tratados com Cefoperazone Rato Modelo de clinicamente relevante

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um guia passo a passo para implementar o modelo murino de infecção por Clostridium difficile com cefoperazone, com ênfase especial no monitoramento da doença clínica, enumeração de bactérias, citotoxicidade de toxinas e alterações histopatológicas após o desafio. Este protocolo detalhado ajudará pesquisadores a executar com precisão um modelo murino de infecção por Clostridium difficile, o que é essencial para o estudo da patogênese dessa bactéria e para a avaliação de novas terapias. A principal vantagem do uso desse modelo murino é que a exposição a um único antibiótico durante cinco dias torna os camundongos susceptíveis à colonização por C. difficile e a um curso clínico prolongado de infecção, semelhante à doença humana.

Para começar, pegue a cepa estoque de C.difficile de interesse e vortex. Em uma cabine de fluxo laminar, dilua o estoque em água estéril em um tubo com tampa rosqueada até uma concentração de dez elevado à quinta esporos por 25 microlitros. Rotule a mistura como inóculo de esporos e coloque o tubo em um banho-maria a 65 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, na cabine de fluxo laminar, pipete 50 microlitros do inóculo de esporos aquecido em um tubo estéril de microcentrifugação e transfira-o para a câmara anaeróbia até uso posterior. Carregue o inóculo de esporos restante em uma seringa de um mililitro acoplada a uma agulha estéril de gavagem gástrica com ponta de bulbo. Na cabine de fluxo laminar, pegue um camundongo experimental e imobilize a cabeça, segurando suavemente o animal pelo tecido solto da região do pescoço e das costas.

Usando o dedo indicador e garantindo que o animal não emita sons ou mostre sinais de desconforto, imobilize ainda mais a cabeça do animal e alongue o esôfago. Mantenha o camundongo em posição ereta e vertical e, suavemente, introduza a agulha de gavagem na lateral da boca. Direcione a agulha de gavagem ao longo do palato e avance-a lentamente para dentro do esôfago.

Uma vez que a agulha esteja aproximadamente na metade do esôfago, injete 25 microlitros do inóculo de esporos e, em seguida, retire suavemente a agulha. Devolva o animal à sua gaiola e observe-o quanto a quaisquer sinais de tosse ou dificuldade respiratória, que possam indicar administração inadvertida na traqueia. Em seguida, pegue a alíquota do inóculo de esporos armazenada anteriormente na câmara anaeróbica e qualquer inóculo de esporos restante da gavagem, e prepare diluições seriadas de um para dez em 180 microlitros de PBS 1x.

Realize quatro a cinco dessas diluições. Usando técnica asséptica, transfira 100 microlitros de cada diluição em série para uma placa TCCFA individual. Utilizando um novo espalhador estéril em forma de L a cada vez, distribua uniformemente os inóculos de diluição em cada placa.

Incube as placas em condições anaeróbicas por 24 horas a 37 graus Celsius. Por fim, conte as colônias de C.difficile em cada placa de diluição e calcule as unidades formadoras de colônia para obter a dose infecciosa administrada aos camundongos. Para coletar amostras fecais de camundongos para avaliação, primeiro restrinja levemente, mas firmemente, o camundongo de estudo pela pele solta do pescoço e das costas, garantindo que o animal não esteja em sofrimento.

Usando o dedo mindinho, levante suavemente a cauda do animal, expondo o ânus. Segure um tubo estéril de microcentrífuga de peso conhecido diretamente sob o ânus do animal, garantindo que o tubo não toque diretamente no camundongo. Quando o animal defecar, colete o pellet fecal no tubo.

Armazene o tubo em temperatura ambiente até que todas as amostras necessárias sejam coletadas. Pese os tubos contendo fezes em uma balança analítica e registre a massa com quatro casas decimais. Calcule o peso do pellet fecal subtraindo o peso do tubo.

Em seguida, calcule uma diluição de um para dez do conteúdo e reconstitua em PBS 1x. Utilize a ponta da pipeta para desagregar suavemente a matéria fecal na solução. Incube as amostras à temperatura ambiente por 30 minutos, permitindo que o conteúdo se sedimente.

Mantendo as soluções anaerobicamente, faça diluições seriadas para cada amostra em PBS 1x. Transfira 100 microlitros de cada diluição serial para placas de TCCFA. Utilize um espalhador estéril em formato de L e aplique uniformemente o meio nas placas.

Incubar as placas em condições anaeróbicas a 37 graus Celsius por 24 horas. Por fim, enumerar as colônias de C. difficile e calcular a unidade formadora de colônia por grama de conteúdo fecal. Esta figura mostra o peso dos camundongos nos dias seguintes ao desafio com C. difficile R20291.

No dia zero, o peso inicial é definido como 100. O peso corporal médio dos camundongos foi medido diariamente nos dias seguintes, durante 14 dias. Uma diminuição significativa do peso foi observada nos camundongos desafiados entre os dias dois e sete após o desafio.

Os camundongos pareciam se recuperar e recuperar o peso a partir desse ponto. Aqui, é mostrada a carga de C.difficile nas fezes nos dias após a infecção. Aos 24 horas após a infecção, todos os camundongos estavam colonizados com 10 à sétima UFC por grama de fezes.

Esta carga diminuiu a partir do sétimo dia, embora C. difficile ainda esteja presente. O exame histopatológico dos camundongos ao longo do curso da infecção mostrou as alterações patológicas mais significativas no ceco. Os escores histológicos totais do ceco diferiram significativamente entre o dia zero e os dias dois e quatro após o desafio.

Em geral, indivíduos novos nesse modelo de camundongo podem ter dificuldades com o cálculo e a preparação do inóculo de esporos utilizado para desafiar os camundongos, bem como com o cálculo da carga bacteriana fecal de C.difficile. Ao tentar executar este protocolo, é importante lembrar que modificações na dose ou na cepa de esporos de C.difficile administrados aos camundongos podem alterar o resultado desse modelo.