Name: Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a analisar a montagem de proteassomas recombinantes de Archaea usando coexpressão de subunidades e mistura pós-lise com PAGE não desnaturante. Este método permite a detecção rápida de intermediários na via de montagem.

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Este trabalho foi financiado em parte por uma fundos de apoio Grant Research (RSFG) da Universidade de Indiana University-Purdue, Indianapolis, e em parte por um prêmio da American Heart Association 14GRNT20390154, a ARK

1. Expressão Bacteriana. Nota: Os plasmídeos de expressão usados neste estudo estão descritos na Tabela 1. Soluções, meios, e tampões utilizados neste estudo estão descritos na Tabela 2. A clonagem de genes de subunidade de proteassoma e archaea a geração de plasmídeos de expressão são descritos noutro local 18,20. Em resumo, os plasmídeos para a co-expressão recombinante de subunidades empregar uma estratégia operão bicistrónico que ajuda na obtenção de níveis de expressão comparáveis de subunidades individuais 18,20. Os parâmetros de expressão enumerados abaixo foram empiricamente determinada como sendo óptima para as subunidades de proteassoma do presente estudo. Pode ser necessário optimizar a expressão de outros mutantes de proteassoma, por proteossomas de outras espécies de arqueia, ou para outros complexos de proteína recombinante (ver discussão). <ol><li> Transformar o plasmídeo de interesse expressão em E. coli quimicamente competentes BL21 (DE3) células. </li><li> Adicionar 1 - 2 ul de plasmídeo (tipicamente 50 - 100 ng) a uma alíquota de células DE3 que foram recém-descongeladas em gelo, e continuar a incubar em gelo durante 20 min. </li><li> O choque térmico das células a 42 ° C durante 45 s e retornar tubo para gelo para additionl 2 min. </li><li> Adicionar 1 ml de meio LB e incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante 1 h. </li><li> Espalhe 100-200 uL da mistura de transformação em LB-kan placas (placas contendo meio LB sólidos, suplementadas com canamicina (todos os plasmídeos usados ​​neste estudo codificam resistência a este antibiótico)). Incubar as placas a 37 ° C O / N. </li><li> Na manhã seguinte, inocula uma única colónia da placa de LB-kan em 3 ml de meio LB-kan líquido num tubo de cultura de vidro. Incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante cerca de 2,5-3 horas, ou até a turbidez é observado. </li><li> Medir a densidade óptica da cultura a 600 nm (DO600) num espectrofotómetro. Diluir o culto celularure com uma quantidade apropriada de meio LB-kan pré-aquecido a uma DO 600 de 0,4, num volume final de 6 ml. Retomar a agitação a 37 ºC durante 40 min. </li><li> Induzem a expressão de proteínas nas culturas líquidas pela adição de IPTG a partir de uma solução-mãe a uma concentração final de 1 mM. Incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante cerca de 6-7 h. </li><li> Colher culturas de células bacterianas, na sua totalidade em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 1,5 ml de uma cultura em tubo de microcentrifugação. Centrifuga-se a 10000 × g durante 1 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar mais 1,5 ml da mesma cultura ao sedimento. Centrifuga-se a 10000 × g durante 1 min. </li><li> Repetir o passo 1.11 até que toda a cultura é colhida no tubo de microcentrífuga. </li><li> Armazenar as pelotas induzidas a -80 ° C até a lise. </li></ol> 2. Lise bacteriana e Lisado de mistura. Nota: </strong&gt; Para amostras estudadas através de co-expressão, siga secção 2.1 (e suas subseções). Para amostras que necessitam de mistura lisado, siga secção 2.2 (e suas subseções). A análise de TSP (total, solúvel, pastilha) que está incluído no protocolo é útil na optimização da expressão da proteína que pode ajudar a garantir que quantidades aproximadamente iguais de subunidades a e p são combinadas durante o lisado de mistura (ver discussão). Ele também fornece um controle importante se resultados inferiores não são como esperado (ou seja, ele verifica que a proteína foi expressa e solúvel). Assim, recomendamos incluindo análise TSP inicialmente. Uma vez que um protocolo ideal foi alcançado para uma combinação subunidade particular, a análise TSP não é estritamente necessário, que é por isso que ela é descrita como opcional abaixo. <ol><li> A lise das células bacterianas e preparação de fracções solúveis. <ol><li> Descongelar o sedimento celular induzida em gelo durante 5 min. Ressuspender o sedimento em 600 ul de tampão de lise. </li><li> IncUbate a suspensão a 30 ° C com agitação (150 rpm) durante 30 min para gerar lisado bruto total. Nota: A etapa seguinte e a subseção que se segue são opcionais. </li><li> Retire os dois 25 mL alíquotas a partir do ligado brutas totais em 1,5 tubos separados microcentrífuga ml e realizar análises TSP como segue. <ol><li> Para uma das duas aliquotas de 25 ml, adicionar tampão de amostra 5X de SDS para uma concentração final de 1X. Rotular o tubo com &quot;T&quot; para o &quot;total de lisado bruto&quot;. </li><li> Incubar o &quot;T&quot; da amostra a 100 ° C durante 5 minutos para desnaturar proteínas completamente. </li><li> Enquanto isso, pegue a segunda alíquota de 25 mL e centrifugar-lo a 10.000 × g por 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pequena pelota, e transferi-lo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Marque esse novo tubo &quot;S&quot; para &quot;fracção solúvel&quot;. </li><li> Para os restantes behi pequena sedimentoND na etapa anterior, adicionar 25 ul de tampão de lise e vortex para ressuspender. Rotular este tubo &quot;P&quot; para &quot;fração pellet&quot;. </li><li> Adiciona-se 6 mL de tampão de amostra 5X de SDS para os &quot;S&quot; e &quot;P&quot; tubos e incuba-se a 100 ° C, como descrito acima. Nota: Se as amostras TSP não irá ser utilizado naquele dia para analisar a expressão, que pode ser congelada a -20 ° C até ser necessário. Uma vez descongelado, eles devem ser novamente incubada a 100 ° C, como acima descrito, imediatamente antes do carregamento num gel de SDS-PAGE padrão 12% e / ou 15%. </li></ol></li><li> Enquanto a análise de TSP é levada a cabo, de centrifugação da restante 550 mL de lisado bruto total (ou a totalidade do 600 ul de lisado bruto total, se a análise do TSP é não realizado) a 10000 × g durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco. Este é o lisado solúvel que irá ser utilizada para a purificação. </li></ol></li><li> mistura lisado. <ol><li> Realizar a lise conforme descrito nos passos 2.1.1 e 2.1.2 supra. </li><li> Misturar 600 mL de lisado bruto total desde bactérias que expressam a subunidade α desejado com 600? L de lisado bruto total desde bactérias que expressam a subunidade β desejado. Incubar a 37 ºC com agitação lenta durante 30 minutos. Nota: Pode ser necessário para otimizar o tempo de incubação para alcançar o máximo de montagem durante lisado de mistura (ver discussão). O tempo ea temperatura apresentadas aqui são ideais para as proteínas recombinantes neste estudo e foram determinados em outro lugar 18. </li><li> Centrifugar o lisado misturada a 10000 × g durante 10 min para separar o material solúvel do sedimento insolúvel. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL. Utilize este ligado solúvel misto para a purificação de proteínas. </li></ol></li></ol> 3. Purificação de Proteínas Imobilizadas cobalto através de afinidade em resina(ICAR). <ol><li> Equilibrar a resina. <ol><li> Completamente ressuspender a resina, invertendo o frasco e transferir 50 ul da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifuga-se a 700 x g durante 2 min para resina de sedimento. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Nota: realizar a aspiração da pipeta usando um azul ponta de pipeta de 1 mL para remover a maior parte do líquido. Uma dica 2 mL branco é usado para controle de multa de remoção do sobrenadante restante, deixando uma camada muito fina de líquido de cobertura das esferas. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão A. Misture suavemente para voltar a suspender resina e centrifugar a 700 × g durante 2 min para sedimentar resina. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e repetir este passo de lavagem mais uma vez. </li></ol></li><li> Aplicar ligado solúvel obtido anteriormente na seção 2.1 ou 2.2 para a resina equilibrada. Incubar o tubo com uma rotação suave a 4 ºC durante 60 min. Centrifugar o tubo a 700 × g &lt;/ Em&gt;, durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. </li><li> Lava-se a resina como se segue para remover as proteínas não especificamente ligadas. <ol><li> resina Ressuspender com 1 ml de tampão A e incubar com agitação suave a 4 ºC durante 10 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. Repita este passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Ressuspender a resina com 1 mL de Tampão B (Tampão A com imidazole a 5 mM) e incuba-se com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. Repita este passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Ressuspender a resina com 1 mL de tampão C (tampão A com imidazole 10 mM) e incuba-se com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. </li></ol></li><li> Elui-se a proteína por adição de 400 uL de tampão E (tampão A com imidazole 200 mM) tO da resina. Incube com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se a 700 x g durante 5 min. </li><li> Transferir o sobrenadante contendo proteína purificada para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Dessalinizar a proteína purificada por centrifugação em série como se segue. <ol><li> Para 400 uL de proteína purificada, adiciona-se 100 uL de tampão A (isto reduz a concentração de imidazole de 200 mM a 160 mM). Aplicar proteína purificada a 0,5 ml de ultra-centrifugaï¿½o filtros com um peso molecular de 10 kDa de corte. Centrifuga-se a 14000 × g durante 5 min. </li><li> Descartar o filtrado e adicionar 400 uL de Tampão A para diluir o retentado e centrifugar novamente. Continue os ciclos de centrifugação / diluição até concentração de imidazol cai abaixo de 4 mM. Como um exemplo, se cada centrifugação concentra-se 500 ul para baixo para ~ 70 ul (ou de aproximadamente 7 vezes), em seguida, dois ciclos irá reduzir a concentração de 160 mM a partir de imidazole (7 × 7 = 49 vezes) para approximately 3,3 mm. </li><li> Medir a concentração de proteína da amostra dessalinizada usando o ensaio BCA 21. Nota: A dessalinização é necessária para reduzir os níveis de imidazole abaixo do limite de tolerância para o ensaio de BCA, tal como descrito nas instruções do fabricante. O nosso laboratório prefere o ensaio BCA porque é sensível, tem uma grande faixa dinâmica, e exibe muito menos variação proteína-proteína. No entanto, outros métodos para determinar a concentração de proteína pode ser substituído para o ensaio de BCA. A chave é estar ciente das vantagens e limitações de cada método. </li></ol></li><li> Adicionar tampão de amostra 5X nativo a uma concentração final de 1X e proceder-se a electroforese. Alternativamente, armazenar amostras a -20 ºC para análise posterior. </li></ol> 4. não desnaturante em gel de poliacrilamida eletroforese (PAGE). Cuidado: acrilamida não polimerizado é uma neurotoxina. Desgaste gea de protecção adequador. <ol><li> Prepara-se o gel de PAGE não desnaturante como se segue. <ol><li> Prepare a cassete de gel para o vazamento usando placas de vidro limpas e lançando suporte. Coloque fabricante de gradiente no topo de um pequeno agitador magnético e coloque uma pequena barra de agitação em cada câmara. </li><li> Usando 40% (w / v) de acrilamida e de 2% (w / v) de soluções stock bisacrilamida, preparar 5% e 10% (w / v) de soluções de gel de acrilamida em um tampão de resolução nativa. Assegure-se que a razão de acrilamida para bisacrilamida totais é de 37,5: 1. Frio em gelo antes do vazamento. Nota: O sistema não desnaturante PAGE usado aqui é essencialmente idêntico ao sistema de SDS-PAGE de Laemmli, com SDS omitido 22. </li><li> Adicionar persulfato de amónio (de 10% (w v) / solução de estoque preparadas em água) para as soluções de acrilamida para iniciar a polimerização. A concentração final de persulfato de amónio é de 0,1% (w / v). </li><li> Despeje a solução de acrilamida para as duas câmaras do fabricante de gradiente. Com a b tubulação de saída inseridontre as placas da cassete de gel, activar o agitador magnético e abrir as válvulas fabricante de gradiente. Despeje a 5 - em gel com gradiente não desnaturante a 10%. </li><li> Uma vez vazada, sobrepor o gel com uma camada fina de isopropanol e permitir que o gel para polimerizar durante 30 minutos. Durante este tempo, preparar a solução de gel de acrilamida a 5% fresco em tampão de resolver nativa. Depois de os conjuntos de gel, deitar fora isopropanol e lavar a superfície do gel, com água desionizada a partir de uma garrafa de esguicho. </li><li> Para a solução de gel de 5%, preparada antes, adicionar persulfato de amónio (exactamente como descrito em 4.1.3) e verter em cima do gel polimerizado até placas de vidro são cheios. Insira pente gel. Permitir que o gel sobreposta para polimerizar durante mais 30 min. </li><li> Uma vez que é de gel polimerizado, montar cassete de gel no aparelho de electroforese. Alternativamente, armazenar o gel a 4 ºC, envolto em toalhas de papel umedecido e filme plástico até que esteja pronto para uso. </li></ol></li><li> Uma vez que não desnaturante em gel PAGE é montada em elecAparelho trophoresis, encher o tanque com tampão de corrida nativa 1X preparada a partir de um estoque regulador execução nativa de 10X. </li><li> Carga de 10 ug de proteína purificada, obtida no final da secção 3, em cada poço usando uma seringa de vidro. </li><li> Carga 2 uL de padrão de peso molecular elevado de proteína nativa (diluído em tampão de corrida nativa 1X) em um dos poços. </li><li> Executar gel a 55 V e 4 ºC até que a frente de corante é executado fora do gel (cerca de 4-4,5 h). </li><li> Em adição ao gel não desnaturante, analisar-se alíquotas da proteína purificada por SDS-PAGE padrão 22. <ol><li> Misturar-se alíquotas (10 ug) das amostras de proteínas purificadas, obtidas no final da secção 3, com tampão SDS-amostra 5X a uma concentração final de 1X. </li><li> Incubar a 100 ºC durante 5 min e carregar no padrão de 12% e / ou 15% de géis de SDS-PAGE 22. </li><li> Executar a 80V durante 20 min e em seguida a 120 V até a frente do corante foge do gel (isto é, aproximadamente, um suplementoitional 75 min para um gel a 12%, e 120 minutos para um gel a 15%). </li></ol></li></ol> 5. Actividade visualização e coloração da proteína. <ol><li> Após a electroforese, as placas de vidro separadas e transferir cuidadosamente o gel não desnaturante para um tabuleiro de gel contendo 50 mL de água desionizada. Lavar o gel com balanço delicado por 5 min. Descarte de água e repita esta etapa de lavagem três vezes. </li><li> Realizar ensaio de sobreposição de substrato como se segue. <ol><li> Adicione 1 mL de desenvolver tampão contendo o substrato peptídeo fluorogénico Suc-LLVY-AMC e espalhe uniformemente sobre o gel. Incubar a 37 ºC durante 30 min. Nota: Uma vareta de vidro ou de um libertador de gel (pequena cunha de plástico usado para placas de vidro separadas) pode ser usado para espalhar o líquido sobre o gel. </li><li> Transferir cuidadosamente o gel sobre o transiluminador de UV de sistema de imagem do gel e observar fluorescência devida ao substrato péptido clivado. imagem Record. transferir cuidadosamente os ba gelck para a bandeja de gel. </li><li> Lavar o gel duas vezes com 50 mL de água desionizada durante 5 min com agitação suave. </li><li> Corar o gel com 10 ml de um reagente de coloração de Coomassie coloidal durante 60 minutos com agitação suave. gel Destain com 50 mL de água até o fundo se torna claro. Este passo aplica-se a coloração dos géis de SDS-PAGE bem como padrão. </li></ol></li></ol>

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<li>Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li>
<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós demonstramos o benefício de uma abordagem combinada à análise de montagem do proteosoma pelo não desnaturante PAGE utilizando proteasomas archaeal recombinantes. O método usual de 9,11 a co-expressão bacteriana de subunidades de proteassoma permite a análise rápida mas pode não revelar intermediários chave de montagem. Sugerimos combinando co-expressão com ligado misturando a desenvolver um quadro mais amplo de eventos de montagem. A vantagem desta abordagem combinada é que ap...

Complexos multiprotein realizar inúmeras actividades celulares críticas 1. Para muitos desses complexos, muito mais se sabe sobre sua estrutura e função do que cerca sua montagem 2,3. O proteassoma é um tal complexo e é encontrado em todos os domínios da vida. Em eucariotas, esta máquina molecular está no cerne do Sistema Proteasoma / ubiquitina (UPS) e fornece a principal via de degradação da proteína intracelular 4. O proteassoma eucariótica (referido como o proteassoma 26S) é composto de duas principais subconjuntos: um proteassoma 20S, ou partícula central (CP) 5, que pode ser tapado com uma ou ambas as extremidades por uma partícula de regulamentação 19S (RP) 6. O proteassoma 20S é um grande protease compartimentada. A sua estrutura quaternária é absolutamente conservado em todos os domínios de vida e consiste de uma pilha de quatro anéis de sete membros contendo dois tipos de subunidades estruturalmente relacionadas, α; e p 5,7,8. Nos eucariotas, os dois anéis exteriores são cada um composto por sete sub-unidades a distintas, e os dois anéis interiores são cada um composto por sete subunidades p diferentes; actividade proteolítica reside dentro de três das subunidades p. Em contraste, os anéis de CP arquebactérias e bactérias são geralmente composta por apenas um tipo de α e um tipo de subunidade β. Proteasomas Arqueais forneceram um importante sistema modelo para estudar a montagem do proteassoma devido tanto à sua simplicidade de composição e sua partilha de um mecanismo de montagem comum com os seus homólogos eucarióticos 9-13. Em breve, subunidades a montar em anéis alfa em primeiro lugar, que servem como um andaime sobre o qual p subunidades montar. As meias-proteassomas resultantes (7 α β 7) dimerizar, dando origem a CP totalmente montado (α β 7 7 7 β α 7). Durante a dimerização, os pró-péptidos apresentar em subunidades psão autocataliticamente removida, expondo as treoninas N-terminais catalíticas. A utilização de proteossomas de arqueia para modelar montagem frequentemente leva vantagem de a produção de proteínas recombinantes de proteassoma de arqueia em Escherichia coli. Esta é uma abordagem útil porque permite que as subunidades a ser produzidos em várias combinações, como tanto a WT e versões mutantes, num organismo hospedeiro que não produz as suas próprias proteossomas. Acompanhamento do conjunto de complexos multi-protéicos requer bioquimicamente algum tipo de método de fraccionamento que separa complexos totalmente montados a partir de intermediários de montagem e precursores. Devido à sua capacidade de resolução superior, não desnaturante em gel de poliacrilamida de electroforese (PAGE), tem provado ser especialmente úteis no fraccionamento de vários grandes complexos multiproteicos 14-17. A combinação de produção proteassoma archaeal recombinante e PAGE não desnaturante tornou-se uma abordagem poderosa em dissecting de montagem do proteassoma 9,11,12,18. No entanto, o método usual, através da qual esta abordagem é aplicada (isto é. Por meio da co-expressão recombinante de subunidades a e p) tem uma importante desvantagem. Reações de montagem são cooperativos e fortemente dependente da concentração 3. Dado que a concentração de proteínas no interior das células é muito alta 19, devido a efeitos de volume excluído, reacções de montagem proceder rapidamente in vivo. Por isso, é possível perder importantes intermediários de montagem quando aep subunidades são co-expressos. Aqui, defendem uma abordagem combinada no estudo da montagem do proteassoma usando subunidades de proteassoma archaeal recombinantes. Nesta abordagem, ambos os métodos de mistura e co-expressão de lisado são empregues. O ex-permite a análise rápida de reunião, porque a co-expressão é menos trabalhosa. Este último depende da expressão separada de subunidades a e p, seguidos por mistura. Embora este requires um pouco mais esforço do que co-expressão, é mais do que compensada pela capacidade de detectar intermediários que são perdidas durante a co-expressão. Juntos, estes dois métodos podem fornecer um quadro mais completo de montagem do proteassoma.

<table><tbody><tr><td>Solução de acrilamida (40%)</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>A acrilamida não polimerizada é uma neurotoxina. Use equipamento de proteção adequado</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL filtros centrífugos</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bisacrilamida (2%)</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Azul</td> <td>de bromofenolSigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 células competentes</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Reagente de coloração coomassie coloidal para géis</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Sistema de documentação de gel</td></tr><tr><td>Liberadores de gel</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Plástico em forma de cunha usado para separar placas de gel; útil para espalhar líquido.</td></tr><tr><td>Haste de vidro</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Seringa de vidro para carregar géis</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Kit de calibração nativo</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>Padrões de proteína de alto peso molecular</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Fabricante</td></tr> de <tr><td>gradiente Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>Para indução de expressão de proteína</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de canamicina</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka analítica</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Aparelho de eletroforese em gel</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Plasmídeo de expressão</td></tr><tr><td>Precision mais todos os padrões azuis</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Padrão de proteína molecular para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Kit de mutagênese Quickchange</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl Sulfate de sódio (SDS)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Substrato fluorogênico</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Resina de afinidade de cobalto imobilizado</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Bacto BD</td><td></td><td></td>211699</tr><tr><td>bandeja de amostras UV</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>Para imagens UV de géis</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examinando assembleia proteosoma com recombinante archaea proteasomas e não desnaturante page: the case for uma abordagem combinada

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Proteossomas são encontrados em todos os domínios da vida. Eles fornecem a principal via de degradação da proteína intracelular em eucariotas, embora a sua montagem não está completamente esclarecido. Todos os proteasomas conter uma partícula estruturalmente conservada núcleo (CP), ou proteassoma 20S, contendo dois anéis de subunidade beta heptamérico imprensado entre dois anéis de subunidades α heptamérico. Archaea proteosomas 20S são de composição simples em comparação com os seus homólogos eucarióticos, ainda que ambos partilham um mecanismo de montagem comum. Consequentemente, Archaea proteosomas 20S continuam a ser modelos importantes para a montagem do proteassoma eucariótica. Especificamente, a expressão recombinante de 20s archaeal proteasomas juntamente com não desnaturante eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) rendeu muitos insights importantes sobre a biogênese proteassoma. Aqui, discutimos um meio para melhorar a estratégia habitual de co-expressão de α proteassoma e archaea subunidades p antes nondenaturing PAGE. Nós demonstramos que, embora rápida e eficiente, uma abordagem co-expressão por si só pode perder intermediários chave de montagem. No caso de o proteassoma, a co-expressão pode não permitir a detecção da meia-proteassoma, um contendo uma completa α-anel intermédio e uma completa β-anel. No entanto, este intermediário é facilmente detectado por meio de mistura lisado. Sugerimos que a combinação de co-expressão com mistura lisado produz uma abordagem que seja mais aprofundada na análise de montagem, ainda permanece nonintensive trabalho. Esta abordagem pode ser útil para o estudo de outros complexos multiproteicos recombinantes.

Montagem de proteassoma (Figura 1) começa quando sub-unidades a combinam-se para 9 formam anéis. Isto pode ser ilustrado quando subunidades alfa do archaeon Methanococcus maripaludis S2 são expressas em E. coli como C-terminal de hexa-histidina com etiquetas (His-tag) derivados (Tabela 1). Quando o α-His recombinante foi purificada por ICAR e analisadas por PAGE não desnaturante, duas bandas foram observadas (Figura 2A, pista 1). Temos demon...

Este protocolo usa tanto co-expressão de subunidades e subunidade postlysis mistura para um exame mais aprofundado do conjunto proteassoma recombinante.

Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

O objetivo geral deste experimento é analisar a montagem de um complexo multiproteico, como o proteassoma, utilizando subunidades recombinantes e eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante, ou PAGE. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do proteassoma, como, por exemplo, quais espécies intermediárias são encontradas ao longo da via de montagem desse complexo proteico. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a triagem rápida da montagem por duas abordagens paralelas, possibilitando a detecção de intermediários na via e fora da via. Este procedimento inicia-se com a expressão bacteriana, conforme descrito no protocolo textual. Para realizar a lise bacteriana, descongele o pellet celular induzido coexpressando a combinação desejada de subunidades do proteassoma, mantendo-o no gelo por cinco minutos. Após o descongelamento, reconstitua o pellet em 600 microlitros de Tampão de Lisia. Incube a suspensão a 30

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de agregação de proteínas baseado em células usando inibidores de proteassoma, que bloqueiam a atividade do proteassoma, impedindo que proteínas mutantes mal dobradas, fundidas a um rótulo fluorescente, sofram degradação proteassômica dependente de ubiquitina, levando ao seu acúmulo dentro do citoplasma celular. Os agregados proteicos são então visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência.

Ensaio de Formação de Agregados de Proteínas: Um Método para Detectar e Quantificar a Agregação de Proteínas em Células Cultivadas após Indução por Inibidor de Proteassoma

A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de "tags", como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal.

Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.

Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Este protocolo descreve em detalhes a preparação de complexos nucleossômicos usando dois métodos de preparação de amostras para congelamento de grades de TEM.

Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica

Aprenda a analisar a montagem de proteassomas recombinantes de Archaea usando coexpressão de subunidades e mistura pós-lise com PAGE não desnaturante. Este método permite a detecção rápida de intermediários na via de montagem.

Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada (Vídeo) | JoVE Journal

Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada

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