tratados com Cefoperazone Rato Modelo de clinicamente relevante Clostridium difficile R20291 Strain

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um guia passo a passo para a implementação do modelo de camundongo cefoperazona de infecção por Clostridium difficile, com ênfase especial no monitoramento clínico da doença, enumeração de bactérias, citotoxicidade de toxinas e alterações histopatológicas pós-desafio. Este protocolo detalhado ajudará os pesquisadores a executar com precisão um modelo de camundongo de infecção por Clostridium difficile, o que é essencial para estudar a patogênese dessa bactéria e acessar novas terapêuticas. A principal vantagem de usar este modelo de camundongo é que a exposição a um antibiótico por cinco dias torna os camundongos suscetíveis à colonização de C. difficile e a um curso clínico prolongado de infecção concomitante com doença humana.

Para começar, pegue a cepa de estoque de C. difficile de interesse e vórtice. Em uma capela de fluxo laminar, diluir o estoque em água estéril em um tubo com tampa de rosca até uma concentração de dez elevado ao quinto esporos por 25 microlitros. Rotule a mistura como inóculo de esporos e coloque o tubo em banho-maria a 65 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, na capela de fluxo laminar, pipetar 50 microlitros do inóculo de esporos aquecido em um tubo de microcentrífuga estéril e passá-lo para a câmara anaeróbica até uso posterior. Carregue o inóculo de esporos restante em uma seringa de um mililitro conectada a uma agulha de gavagem gástrica com ponta de bulbo estéril. Em uma capa de fluxo laminar, pegue um rato e imobilize a cabeça prendendo o animal suavemente pela pele solta do pescoço e das costas.

Usando o dedo indicador e garantindo que o animal não vocalize ou mostre sinais de angústia, imobilize ainda mais a cabeça do animal e alongue o esôfago. Mantenha o mouse na posição vertical e vertical e passe suavemente a agulha de gavagem na lateral da boca. Direcione a agulha de gavagem ao longo do céu da boca e avance-a lentamente para o esôfago.

Quando a agulha estiver aproximadamente na metade do esôfago, injete 25 microlitros de inóculo de esporos e, em seguida, retire suavemente a agulha. Retorne o animal à gaiola e observe-o quanto a quaisquer sinais de tosse ou dificuldade respiratória que possam indicar administração traqueal inadvertida. Em seguida, pegue a alíquota do inóculo de esporos armazenada anteriormente na câmara anaeróbica e qualquer inóculo de esporos de gavagem restante e faça de uma a dez diluições em série em 180 microlitros de 1x PBS.

Execute quatro a cinco dessas diluições. Usando técnica asséptica, transfira 100 microlitros de cada diluição em série para uma placa TCCFA individual. Tomando um novo espalhador estéril em forma de L de cada vez, distribua uniformemente o inóculo de diluição em cada placa.

Incube as placas em condições anaeróbicas por 24 horas a 37 graus Celsius. Por fim, contar as colónias de C. difficile em cada placa de diluição e calcular as unidades formadoras de colónias para obter a dose infecciosa administrada aos ratinhos. Para coletar amostras fecais de camundongos para avaliação, primeiro prenda levemente, mas com firmeza, o camundongo pela pele solta no pescoço e nas costas, garantindo que o animal não esteja em perigo.

Usando o dedo mindinho, levante suavemente a cauda do animal, expondo o ânus. Segure um tubo de microcentrífuga estéril de peso conhecido diretamente sob o ânus do animal, garantindo que o tubo não toque diretamente no mouse. Quando o animal defecar, colete o pellet fecal no tubo.

Armazene o tubo em temperatura ambiente até que todas as amostras necessárias sejam coletadas. Pesar os tubos contendo fezes em uma balança analítica e registrar a massa com quatro casas decimais. Calcule o peso do pellet fecal subtraindo o peso do tubo.

Em seguida, calcule uma diluição de um a dez do conteúdo e ressuspenda em 1x PBS. Use a ponta da pipeta para transformar suavemente a matéria fecal em solução. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 30 minutos, permitindo que o conteúdo assente.

Mantendo as soluções anaeróbicas, faça diluições seriadas para cada amostra em 1x PBS. Transfira 100 microlitros de cada diluição serial para placas TCCFA. Use um espalhador estéril em forma de L e aplique uniformemente a mídia nas placas.

Incube as placas em condições anaeróbicas a 37 graus Celsius por 24 horas. Finalmente, enumere as colônias de C. difficile e calcule a unidade formadora de colônias por grama de conteúdo fecal. Esta figura mostra o peso do camundongo nos dias seguintes ao desafio com C. difficile R20291.

No dia zero, o peso da linha de base é definido como 100. O peso corporal médio do camundongo foi medido a cada dia seguinte, por 14 dias. Uma diminuição significativa no peso foi observada em camundongos desafiados nos dias dois a sete após o desafio.

Os ratos pareceram se recuperar e recuperar o peso após esse ponto. Aqui, a carga de C.difficile nas fezes nos dias pós-desafio é mostrada. Às 24 horas após o desafio, todos os camundongos foram colonizados com 10 a sétima UFC por grama de fezes.

Essa carga diminuiu no sétimo dia em diante, embora C. difficile ainda esteja presente. O exame histopatológico de camundongos ao longo do curso da infecção mostrou as alterações patológicas mais significativas no ceco. Os escores histológicos cecais totais foram significativamente diferentes entre o dia zero e os dias dois e quatro após o desafio.

Geralmente, indivíduos novos neste modelo de camundongo podem ter dificuldades com o cálculo e preparação do inóculo de esporos usado para desafiar os camundongos e o cálculo da carga bacteriana fecal de C. difficile. Ao tentar este protocolo, é importante lembrar que modificações na dose ou cepa de esporos de C. difficile administrados a camundongos podem alterar o resultado deste modelo.