas 1. O diagnóstico de DM1 é tipicamente feito na medição (glucose no sangue&gt; 200 mg / dl) em hiperglicemia, um indivíduo jovem magra, que pode apresentar-se com cetoacidose como evidência da deficiência de insulina. No momento do diagnóstico de DM1, existe evidência substancial de perda de função celular e β massa (50-90%) 2. Em estudos clínicos, vários fármacos imunomoduladores que foram instituídos no momento do diagnóstico resultou na estabilização da função das células β (e, presumivelmente, de massa), mas nenhum deles resultou em remissão clínica de doença, uma descoberta que elevou a chamada para o desenvolvimento de biomarcadores para a detecção precoce da doença e para o acompanhamento longitudinal da eficácia da combinação de terapias de 3,4. Os esforços dos consórcios internacionais, como ado Consórcio Rede de Investigação Islet Humano dos Institutos Nacionais de Heath 5, têm enfatizado a necessidade de desenvolver biomarcadores que incidem sobre o stress celular β e morte em DM1. Em linha com estes esforços, o nosso grupo e outros têm desenvolvido recentemente ensaios de biomarcadores que medem circulantes, fragmentos de DNA epigenetically modificados que surgem principalmente de morrer células p 6-9. Em todos os ensaios publicados até à data, o foco tem sido sobre a quantificação do gene humano que codifica preproinsulina (INS), o que demonstra maiores graus de locais de CpG não metiladas nas regiões de codificação e o promotor, em comparação com outros tipos de células. A libertação de fragmentos de DNA INS não metiladas foi levantada a hipótese como decorrente principalmente de morrer (necróticas, apoptóticos) células beta. Os nossos estudos recentes mostraram que na juventude, as elevações da ADN INS ambos não metilado e metilado na posição -69 pb (em relação a tele transcricional começar local) foram observados em novo início DM1, e juntos servido biomarcadores como específicos para esta população 6. Estes ensaios de biomarcadores envolvem o isolamento de ADN isento de células a partir do soro ou plasma utilizando estojos comerciais de rotação, seguida de uma conversão de bissulfito de DNA isolado (para converter citosinas não metiladas em uracilos, deixando as citosinas metiladas intacta). Neste relatório, nós descrevemos os aspectos técnicos da coleta de amostra de soro, o isolamento de DNA livre de células a partir do soro, a conversão de bissulfito, eo desempenho de PCR digital de gota (de agora em diante, PCR digital) para DNA INS diferencialmente metilado.

<table><tbody><tr><td>Aspirador de Topo Vermelho&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>sem aditivo, interior não revestido,</td></tr><tr><td>tubo criogênico</td> de 10 ml <td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>polipropileno, tubo com tampa de rosca, qualquer tamanho</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>desamado em tampão TE (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) para 5 &micro; g/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol Absoluto (200 Provas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (com CaCl2 e MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8-strip Tubes</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8-strip Caps, Dome</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo</td><td></td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para Sondas (Sem dUTP)</td><td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>Controle de Tampão para Sondas</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de Primer/Sonda Humana Não Metilada/Metilada</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96, semi-rodapé</td><td>Eppendorf</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>Selagem térmica de folha perfurável</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR Seladora</td><td>de placas Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Sistema de PCR digital de gotículas</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de geração de gotículas automatizadas para sondas</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho DG32 para gerador de gotículas automatizado</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta para gerador de gotículas automatizado</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>Caixas de ponta de pipeta para gerador de gotículas automatizado</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler Leitor</td> de gotículas <td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de leitor de gotículas ddPCR</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

medição de diferencialmente metilada<em&gt; ins</em&gt; espécies dna em amostras de soro humano como um cell death biomarcador de ilhota β

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

Acredita-se que a morte das células β ilhotas esteja subjacente à patogênese de praticamente todas as formas de diabetes e preceda o desenvolvimento de hiperglicemia franca, especialmente no diabetes tipo 1. O desenvolvimento de biomarcadores sensíveis e confiáveis de morte celular β pode permitir uma intervenção terapêutica precoce para prevenir ou retardar o desenvolvimento do diabetes. Recentemente, vários grupos, incluindo o nosso, relataram que o DNA diferencialmente metilado que codifica a pré-pró-insulina (INS) livre de células na circulação está correlacionado à morte celular β no diabetes pré-tipo 1 e no diabetes tipo 1 de início recente. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo usando PCR digital para a medição do DNA INS livre de células que é diferencialmente metilado na citosina na posição -69 bp (em relação ao local de início da transcrição). Demonstramos que o ensaio pode distinguir entre citosina metilada e não metilada na posição -69 pb, é linear em várias ordens de magnitude, fornece quantificação absoluta do número de cópias de DNA e pode ser aplicado a amostras de soro humano de indivíduos com diabetes tipo 1 de início recente e controles livres de doença. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado a qualquer espécie de DNA para a qual a detecção de citosinas diferencialmente metiladas seja desejada, seja da circulação ou de células e tecidos isolados, e pode fornecer quantificação absoluta de fragmentos de DNA.

Para interpretar os dados de forma adequada, usamos controles plasmídeo tanto para o DNA não metilado e metilado INS alvo em cada corrida PCR digital. Estes controlos asseguram que os sinais correspondentes para ADN metilado e não metilado são claramente distinguíveis. A Figura 1 mostra os gráficos de dispersão 2-D correspondentes às gotas para os controlos de plasmídeo contendo converteu-bissulfito não metilado ADN INS (Figura 1A), ADN...

A morte celular das ilhotas β precede o desenvolvimento do diabetes tipo 1, e a detecção desse processo pode permitir uma intervenção terapêutica precoce. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de como medir espécies de DNA INS diferencialmente metiladas no soro humano como um biomarcador de morte celular β.

Medição de diferencialmente metilada<em&gt; INS</em&gt; Espécies DNA em amostras de soro humano como um Cell Death Biomarcador de Ilhota β

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

O objetivo geral deste procedimento é medir espécies diferencialmente metiladas de DNA de pré-proinsulina no soro humano como biomarcador de morte de células beta. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da diabetes, como, por exemplo, se a morte de células beta está ocorrendo em um determinado momento durante o desenvolvimento da diabetes tipo 1? A principal vantagem desta técnica é que, ao utilizar a PCR digital, podemos determinar a quantidade de morte de células beta em quantidades muito pequenas de soro.Após coletar soro de amostras de sangue humano de acordo com o protocolo descrito, prepare 200 microlitros de tampão de lise e um microlitro de poli(A) por amostra em um tubo de microcentrífuga. Vortexe o tubo por 15 segundos. Retire as amostras de soro do congelador a menos 80 graus Celsius e descongele-as à temperatura ambiente.Em seguida, utilize PBS para ajustar o volume da amostra de soro a 200 microlitros. Lisar as amostras adicionando 20 microlitros de protease e 200 microlitros do tampão de lise poly(A)mix. Vortexar os tubos por oito segundos e incubá-los a 56 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, centrifugue os tubos em velocidade máxima por sete segundos. Precipite o DNA adicionando 230 microlitros de etanol a 100% às amostras e vortexie os tubos por oito segundos. Em seguida, centrifugue os tubos em velocidade máxima por sete segundos.Em seguida, aplique 600 microlitros das misturas de amostra em colunas de centrifugação e centrifugue as colunas a 6000 × g por um minuto. Descarte o fluxo inicial e coloque as colunas em tubos limpos. Adicione 500 microlitros do tampão de lavagem 1 às colunas e centrifugue as amostras a 6000 × g por um minuto.Em seguida, descarte o fluxo passante e coloque as colunas em tubos limpos. Adicione 500 microlitros do tampão de lavagem dois às colunas e centrifugue-as em velocidade máxima por três minutos. Em seguida, coloque as colunas em novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue novamente por um minuto.Para eluir o DNA, coloque as colunas em novos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro e adicione 60 microlitros de tampão de eluição diretamente sobre os filtros. Após incubar as colunas à temperatura ambiente por cinco minutos, centrifugue as amostras a 6000 × g por um minuto. Descarte a coluna e armazene as amostras até o momento da conversão com bisulfito.Para converter citosinas não metiladas em uracis, adicione 130 microlitros de reagente de conversão com bissulfito a 20 microlitros de DNA em tubos de PCR. Misture as amostras 20 vezes pipetando para cima e para baixo e gire brevemente os tubos para garantir que não haja gotas nas laterais ou na tampa. Incube as amostras em banho-maria ou ciclador térmico conforme indicado aqui.Coloque as colunas nos tubos de coleta fornecidos e adicione 600 microlitros de tampão de ligação às colunas de centrifugação. Aplique o DNA bisulfitado às colunas e misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Em seguida, centrifugue as amostras à velocidade máxima por 30 segundos e descarte o fluxo passante.Em seguida, adicione 100 µL de tampão de lavagem à coluna e centrifugue por 30 segundos. Depois, para remover os grupos sulfinito e finalizar a conversão das citosinas não metiladas em uracila, adicione 200 µL de tampão de dessulfinação às colunas. Após deixar as amostras em repouso à temperatura ambiente por 20 minutos, centrifugue as colunas por 30 segundos.Lave o DNA adicionando 200 microlitros de tampão de lavagem às colunas e centrifugue por 30 segundos. Em seguida, descarte o fluxo passante e repita a etapa de lavagem. Coloque as colunas em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro e elua o DNA adicionando 10 microlitros de tampão de eluição diretamente aos filtros das colunas.Incube as amostras por um minuto, depois centrifugue-as por 30 segundos para eluir o DNA. Descarte as colunas e armazene as amostras. Quantifique o DNA recuperado por espectrofotometria em uma absorbância de 260 nanômetros.Prepare uma mistura mestra com quantidade suficiente de solução para cada amostra e controle. Inclua pelo menos uma amostra contendo água, uma amostra de plasmídeo contendo insulina não metilada e uma amostra contendo uma mistura um para um de plasmídeos. Monte reações de PCR multiplex em uma placa de 96 poços adicionando primeiro 19,5 microlitros da mistura mestra em cada poço.Adicione 2,5 µL da amostra de DNA convertido com bisulfito nas poças apropriadas. Em seguida, misture as poças pipetando para cima e para baixo várias vezes. Utilize papel alumínio e um selador de placas para vedar a placa e centrifugue-a em um rotor para placas até que não haja líquido nas laterais das poças.Para configurar o gerador automatizado de microgotas na tela sensível ao toque, defina o número de linhas que estão sendo utilizadas tocando nas linhas em que as amostras são carregadas nos poços da placa. Para evitar contaminação, carregue os materiais descartáveis de trás para frente, começando pelos cartuchos ao longo da linha traseira do instrumento. Em seguida, carregue as ponteiras na linha central.Em seguida, coloque a placa de 96 poços no instrumento. Depois, após retirar um bloco frio do freezer a menos 20 graus Celsius, coloque uma nova placa de 96 poços com borda (skirted) dentro dele. Insira o bloco com a placa no instrumento, ao lado da placa com as amostras.Adicione óleo ao dispensador na frente do instrumento e selecione o tipo de óleo na tela sensível ao toque. Toque no botão azul Iniciar para começar a execução. Em seguida, confirme a configuração da placa e toque no botão Iniciar Execução para começar.Após a conclusão da corrida, remova a placa de 96 poços que contém as gotículas recém-formadas e use um selador de placas para selá-la com folha de alumínio. Em seguida, realize a PCR em um termociclador usando o seguinte programa. Coloque a placa no leitor de gotículas e configure o leitor clicando na aba Configuração.Em seguida, abra um novo modelo clicando em Modelo Novo. Use o editor de poços para definir os parâmetros de cada amostra. Dê a cada amostra um nome exclusivo.Defina o experimento como Detecção de Eventos Raros e defina o mix mestre como a mistura utilizada para preparar a reação. Dê um nome ao Alvo 1, como Não Metilado, e defina o Alvo 1 como desconhecido, ou U. Dê um nome ao Alvo 2, como Metilado, e defina o Alvo 2 como referência, ou R. Clique na aba Executar para iniciar a corrida e insira um nome de arquivo. Em seguida, na janela Opções de Execução, selecione a química de detecção.Para analisar os dados, abra os resultados na guia Analisar e utilize o gráfico 2D baseado nos controles positivos para analisar os dados. Esta figura mostra os gráficos de dispersão 2D correspondentes aos gotículas para os controles de plasmídeo, contendo DNA de insulina não metilado convertido por bisulfito, DNA de insulina metilado e uma mistura um para um dos dois plasmídeos. Observe que neste painel há um leve deslocamento das gotículas positivas para FAM para o canal VIC, indicando a sonda para o DNA de insulina metilado.Da mesma forma, há uma leve alteração nos gotículas positivas para VIC no canal FAM, indicando reatividade cruzada da sonda para DNA não metilado com DNA metilado. Para demonstrar a linearidade dos iniciadores, foram utilizadas misturas dos dois plasmídeos em várias ordens de magnitude nas reações de PCR. Como mostrado aqui, concentrações variáveis de um plasmídeo podem ser detectadas de forma linear na presença de uma quantidade constante do segundo plasmídeo.Nesta figura, foram analisadas amostras de quatro indivíduos com diabetes tipo 1 de início recente e quatro amostras de controle sem diabetes tipo 1. Os dados mostram que indivíduos com diabetes tipo 1 apresentam níveis elevados de DNA de insulina tanto não metilado quanto metilado, em comparação com os controles, conforme demonstrado anteriormente. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em oito horas para 30 amostras, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar contaminação em todas as etapas. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de diabetes explorarem o uso dessa técnica como biomarcador para o desenvolvimento do diabetes tipo 1. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a quantidade de morte de células beta mediante a medição de preproinsulina não metilada e metilada no DNA livre de células proveniente de soro humano.Não se esqueça de que trabalhar com tampões de extração de DNA pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de luvas e jaleco de laboratório, e não utilizar agentes desinfetantes que contenham alvejante, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados ​​para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Este vídeo mostra a detecção de eletroquimioluminescência de autoanticorpos de ilhotas no soro humano. Os anticorpos no soro fazem a ponte entre o antígeno conjugado com rutênio e o antígeno de captura biotinilado, formando complexos que são detectados por medições de eletroquimioluminescência.

Detecção de autoanticorpos de ilhotas humanas usando um ensaio de eletroquimioluminescência

Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Aqui, apresentamos os métodos para detectar autoanticorpos ilhota humana utilizando ensaios de eletroquimioluminescência (ECL). O protocolo, usado para prever o tipo 1 diabetes, pode ser expandido em cima para detectar autoanticorpos para outras doenças auto-imunes.

Ensaios de eletroquimioluminescência para humano ilhéu auto-anticorpos

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Aqui, nós apresentamos um protocolo para gerar de alta qualidade, dados do transcriptoma em grande escala das únicas pilhas das ilhotas pancreatic humanas isoladas usando uma tecnologia de sequenciamento microfluídico do RNA da único-pilha da gota-baseada.

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Este estudo utiliza marcadores de morte celular e apoptose baseados em fluorescência multicoloração combinados com microscopia confocal para avaliar a apoptose induzida por citocinas e a morte específica de β células em ilhotas pancreáticas. Revela mudanças espaciais e temporais na morte celular e apoptose em resposta a estímulos extracelulares.

Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Descrevemos aqui uma abordagem relativamente rápida e simples para mapear o tempo de replicação de mamíferos em todo o genoma, desde o isolamento celular até a análise básica dos resultados do sequenciamento. Um mapa genômico de um programa de replicação representativo será fornecido seguindo o protocolo.

Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Aprenda a medir espécies de DNA de preproinsulina diferencialmente metilada em soro humano como biomarcador de morte de células β usando PCR digital. Este método permite detectar precocemente a progressão do diabetes tipo 1.

Medição de diferencialmente metilada

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