Name: On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a implementar cromatografia de exclusão por tamanho e troca iônica online em SAXS para melhorar a qualidade dos dados estruturais de proteínas. Este método minimiza a desnaturação entre preparação e aquisição.

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Agradecemos o apoio financeiro ao projeto da bolsa francesa REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 e de bolsas de pesquisa do Service de Santé des Armées e da Délégation Générale pour l'Armement. Somos gratos ao ESRF pelo tempo de feixe do SAXS. Agradecemos a Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister e Guy Schoehn pelo apoio financeiro e científico.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Para muitas macromoléculas, uma etapa final de purificação utilizando cromatografia é necessária antes da coleta de dados de SAXS para obter um bom conjunto de dados de qualidade. No entanto, nem todas as amostras permanecem estáveis; eles podem ser propensos a agregação ou re-equilibração a uma mistura de estados de oligomerização. Portanto, um passo de purificação final online na linha de luz é necessária para minimizar o tempo entre a purificação e a recolha de dados, a fim de obter os dados de SAXS melhor qualidade. Dependendo das propriedades biofísicas da proteína de interesse, sec-SAXS ou IEC-SAXS podem ser escolhidos para se obter a qualidade da amostra óptima. Aqui, sobre uma construção de proteína derivada da helicase / primase D5, ambas as técnicas são explicadas e discutido. Aquisição de dados SEC-SAXS está se tornando mais e mais padronizados e está disponível em muitas linhas de luz BioSAXS. A análise dos dados, especialmente subtração de fundo, é relativamente simples e fácil. No entanto, um sinal de tampão estávele a separação suficiente das espécies macromoleculares continua a ser essencial. Portanto, é crítico para reservar tempo suficiente para equilibrar a coluna exaustivamente. A falha deste método pode ser devido a contaminantes persistentes de tamanho semelhante para a proteína de interesse, em baixas concentrações, e tampões sensíveis à radiação. Na prática, inicialmente, sec-SAXS é susceptível de ser usado como o método de escolha para a maioria das amostras macromoleculares. Ainda assim, muitos protocolos de purificação requer um passo de prévia IEC devido à presença de contaminantes ou de agregação. Dado que a cada passo de concentração e cromatografia está associada a perdas de amostra (estimado em 30-50%) e no tempo, directa IEC-SAXS é vantajosa. Para amostras que não pode ser purificado por SEC, seja devido à presença de &quot;contaminantes&quot; de tamanho similar ou porque severamente agregado nas concentrações necessárias, IEC-SAXS seria sempre a melhor abordagem adequada. Além disso, as taxas de fluxo mais elevadas suportadopor muitos colunas IEC pode ajudar a reduzir o tempo de trânsito entre a purificação e de medição. No exemplo aqui apresentado, IEC foi usado com uma eluição de passo, que permite a separação dos picos próximos de 323-785 D5 de contaminantes, escolhendo cuidadosamente os passos de concentração de sal. Em princípio, o número de passos é ilimitado, mas na prática, é necessário pelo menos um passo de pico por, e não são muitas deve ser escolhido. Para o método de subtracção do fundo descrito acima, é fundamental para medir um número relativamente elevado de composições tampão diferentes a fim de encontrar a uma correspondência. A desvantagem compartilhada de ambas as técnicas é a falta de informações precisas concentração de proteína. Devido a isso, a determinação da massa precisa baseado em dispersão para a frente não é possível. Para as proteínas globulares, tais como D5 323-785, o volume Porod fornece uma alternativa, se bem que menos precisa estimativa, em massa, mas para proteínas altamente flexíveis ou desordenados, Esta abordagem não seria válido. Uma variação do gradiente passo a passo método IEC-SAXS aqui apresentada é a utilização de um gradiente linear em vez disso. Embora seja possível trabalhar com o maior número de passos, como desejado para isolar sub-picos utilizando uma eluição por passos, na abordagem gradiente linear, que é necessária para optimizar as condições de gradiente com cuidado, a fim de separar os picos inteiramente antes de iniciar o SAXS experimentar. A subtração nesta abordagem poderia ser feito frame-sábio e poderia ser verificada por meio da comparação dos quadros individuais, mas requer a manipulação de dados mais avançada e um software dedicado ainda não existe. A escolha de uma coluna adequada é crítica para ambas as técnicas, uma vez que determina a separação das espécies macromoleculares. colunas de exclusão de tamanho diferem na capacidade de carga, a gama de tamanho das macromoléculas separáveis, e resolução, enquanto que as colunas de permuta de iões pode variar com o tipo e a densidadede suas cargas imobilizadas. Embora o protocolo aqui apresentado é específico para a linha de luz ESRF BM29, a adaptação a qualquer outra linha de luz SAXS é, em princípio, simples. Os principais requisitos são um fluxo suficientemente elevado de raios-X e um detector adequado (de preferência um único fotão de contagem), para adquirir dados razoáveis ​​de sinal-para-ruído na gama de segundos ou menos, e um sistema de cromatografia líquida de linha capaz de criar gradientes. A aplicação exacta seria, naturalmente, dependem do ambiente de linha de luz local. Os resultados obtidos na D5 323-785 usando os dois métodos diferem ligeiramente. O raio de rotação é um pouco menor para os dados IEC do que para os dados de SEC, e os mínimos locais da curva de espalhamento são transferidas para vectores de dispersão um pouco maiores. Isto significa que a D5 323-785 medido com a IEC-SAXS é ligeiramente mais compacta do que a D5 323-785 medido com SEC-SAXS. Isto pode be, devido a diferenças na preparação da amostra, no tempo entre a purificação e medição (IEC é mais rápido), ou, menos provável, a um contaminante na amostra SEC-purificado. Os modelos de talão obtidos de forma totalmente independente, com ambos os métodos são comparáveis (Figura 1H). D5 323-785 mostra o, a estrutura hexamérica oca esperado 18. Em conclusão, permuta iónica e cromatografia em linha de exclusão de tamanho em linha são importantes os métodos de purificação bioquímicas que pode ser acoplado directamente ao 6,7,9-12,25,26 SAXS. A subtração de dados IEC-SAXS fundo é um pouco mais difícil e ambíguo do que para SEC-SAXS, mas não deixa de ser possível. Dependendo das propriedades biofísicas da proteína de interesse, tanto SEC e IEC-SAXS permitiria a optimização da separação das espécies com as vantagens inerentes. Fornecendo inteligência que os passos de validação (como descrito) estão correctamente observado, os dados resultantes podem ser analisadosh confiança, e os modelos podem ser determinados utilizando as ferramentas padrão disponíveis na comunidade. Em conjunto, ambas as técnicas de separação em linha para permitir que uma ampla gama de macromoléculas biológicas, obtendo-se os dados não acessíveis através de medições estáticas convencionais.

BioSAXS é uma ferramenta poderosa para determinar a forma de objectos de tamanho nano-1-4. A dispersão de raios-X por uma solução contendo macromoléculas, dimensionadas na gama nm, é gravado em ângulos muito baixos. Esta gama angular contém informações sobre parâmetros globais: o raio de giro; a maior distância intraparticular; A forma da partícula; e o grau de dobragem, a desnaturação, ou distúrbio. A técnica não requer cristais, e a macromolécula estadias em solução e, portanto, pode ser mantido em condições que imitam certos parâmetros importantes de célula, tais como força iónica, pH, etc. O conhecimento destes factores poderia ajudar a determinar, por exemplo, o estado oligomérico fisiologicamente relevante de uma proteína de interesse ou para validar um modelo proposto de um complexo. A caracterização de interacções proteína-proteína em diferentes condições de tampão, a criação de modelos de domínios em falta, o refinamento de modelos de homologia, e o derescisão de estados dobrada e desdobrada discretos podem ser realizadas rapidamente e facilmente 5. Tal como acontece com qualquer técnica, BioSAXS tem debilidades intrínsecas: Amostras de agregados ou desnaturados, misturas de partículas, amostras heterogéneas, os danos da radiação, e os desajustes de buffer pode resultar em dados un-interpretável. Para muitos métodos de análise, assume-se implicitamente que a amostra é monodispersa, um requisito que é muitas vezes difícil de obter na prática. Em muitos casos, a degradação da amostra é subtil e não pode ser detectado nos dados sobre o seu próprio, e qualquer tentativa para interpretar os dados dá resultados imprecisos ou mesmo enganosos. Para superar esses obstáculos, a combinação de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e SAXS foi implementado em muitas linhas de luz para garantir a qualidade dos dados e tornar esta técnica mais acessível para as amostras de cada vez mais difíceis 6-11. Recentemente, nós adicionamos um novo método para o repertório através do desenvolvimento de íon-troca on-linecromatografia (IEC) -coupled SAXS 12. Ambas as técnicas são SAXS abertura para uma ampla gama de partículas biológicas anteriormente impossível analisar. A escolha de qual método usar depende das propriedades biofísicas das partículas de interesse. SEC separa macromoléculas pelo seu tamanho, em que é necessária pelo menos uma diferença de 10% na massa molecular aparente para a separação. limitações físicas da coluna e as propriedades fisiológicas das amostras, como superfícies hidrofóbicas, flexibilidade e falta de estabilidade, também complicam a coleta de dados, análise e interpretação. Cromatografia de permuta de iões, o que separa as moléculas com base na sua carga e, por conseguinte, a sua afinidade de ligação para a coluna de IEC, podem ser utilizados em vez de ou em adição a SEC. A carga total pode ser facilmente manipulado por alteração do pH, ou variando a concentração de sal do tampão, fornecendo um método relativamente simples para o el controladabuição das moléculas a partir da coluna de IEC. Ao utilizar a carga, a separação de tipos semelhantes e tamanhos de moléculas, que de outra forma seriam difíceis de separar, pode ser realizada rotineiramente com a norma IEC. Além disso, a IEC tem a vantagem de ser capaz de lidar com as amostras diluídas, permitindo que se possa evitar os passos de concentração, que carregam o risco potencial de desnaturação da proteína. Infelizmente, como a distribuição de carga é altamente amostra-dependente, IEC exige otimização quanto ao pH e as concentrações de sal 13,14. Para muitas proteínas que são difíceis de expressar, purificar, ou ambos, apenas pequenas quantidades de amostra estão disponíveis para estudar. É importante para ser eficaz e minimizar o número de passos de purificação e, por conseguinte, as perdas. Por esta razão, o último passo de purificação é directamente em linha antes da aquisição de dados de SAXS, a fim de aumentar a probabilidade de recolha de um bom conjunto de dados. Aqui, Apresentamos e comparar on-line SEC-SAXS e IEC-SAXS. Ambas as técnicas foram implementadas na linha de luz BioSAXS BM29 no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) em Grenoble, França 15. Tal como um caso de teste, utilizou-se o domínio D5N e helicase da proteína do vírus vaccinia D5, que foi bastante difícil de analisar estruturalmente usando outros métodos. O vírus de vaccinia é um membro da família Poxviridae e é 98% idêntica ao vírus da varíola, a causa da varíola. Usando o sistema de vaccinia, estudamos o mecanismo de replicação, concentrando aqui no D5 essencial helicase-primase. D5 é uma proteína de 95 kDa com uma primase ARCHEO-eucariótica (AEP) do domínio N-terminal 16 seguida por uma região de grupos de cisteína (res. 240-345) 16. Mais na direcção da extremidade C-terminal vem um domínio D5N (res. 340-460), que está sempre associada com helicases do tipo D5, e, finalmente, uma superfamília 3 (PC3) domínio da helicase (res. 460-785) 17 (Figure 1A). O domínio da helicase da D5 constrói uma estrutura hexamérica anel que é necessário para a ligação forte ao ADN. Graças a recentes estudos de SAXS e EM, as estruturas de baixa resolução da primase e helicase os domínios são agora conhecidos 18. Aqui, vamos mostrar como usar as técnicas de cromatografia em linha implementadas na linha de luz BioSAXS BM29 no ESRF para obter insights sobre a estrutura do fragmento C-terminal (resíduos 323-785) de D5.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Gel de proteína pré-fabricada</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético glacial</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Filtros centrífugos Amicon Ultra -15 Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel completo de inibidores de protease&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Coluna de dessalinização</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>vetor HTb pProEx</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>&nbsp; Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extração de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen life technology</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>home made</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen life technology</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R coluna&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</strong</td></tr><tr><td>>SoftwaresSoftware de controle de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>linha de luz BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>desenvolvimento local</td></tr><tr><td>Software Camserver</td><td>Dectris</td><td>n.a.software</td> <td>de controle do detector</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programa para alinhar modelos ab initio&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio programa</td></tr><tr><td>de reconstrução de modelo HPLC programa Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>Desenvolvimento local</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programa, que realiza a manipulação com o experimental SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td> <td>software para visualização</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programa para sobrepor estruturas 3D</td></tr><tr><td>Name</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Coletor de frações</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim BBI8535108</td><td></td><td></td> de biotecnologia</tr></tbody></table>

on-line tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma saxs beamline

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

pequeno ângulo de dispersão de raios X Biológica (BioSAXS) é uma técnica poderosa em biologia molecular e estrutural usado para determinar a estrutura solução, tamanho e forma das partículas, e a relação de superfície-para-volume de macromoléculas. A técnica é aplicável a uma ampla variedade de condições de solução que abrangem uma ampla gama de concentrações, valores de pH, temperaturas, forças iónicas, aditivos, etc., mas a amostra é necessário para ser monodispersa. Esta ressalva levou à implementação de sistemas de cromatografia líquida de linhas de luz SAXS. Aqui, nós descrevemos a integração a montante do de exclusão de tamanho (SEC) e a cromatografia de permuta iónica (IEC) numa linha de luz, métodos diferentes para a subtracção de fundo óptima, e a redução de dados. Como exemplo, descreve-se como usamos sec- e IEC-SAXS em um fragmento da proteína do vírus vaccinia essencial D5, que consiste de um domínio D5N helicase. Determinamos a sua forma global e o peso molecular, que mostra a estrutura hexamérica de the proteína.

Os resultados da análise invariante livre de modelo estão listadas na Tabela 1. A análise dos dados de SEC-323-785 SAXS D5 mostrou uma estimativa da massa molecular (a partir de uma análise Porod) de 345 kDa contra 338 kDa, observada utilizando IEC-SAXS. Ambos estão de acordo com a massa esperada de 6 vezes de 53,5 kDa (321 kDa) para um hexâmero. A modelagem ab initio de ambos os conjuntos de dados foi realizada sem simetria imposta (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) e utilizando simetria C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Como os ataques gerais para os dados de dispersão para ambas as reconstruções são comparáveis em ambos os casos (Figura 1D e E), C6 simetria pode ser assumida. Assim, o modelo corresponde a uma estrutura semelhante a cone hexagonal com um canal central, que aparece parcialmente obstruída (SEC: Figura 1F; IEC: Figura 1H). Um exame dos modelos individuais antes de média mostra que esta obstrução é provável que seja um artefacto do processo de cálculo da média. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> Figura 1: análise de dados de SAXS e comparação de D5 323 -785 (Figura adaptada de referências 12 e 18). A) Esquema de estrutura do domínio de proteína D5 e D5 323-785. B) cromatograma off-line de troca iônica com a indicação dos três picos. curva de laranja: Absorvância a 280 nm (UA), a curva azul: percentagem de tampão B. As percentagens de tampão B no lado dos picos são indicadas. C) Online cromatograma de permuta iónica. tecla colorida como em B. Além disso, a intensidade medida é indicado em verde. A dispersão experimental curva de umND calculada curva do modelo obtido por SEC-D SAXS) e IEC e) Análise de dados de D5 323-785. Modelo F) Bead de D5 323-785 com base em dados da SEC e dados G) IEC. H) Sobreposição dos modelos da SEC e da IEC. Os painéis em F) para H) foram criados usando um software de visualização molecular 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Parâmetros de coleta de dados </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Comprimento de onda (A) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-range (-1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Sample-to-detector distância </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> Tempo de exposição (seg) </td><td> 1 por quadro </td></tr><tr><td> intervalo de concentração </td><td> n / D </td></tr><tr><td> Temperatura (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> detetor </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fótons / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Tamanho do feixe (2 uM) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Parâmetros estruturais para D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [a partir de Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (a) [a partir Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g usado para Guinier </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> D max (a) [a partir de P (R)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> Q-gama utilizada para P (r) (A-1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Porod volume V P (A 3) [do Scatter] </td><td> (570 ± 5) x 10 3 </td></tr><tr><td> Massa molecular M r (kDa) [a partir de V P] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Calculado monomérica senhor da sequência (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Parâmetros estruturais para D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [a partir de Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (a) [a partir Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g usado para Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> D max (a) [a partir de P (R)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Q-gama utilizada para P (r) (A-1) </td><td> ,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod volume V P (&amp; #197; 3) [a partir de Dispersão] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Massa molecular M r (kDa) [a partir de V P] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Calculado hexamérica senhor da sequência (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: parâmetros de dados de SAXS. A tabela resume os parâmetros de aquisição de dados e análise de SAXS.

A determinação da estrutura da solução de proteína por um pequeno ângulo de dispersão de raios-X (SAXS) requer amostras monodispersas. Aqui, apresentamos duas possibilidades para assegurar atrasos mínimos entre a preparação da amostra e aquisição de dados: cromatografia em linha de exclusão de tamanho (SEC) e cromatografia de troca iônica em linha (IEC).

On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

O objetivo geral da implementação de cromatografia de exclusão de tamanho e troca iônica on-line em linhas de feixe de espalhamento de raios X de pequeno ângulo é obter dados de modelo de baixa resolução de melhor qualidade, garantindo atrasos mínimos entre a preparação da amostra e a aquisição de dados. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia estrutural. Como a operação de raio, a maior distância intra-particular, a forma da partícula, o grau de desnaturação ou desordem de dobramento.O SAXS requer amostras dispersas molares. A principal vantagem desta técnica é que o tempo entre a purificação e a medição é curto, ajudando a evitar a desnaturação ou advicação da amostra. Antes de ir para a instalação da linha de luz, prepare uma amostra concentrada usando métodos publicados anteriormente e execute testes SEC.Na instalação da linha de luz, coloque um mililitro de tampão de filtragem de gel em um tubo de reação de 1,5 mililitro. Em seguida, conecte o frasco de tampão de filtração de gel a um sistema de HPLC de acordo com o capilar de fluxo da configuração SAXS. Defina a taxa de fluxo, a pressão máxima da coluna e o tempo de aquisição.Observe a contrapressão sem a coluna. Limpe as linhas e, em seguida, conecte e equilibre a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho. Carregue a amostra tampão de um mililitro no trocador de amostras.Saia e proteja ou bloqueie a gaiola experimental e, em seguida, faça login no software de controle da linha de luz no modo de troca de amostras. Envie a amostra tampão no trocador de amostras diretamente através do capilar de fluxo SAXS. Efectue um breve ensaio SAXS e verifique se a intensidade da dispersão sonora dos raios X não apresenta sinais de danos causados pela radiação.Mude o sistema de controle da linha de luz para o modo HPLC e execute um teste SAXS de buffer através do sistema HPLC SAXS completo. Se os dados não corresponderem à primeira medição, reequilibre e execute outro teste. Em seguida, centrifugue a amostra de proteína a 13.000 vezes G no laboratório durante 10 minutos para remover os agregados.Transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis de vidro compatível com HPLC. Carregue o frasco para injetáveis no amostrador automático, observando a posição da amostra. Intertrave a gaiola e crie uma pasta para os dados do experimento no sistema de controle da linha de luz.Em seguida, no software HPLC, clique em lote rápido. Defina o caminho do arquivo e ative a conversão ascii automática de dados UV Vis. Insira o volume de injeção e a posição da amostra no amostrador automático.Clique em iniciar'para adicionar a execução à fila. Digite o nome do arquivo, mas não clique em salvar'ainda. No software de controle da linha de luz, defina o número de quadros de dados para que o tempo de coleta de dados SAXS seja um pouco maior do que o tempo de aquisição de HPLC.Abra o obturador da linha de luz e inicie a coleta de dados SAXS. Mude para o software HPLC e clique em salvar'para injetar a amostra. Observe o número do quadro no início da aquisição de dados UV/VIS e monitore a intensidade somada ao longo do tempo.Durante a preparação da amostra, efectuar um ensaio IEC com um gradiente linear de cloreto de sódio de 25 milimolares a um molar. Para cada pico de interesse, determinar a quantidade correspondente de tampão B com elevado teor de sal na fase móvel. Para iniciar o experimento IEC SAXS, reserve amostras de um mililitro de tampões A e B e, em seguida, conecte os tampões ao sistema HPLC.Defina os parâmetros de HPLC e, em seguida, purgue o sistema e lave as linhas com tampão de baixo teor de sal A. Conecte e equilibre a coluna de troca iônica com o tampão A. Carregue as amostras de um mililitro dos tampões A e B no trocador de amostras. Trave a gaiola e execute um curto teste SAXS para cada amostra de buffer no modo de troca de amostra para verificar a suscetibilidade do buffer a danos por radiação. Em seguida, mude para o modo HPLC e execute outro teste SAXS para o buffer A. Compare os padrões de espalhamento com os obtidos no teste do trocador de amostras.Em seguida, crie uma pasta para os dados do experimento. Em seguida, projete um gradiente de HPLC passo a passo que comece com zero por cento de buffer de sal alto B e aumente cinco por cento em intervalos de dois volumes de coluna para atingir 100 por cento de buffer B. Configure uma única execução de gradiente na qual nenhuma amostra é injetada. Abra o obturador da linha de luz, inicie a coleta de dados SAXS e inicie a execução do HPLC.Observe o número de quadros decorridos quando a coleta de dados do UV/VIS começa. Após a coleta de dados, verifique se a intensidade somada permaneceu constante por pelo menos 100 quadros e corresponde aos valores obtidos das amostras de buffers A e B.Em seguida, faça outro método de HPLC de gradiente passo a passo, começando com zero por cento do buffer B.Crie uma etapa para cada valor percentual B determinado no teste de gradiente IEC off-line. Adicione etapas de gradiente um ponto percentual abaixo e 1,5 pontos acima de cada um desses valores.Defina cada intervalo de etapa para 2,5 volumes de coluna e a etapa final no gradiente para 100 por cento B.Dilua o sobrenadante conforme necessário para obter a composição do tampão A.Pare as bombas de HPLC, desconecte a tubulação da coluna dos detectores e coloque a extremidade da linha em um recipiente para coletar o fluxo da coluna. Em seguida, transfira a linha tampão A para a amostra diluída, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa no tubo. Inicie as bombas para puxar a amostra para a coluna.Quando o recipiente de amostra estiver quase vazio, pare as bombas e coloque a garrafa de buffer A de volta na linha. Inicie as bombas e passe o buffer A pela coluna para dois volumes de coluna, depois pare as bombas e reconecte a coluna aos detectores. Usando o novo método passo a passo, configure uma única execução de HPLC sem injeção automática de amostra.Abra o obturador da linha de luz e adquira os dados SAXS e UV Vis. Monitore a intensidade somada ao longo do tempo. Em seguida, use o software de pós-processamento para converter os dados de HPLC para um formato ascii.Usando um gerenciador de dados on-line, identifique os quadros SAXS correspondentes ao pico de eluição da amostra. Verifique se o raio de giyração é estável em todo o pico. Importe os quadros de pico para um programa de processamento de dados SAXS e crie uma curva de dispersão média não corrigida.Para SCC SAXS, confirme se a região Q alta do buffer médio, não apenas a curva de espalhamento não corrigida. Carregue e dimensione os quadros auto-subtraídos do pico e verifique se não há diferenças sistemáticas. Calcule a média de todas as curvas para obter a curva SAXS final.Para IEC SAXS, média de 50 quadros de cada etapa de gradiente. Compare essas médias com a curva não corrigida e selecione a etapa de gradiente com a melhor correspondência de Q alto. Subtraia a média escolhida da curva não corrigida para criar a curva SAXS final.Finalmente, determine a distribuição da distância do par e execute a modelagem ab initio para determinar o modelo mais representativo da proteína. Os parâmetros de dados estruturais obtidos de SEC e IEC SAXS da proteína D5 foram muito semelhantes. As estimativas de massa molecular estavam de acordo com a massa prevista.A modelagem ab initio foi realizada sem simetria imposta e com simetria C6. Ambos os modelos são compatíveis com os dados do experimento, indicando que a estrutura da proteína possui simetria C6. A modelagem molecular produz uma estrutura semelhante a uma pirâmide hexogonal com um canal central parcialmente obstruído.Os modelos SEC e IEC médios foram muito semelhantes. Ao examinar modelos individuais, descobriu-se que as obstruções do canal provavelmente eram um artefato do processo de média. O SAXS está se tornando razoavelmente mais padrão, mas para muitas etapas de purificação e outras cromatografias de troca iônica são necessárias para se livrar de agregados ou contaminantes.Neste protocolo apresentamos ambas as técnicas, cromatografia de exclusão de tamanho on-line e cromatografia de troca iônica on-line em uma linha de luz bio SAXS. Uma ressalva de ambas as técnicas é que a concentração precisa da proteína não é conhecida, portanto, não podemos determinar o espalhamento de massa molecular. No entanto, para proteínas globulares, ainda podemos estimar o volume de massa.Um gradiente linear pode ser aplicado em vez do gradiente passo a passo que usamos aqui na cromatografia de troca iônica, embora isso exija uma otimização da condição do tampão para uma separação ideal dos picos. Essas técnicas nos permitem coletar dados SAXS de boa qualidade, mesmo em sistemas complicados.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Cromatografia de troca catiônica: uma técnica para isolar a proteína recombinante alvo do lisado de células de insetos com base na carga superficial líquida

Este vídeo descreve o SEC-MALS, que aproveita as habilidades da cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e do espalhamento de luz multiangular (MALS). No SEC-MALS, o SEC separa proteínas ou complexos de proteínas com base em seu tamanho, e o detector MALS determina o peso molecular médio medindo a intensidade da luz espalhada pela molécula em diferentes ângulos.

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