Avaliação da função bioenergética em células endoteliais Vascular Cerebral

Os objetivos gerais deste procedimento são avaliar como as alterações da função mitocondrial afetam o desenvolvimento de distúrbios neurológicos e projetar terapias que tenham um efeito direto nas aberturas da barreira hematoencefálica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos distúrbios neurológicos, como como a morte celular neuronal pode ser minimizada após um acidente vascular cerebral? A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma avaliação em tempo real da função mitocondrial em células intactas inteiras.

Depois de cultivar as células endoteliais vasculares cerebrais em meio completo, em um frasco de cultura de tecidos T75 centímetros quadrados, a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 80% de confluência, descarte o meio de cultura celular e enxágue as células com tripsina EDTA. Em seguida, adicione um a dois mililitros de tripsina EDTA fresca ao frasco e retire as células a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Depois de confirmar que as células foram levantadas sob um microscópio invertido, pare a reação com a adição suave de 10 mililitros de meio celular completo fresco e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação.

Rejeitar o sobrenadante e lavar o sedimento em 10 mililitros de meio de crescimento completo fresco para outra centrifugação. Em seguida, ressuspenda o pellet em meio de crescimento completo a uma concentração de duas vezes 10 elevado ao quinto células por mililitro para subcultura. Após o número apropriado de subculturas, semeie 1,6 vezes 10 até a quarta célula em 80 microlitros de meio completo por poço, em uma placa de cultura de células de fluxo extracelular de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Quando as células estiverem presas à placa, adicione o tratamento de interesse aos poços apropriados e devolva as células à incubadora. No dia anterior ao ensaio de avaliação funcional mitocondrial, hidratar um cartucho censor de fluxo extracelular com 150 microlitros de solução calibrante de fluxo extracelular e incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono. Na manhã seguinte, use a estação lavadora de placas para transformar o meio de cultura de células em meio de ensaio de fluxo extracelular de pH 7,0.

Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius, sem dióxido de carbono, por 30 a 60 minutos. Quando as células estiverem equilibradas, carregue o cartucho hidratado no Bioanalyzer e clique no botão Iniciar para iniciar a calibração. No final da calibração, clique no prompt Desbloquear cartucho para remover a placa inferior do cartucho e carregar a placa da célula.

Em seguida, abra o arquivo de dados para obter os valores de taxa do Bioanalyzer para exportação para o arquivo de planilha. Dado que a cinética e a intensidade relativa das respostas são variadas entre os diferentes tipos de células endoteliais vasculares cerebrais, nesses experimentos, uma série de concentrações de bEnd. 3 células foi usado para identificar o número ideal de células para medir os níveis de taxa de consumo de oxigênio em um ensaio de perfil metabólico.

Como observado, as respirações basal e máxima e a capacidade respiratória sobressalente demonstram uma resposta proporcional à densidade celular. A produção de ATP, no entanto, diminui quando a maior concentração de células por poço é usada, sugerindo que uma cultura de células superconfluente não é adequada para o experimento. Com as densidades celulares ideais parecendo ocorrer na faixa intermediária de números de células por poço.

Portanto, os níveis esperados de taxa de consumo de oxigênio foram avaliados neste experimento representativo usando uma concentração celular de faixa média, demonstrando que moléculas de mRNA precursoras não codificantes reduzem a função mitocondrial nas células endoteliais vasculares cerebrais. Esses experimentos também demonstram que a respiração máxima e a capacidade de reposição são significativamente diminuídas pela superexpressão dessas moléculas nas células endoteliais vasculares cerebrais 24 horas após a transfecção, embora a respiração basal, a produção de ATP e o vazamento de prótons não exibam alterações significativas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em dois dias.

Desde o revestimento das células até o acesso à função mitocondrial, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que determinar a densidade celular ideal é extremamente importante antes de iniciar qualquer outro procedimento. Após este procedimento, outros métodos, como viabilidade celular ou ensaios glicolíticos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as mudanças que ocorrem na função mitocondrial devido a uma diminuição da viabilidade celular ou alterações em outras vias metabólicas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da função mitocondrial usarem células intactas dentro de mitocôndrias isoladas e uma variedade de doenças, incluindo doenças neurológicas, câncer ou distúrbios metabólicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como acessar a função mitocondrial nas células endoteliais vasculares cerebrais.