On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

O objetivo geral da implementação de cromatografia de exclusão de tamanho e troca iônica on-line em linhas de feixe de espalhamento de raios X de pequeno ângulo é obter dados de modelo de baixa resolução de melhor qualidade, garantindo atrasos mínimos entre a preparação da amostra e a aquisição de dados. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia estrutural. Como a operação de raio, a maior distância intra-particular, a forma da partícula, o grau de desnaturação ou desordem de dobramento.

O SAXS requer amostras dispersas molares. A principal vantagem desta técnica é que o tempo entre a purificação e a medição é curto, ajudando a evitar a desnaturação ou advicação da amostra. Antes de ir para a instalação da linha de luz, prepare uma amostra concentrada usando métodos publicados anteriormente e execute testes SEC.

Na instalação da linha de luz, coloque um mililitro de tampão de filtragem de gel em um tubo de reação de 1,5 mililitro. Em seguida, conecte o frasco de tampão de filtração de gel a um sistema de HPLC de acordo com o capilar de fluxo da configuração SAXS. Defina a taxa de fluxo, a pressão máxima da coluna e o tempo de aquisição.

Observe a contrapressão sem a coluna. Limpe as linhas e, em seguida, conecte e equilibre a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho. Carregue a amostra tampão de um mililitro no trocador de amostras.

Saia e proteja ou bloqueie a gaiola experimental e, em seguida, faça login no software de controle da linha de luz no modo de troca de amostras. Envie a amostra tampão no trocador de amostras diretamente através do capilar de fluxo SAXS. Efectue um breve ensaio SAXS e verifique se a intensidade da dispersão sonora dos raios X não apresenta sinais de danos causados pela radiação.

Mude o sistema de controle da linha de luz para o modo HPLC e execute um teste SAXS de buffer através do sistema HPLC SAXS completo. Se os dados não corresponderem à primeira medição, reequilibre e execute outro teste. Em seguida, centrifugue a amostra de proteína a 13.000 vezes G no laboratório durante 10 minutos para remover os agregados.

Transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis de vidro compatível com HPLC. Carregue o frasco para injetáveis no amostrador automático, observando a posição da amostra. Intertrave a gaiola e crie uma pasta para os dados do experimento no sistema de controle da linha de luz.

Em seguida, no software HPLC, clique em lote rápido. Defina o caminho do arquivo e ative a conversão ascii automática de dados UV Vis. Insira o volume de injeção e a posição da amostra no amostrador automático.

Clique em iniciar'para adicionar a execução à fila. Digite o nome do arquivo, mas não clique em salvar'ainda. No software de controle da linha de luz, defina o número de quadros de dados para que o tempo de coleta de dados SAXS seja um pouco maior do que o tempo de aquisição de HPLC.

Abra o obturador da linha de luz e inicie a coleta de dados SAXS. Mude para o software HPLC e clique em salvar'para injetar a amostra. Observe o número do quadro no início da aquisição de dados UV/VIS e monitore a intensidade somada ao longo do tempo.

Durante a preparação da amostra, efectuar um ensaio IEC com um gradiente linear de cloreto de sódio de 25 milimolares a um molar. Para cada pico de interesse, determinar a quantidade correspondente de tampão B com elevado teor de sal na fase móvel. Para iniciar o experimento IEC SAXS, reserve amostras de um mililitro de tampões A e B e, em seguida, conecte os tampões ao sistema HPLC.

Defina os parâmetros de HPLC e, em seguida, purgue o sistema e lave as linhas com tampão de baixo teor de sal A. Conecte e equilibre a coluna de troca iônica com o tampão A. Carregue as amostras de um mililitro dos tampões A e B no trocador de amostras. Trave a gaiola e execute um curto teste SAXS para cada amostra de buffer no modo de troca de amostra para verificar a suscetibilidade do buffer a danos por radiação. Em seguida, mude para o modo HPLC e execute outro teste SAXS para o buffer A. Compare os padrões de espalhamento com os obtidos no teste do trocador de amostras.

Em seguida, crie uma pasta para os dados do experimento. Em seguida, projete um gradiente de HPLC passo a passo que comece com zero por cento de buffer de sal alto B e aumente cinco por cento em intervalos de dois volumes de coluna para atingir 100 por cento de buffer B. Configure uma única execução de gradiente na qual nenhuma amostra é injetada. Abra o obturador da linha de luz, inicie a coleta de dados SAXS e inicie a execução do HPLC.

Observe o número de quadros decorridos quando a coleta de dados do UV/VIS começa. Após a coleta de dados, verifique se a intensidade somada permaneceu constante por pelo menos 100 quadros e corresponde aos valores obtidos das amostras de buffers A e B.Em seguida, faça outro método de HPLC de gradiente passo a passo, começando com zero por cento do buffer B.Crie uma etapa para cada valor percentual B determinado no teste de gradiente IEC off-line. Adicione etapas de gradiente um ponto percentual abaixo e 1,5 pontos acima de cada um desses valores.

Defina cada intervalo de etapa para 2,5 volumes de coluna e a etapa final no gradiente para 100 por cento B.Dilua o sobrenadante conforme necessário para obter a composição do tampão A.Pare as bombas de HPLC, desconecte a tubulação da coluna dos detectores e coloque a extremidade da linha em um recipiente para coletar o fluxo da coluna. Em seguida, transfira a linha tampão A para a amostra diluída, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa no tubo. Inicie as bombas para puxar a amostra para a coluna.

Quando o recipiente de amostra estiver quase vazio, pare as bombas e coloque a garrafa de buffer A de volta na linha. Inicie as bombas e passe o buffer A pela coluna para dois volumes de coluna, depois pare as bombas e reconecte a coluna aos detectores. Usando o novo método passo a passo, configure uma única execução de HPLC sem injeção automática de amostra.

Abra o obturador da linha de luz e adquira os dados SAXS e UV Vis. Monitore a intensidade somada ao longo do tempo. Em seguida, use o software de pós-processamento para converter os dados de HPLC para um formato ascii.

Usando um gerenciador de dados on-line, identifique os quadros SAXS correspondentes ao pico de eluição da amostra. Verifique se o raio de giyração é estável em todo o pico. Importe os quadros de pico para um programa de processamento de dados SAXS e crie uma curva de dispersão média não corrigida.

Para SCC SAXS, confirme se a região Q alta do buffer médio, não apenas a curva de espalhamento não corrigida. Carregue e dimensione os quadros auto-subtraídos do pico e verifique se não há diferenças sistemáticas. Calcule a média de todas as curvas para obter a curva SAXS final.

Para IEC SAXS, média de 50 quadros de cada etapa de gradiente. Compare essas médias com a curva não corrigida e selecione a etapa de gradiente com a melhor correspondência de Q alto. Subtraia a média escolhida da curva não corrigida para criar a curva SAXS final.

Finalmente, determine a distribuição da distância do par e execute a modelagem ab initio para determinar o modelo mais representativo da proteína. Os parâmetros de dados estruturais obtidos de SEC e IEC SAXS da proteína D5 foram muito semelhantes. As estimativas de massa molecular estavam de acordo com a massa prevista.

A modelagem ab initio foi realizada sem simetria imposta e com simetria C6. Ambos os modelos são compatíveis com os dados do experimento, indicando que a estrutura da proteína possui simetria C6. A modelagem molecular produz uma estrutura semelhante a uma pirâmide hexogonal com um canal central parcialmente obstruído.

Os modelos SEC e IEC médios foram muito semelhantes. Ao examinar modelos individuais, descobriu-se que as obstruções do canal provavelmente eram um artefato do processo de média. O SAXS está se tornando razoavelmente mais padrão, mas para muitas etapas de purificação e outras cromatografias de troca iônica são necessárias para se livrar de agregados ou contaminantes.

Neste protocolo apresentamos ambas as técnicas, cromatografia de exclusão de tamanho on-line e cromatografia de troca iônica on-line em uma linha de luz bio SAXS. Uma ressalva de ambas as técnicas é que a concentração precisa da proteína não é conhecida, portanto, não podemos determinar o espalhamento de massa molecular. No entanto, para proteínas globulares, ainda podemos estimar o volume de massa.

Um gradiente linear pode ser aplicado em vez do gradiente passo a passo que usamos aqui na cromatografia de troca iônica, embora isso exija uma otimização da condição do tampão para uma separação ideal dos picos. Essas técnicas nos permitem coletar dados SAXS de boa qualidade, mesmo em sistemas complicados.