Name: Anticancer eficácia da terapia fotodinâmica com Nanopartículas Lung Cancer segmentadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a aumentar o efeito terapêutico da terapia fotodinâmica em câncer de pulmão usando nanopartículas direcionadas com fotossensibilizador e drogas anticâncer. Este método avalia a eficácia in vitro e in vivo.

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Este estudo foi apoiado por nenhuma subvenção. 14-2014-017 do Fundo de Investigação SNUBH. Os autores agradecem a J. Patrick Barron, professor emérito da Universidade de Tóquio Médico e Professor Adjunto, Seoul National Bundang Hospital Universitário para a sua edição pro bono deste manuscrito.

NOTA: Todos os protocolos de estudo com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Seul Bundang National University Hospital (BA1308-134 / 072-01). 1. Síntese de ácido hialurônico-ceramida (HACE) <ol><li> Solubiliza-se 12,21 mmol de ácido hialurónico (HA) de oligómero e 9,77 mmol de tetra-n-butilamónio hidróxido (TBA) em 60 ml de água duplamente destilada (ADD). Agita-se durante 30 min. </li><li> Para sintetizar o ligante DS-Y30, dissolve-se 8,59 mmol de ceramida DS-Y30 e 9,45 mmol de trietilamina em 25 ml de tetra-hidrofurano (THF). Misturar com 8,59 mmol de cloreto de 4-clorometilbenzoilo em THF. Agita-se durante 6 h a 60 ° C. </li><li> Dissolve-se a 8,10 mmol sintetizado de HA-TBA e 0,41 mmol de ligante DS-Y30 em uma mistura de THF e acetonitrilo (4: 1, v / v). Agita-se durante 5 h a 40 ° C. </li><li> Remover as impurezas por filtração com um filtro de agente, e eliminar o solvente orgânico por evaporação sob vácuo. Purifica-se o produto usando uma membrana de diálise (peso molecular de corte: 3,5 kDa) e liofilizar. </li></ol> 2. Preparação das nanopartículas <ol><li> Dissolve-se 1 mg de HB e 1 mg de paclitaxel em 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) e misturam-se com 0,5 ml de DDW por vortex para mistura durante 5 min. Em seguida, solubilizar HACE nessa mistura por vórtice de mistura durante mais 5 min. </li><li> Para eliminar o solvente, aquece-se a 70 ° C durante 4 horas sob uma corrente suave de azoto gasoso. </li><li> Ressuspender o filme composto por HACE, HB, e paclitaxel com 1 ml de DDW. Filtrar com um filtro de seringa (0,45 um de tamanho de poro) para remover droga não encapsulados. </li></ol> 3. A fototoxicidade in vitro <ol><li> A absorção de nanopartículas em linhas de células de câncer de pulmão <ol><li> Prepare (v / v) de soro de meio RPMI-1640 a 10% contendo meio de bovino fetal e 1% (w / v) de penicilina-estreptomicina. </li><li> Semente células A549 em placas de cultura celular de 24 poços a uma densidade de 1 x 10 5 células / poço (triplicados para cadagrupo). Incubar durante 24 horas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 e 95% de ar. </li><li> Após a fixação das células, remover o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Dissolve-se as nanopartículas em PBS para uma concentração final de 2 jiM / ml HB. Em seguida, incubar as células com 1 ml de PBS, o NPS vazios, HB-NPs, ou HB-P-NPs em cada poço durante 4 horas no escuro. </li><li> Remove toda a solução e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Adicionar meio de cultura fresco. </li></ol></li><li> ensaio de viabilidade celular <ol><li> Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Usar óculos de segurança do laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm2), no escuro durante vários períodos de tempo: 0, 5, 10, 20, 30, e 40 seg (0, 2, 4 , 8, 12, e 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro. </li><li>Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 10 ul de solução de medição da citotoxicidade de cada poço. Incubar no escuro durante 2 horas. </li><li> Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. </li></ol></li><li> A análise microscópica <ol><li> Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Use óculos de segurança a laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) no escuro, durante 0, 20 ou 40 segundos (0, 8, ou 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro. </li><li> Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Adicionar 50? L de anexina V-FITC e 50 ul de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1,5 ug / ml). Agitar suavemente a placa e incubar-lo por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. NOTA: Use anexina V-FITC a partir do kit de microscópio de fluorescência. </li><li> Lavam-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Manter as células em PBS fresco. Identificar as células em apoptose utilizando um microscópio óptico com ampliação de 100X. </li></ol></li><li> separação de células activadas por fluorescência (FACS) <ol><li> Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Use óculos de segurança a laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) para 0, 20 ou 40 segundos (0, 8, ou 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro. </li><li> Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de 1 × tampão de ligação (diluído 1 parte de tampão de ligação 10x; 0,1 M de Hepes / NaOH (pH 7,4), NaCl 1,4 M, e 25 mM de CaCl 2 a 9 partes de água destilada) e transferência de 100 uL da solução de amostra para a 5 mltubo de cultura. </li><li> Adicionar 5 uL de anexina V-FITC e 5 ul de iodeto de propídio (PI). Suavemente vortex do tubo e incubar durante 15 min à temperatura ambiente (TA) no escuro. Adicionar 400 mL de 1 × tampão de ligação. NOTA: Use anexina V-FITC e PI a partir do kit microscópio de fluorescência. </li><li> Identificar as células apoptóticas por SCAF usando 14. As linhas de laser de excitação PI e anexina V-FITC são 488 nm e 635 nm, respectivamente. Medir a emissão de fluorescência de PI e anexina V-FITC a 610 ± 20 nm e 660 ± 20 nm, respectivamente. Recolher as células adquiridas no citômetro de fluxo por 10.000 eventos. </li></ol></li></ol> 4. eficácia anticancerígena in vivo In em ratos portadores de tumores <ol><li> modelo do rato induzida por câncer de pulmão <ol><li> Prepare 1 × 10 6 células A549 em 0,1 ml de meio RPMI-1640; mantê-lo em gelo. </li><li> Anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências. </li><li> Injectar as células subcutaneamente nos flancos de ratinhos BALB restantes ratinhos nu / C macho (6 - 7 semanas de idade, 20-22 g). </li><li> Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola. NOTA: Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente. Mantenha os ratos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos (SPF). </li><li> Medir o tamanho do tumor com compassos de calibre de cada dia. Calcular o volume do tumor (mm 3) como (comprimento x largura 2) / 2. Quando o tamanho do tumor atingir cerca de 200 mm 3 em volume, a iniciar a experiência. </li&gt; </ol></li><li> estudo de eficácia Anticancer <ol><li> Aleatoriamente dividir os ratos em 4 grupos (n = 10 para cada grupo). </li><li> Anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências. </li><li> Dissolve-se as nanopartículas em PBS para uma concentração final de 2 mg / ml HB. Injectar PBS, livre HB, HB-NPs, ou HB-P-PN através da veia caudal (2 mg / kg como HB) duas vezes nos dias 0 e 7. </li><li> Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola. NOTA: Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmenterecuperado. Mantenha as gaiolas escuro e em condições SPF específicos. </li><li> 24 h após cada injecção, anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências. </li><li> Colocar o sítio do tumor sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra de PDT para o tumor). Use óculos de segurança laser, desligar o interruptor, e iluminar o tumor com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) para 500 segundos (200 J / cm 2) duas vezes nos dias 1 e 8. </li><li> Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que tem undergone cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. </li><li> Mantenha as gaiolas em condições SPF. Manter as gaiolas no escuro durante 24 horas após o tratamento a laser. </li><li> Monitorizar visualmente o volume do tumor e as alterações no local do tumor a cada dia. Medir o tamanho do tumor com compassos de calibre, e calcular o volume como (comprimento x largura 2) / 2 (mm 3). Tirar fotos dos locais de tumor todos os dias para verificar se há alterações de superfície do tumor após PDT. </li><li> No dia 16, sacrifica cinco ratinhos por grupo por anestesia terminal usando isoflurano. </li><li> Com uma pinça e tesouras, corte a pele exterior e expor os tumores 15. Cuidadosamente colhê-las. Corrigi-los em formol 10%, incorporá-los em parafina e manchá-las com hematoxilina e eosina (H &amp; E) para a análise histológica 16. </li><li> Após 45 dias de monitoramento, sacrificar os ratinhos restantes pela anestesia terminal usando isoflurano. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O passo mais crítico neste estudo é selecionar as condições de laser adequados: comprimento de onda, poder e tempo de irradiação. O comprimento de onda de luz apropriado adequado para o fotossensibilizador específico é necessário para o PDT. Nós usamos um laser de 630 nm, que era apropriado para hipocrelina B. A potência de saída foi outro fator importante, que foi fixado em 400 mW / cm 2 com base em vários estudos-piloto. Potências de saída superior a 400 mW / cm 2 danificado as células ou a super...

A terapia fotodinâmica (PDT) é composta por três fatores principais: fotossensibilizadores, luz e oxigênio. A TFD é relatada como um tratamento promissor para vários tipos de câncer3. Quando os fotossensibilizadores são administrados ao paciente com câncer, eles se acumulam seletivamente nos tecidos tumorais. Quando o comprimento de onda adequado da luz é aplicado, o oxigênio singlete altamente reativo e outros radicais livres levam a danos às células tumorais4. 
O câncer de pulmão foi introduzido como uma das primeiras aplicações para PDT no início dos anos 19805. A PDT oferece várias vantagens no tratamento do câncer de pulmão. Como a TFD é um tratamento não invasivo e não cirúrgico, é uma escolha alternativa atraente para os pacientes nos quais a ressecção cirúrgica é inadequada.
Tem havido muitos desafios para aumentar a eficácia dos fotossensibilizadores no combate ao câncer. Aumentar o acúmulo de fotossensibilizadores em locais de câncer e diminuir o acúmulo em tecidos normais são os objetivos idênticos para os estudos direcionados ao câncer. Uma variedade de sistemas de liberação de fármacos direcionados, como polímeros, lipossomas e nanopartículas, são adotados como portadores fotossensibilizadores6-8. Em nossos estudos anteriores, as nanopartículas aumentaram efetivamente as habilidades de direcionamento do câncer dos fotossensibilizadores9,10. As nanopartículas são portadoras ideais para o câncer, pois possuem habilidades passivas e ativas de direcionamento. Os vasos tumorais com vazamento oferecem oportunidade para que os transportadores nanométricos se acumulem facilmente nos tumores, o que é conhecido como efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR)11,12. A interação entre as nanopartículas e os receptores específicos nas células cancerígenas permite o direcionamento ativo do câncer. Neste estudo, preparamos nanopartículas à base de ácido hialurônico para interagir com CD44, o principal receptor de ácido hialurônico que é superexpresso em células de câncer de pulmão13. 
Para maximizar a eficácia anticancerígena, uma combinação de TFD e quimioterapia é adotada no presente estudo. Este conceito de combinação pode permitir um efeito terapêutico aumentado. Além disso, doses reduzidas do fotossensibilizador e do medicamento anticâncer podem diminuir os efeitos adversos. Selecionamos a hipocrelina B (HB) como um novo fotossensibilizador no presente estudo. HB é isolado do fungo medicinal chinês Hypocrella bambuase. Shang et al. relataram que a TFD baseada em HB possui uma eficácia anticancerígena maior quando comparada àTFD 1 baseada em derivados de hematoporfirina. O paclitaxel foi selecionado como medicamento anticâncer, pois provou ser um tratamento potencial para vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão2. 
Aqui, comparamos as eficácias anticancerígenas da solução fotossensibilizadora (hipocrelina B, HB), nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida encapsuladas em fotossensibilizador (HB-NPs) e nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida encapsuladas em agente fotossensibilizador e anticâncer (paclitaxel) (HB-P-NPs) após PDT. A fototoxicidade in vitro em células A549 (adenocarcinoma de pulmão humano) e a eficácia antitumoral in vivo em camundongos portadores de tumor A549 foram avaliadas.

<table><tbody><tr><td>ácido hialurônico oligo</td><td>Bioland Co., Ltd.</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>DS-Y30 (ceramida 3B; principalmente N-oleoil-fitoesfingosina)</td><td>Doosan Biotech Co., Ltd.</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>ácido adípico di-hidrazida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0638</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-dimetilaminopropil)-N&prime; -etilcarbodiimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de 4-(clorometil) benzoíla</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270784</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td>Filtro de seringa <td>T0546</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>17762</td><td>15 mm, RC, PP, 0,45 &micro; m</td></tr><tr><td>trietilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Mini-GeBAflex tubos</td><td>Gene Bio-Application Ltd.</td><td>D070-12-100</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Taihua Corporations</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; estreptomicina</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>16140071</tr><tr><td>Celite (agente filtrante)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6858</td><td>Veja a etapa 1.4</td></tr></tbody></table>

anticancer eficácia da terapia fotodinâmica com nanopartículas lung cancer segmentadas

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

A terapia fotodinâmica (PDT) é um método não invasivo e não cirúrgico que representa uma escolha alternativa atraente para o tratamento do câncer de pulmão. Os fotossensibilizadores se acumulam seletivamente no tecido tumoral e levam à morte das células tumorais na presença de oxigênio e no comprimento de onda adequado da luz.
Para aumentar o efeito terapêutico da PDT, desenvolvemos nanopartículas direcionadas ao câncer de pulmão carregadas com agentes fotossensibilizadores e anticâncer. Foram aplicados tanto o direcionamento passivo baseado em efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR) quanto o direcionamento ativo baseado em interação com ácido hialurônico-CD44. O CD44 é um receptor de ácido hialurônico bem conhecido que é frequentemente introduzido como um biomarcador de câncer de pulmão de células não pequenas. 
Além disso, uma combinação de TFD e quimioterapia é adotada no presente estudo. Este conceito de combinação pode aumentar os efeitos terapêuticos anticancerígenos e reduzir as reações adversas. 
Escolhemos a hipocrelina B (HB) como um novo fotossensibilizador neste estudo. Foi relatado que o HB causa maior eficácia anticancerígena da PDT em comparação com os derivados da hematoporfirina1. O paclitaxel foi selecionado como medicamento anticâncer, pois provou ser um tratamento potencial para o câncer de pulmão2. 
As eficácias antitumorais da solução fotossensibilizadora (HB), nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida encapsuladas com fotossensibilizador (HB-NPs) e nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida encapsuladas com agente fotossensibilizador e anticâncer (paclitaxel) (HB-P-NPs) após PDT foram comparadas in vitro e in vivo. A fototoxicidade in vitro em células A549 (adenocarcinoma de pulmão humano) e a eficácia antitumoral in vivo em camundongos portadores de tumor A549 foram avaliadas.
O grupo de tratamento com HB-P-NP mostrou o efeito anticancerígeno mais eficaz após a PDT. Em conclusão, os HB-P-NPs preparados no presente estudo representam um potencial e novo sistema de liberação de fotossensibilizadores no tratamento do câncer de pulmão com PDT.

Nós preparamos tanto HB-NPs e HB-P-NPs com as técnicas acima mencionadas. Os diâmetros médios de HB-NPs e HB-P-NPs foram 220,9 ± 3,2 nm e 211,9 ± 1,6 nm, respectivamente. A viabilidade celular das células A549 após 4 h de incubação com PBS, o NPS vazios, HB-PN, e HB-P-NPs seguido por irradiação de luz (0-16 J / cm 2) é mostrada na Figura 1. Sem luz, o grupo de tratamento HB-NP mostrou nenhuma citoto...

A terapia fotodinâmica (PDT) é uma escolha alternativa para o tratamento do câncer de pulmão. Para aumentar o efeito terapêutico da PDT, foram desenvolvidas nanopartículas direcionadas ao câncer de pulmão combinadas com quimioterapia. Foram avaliadas as eficácias anticancerígenas in vitro e in vivo da TFD com nanopartículas preparadas.

Anticancer eficácia da terapia fotodinâmica com Nanopartículas Lung Cancer segmentadas

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

O objetivo geral deste experimento é aumentar o efeito terapêutico da terapia fotodinâmica no tratamento do câncer de pulmão utilizando nanopartículas direcionadas ao câncer de pulmão carregadas com fotossensibilizador e fármaco anticâncer. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da terapia fotodinâmica, como quais são as condições adequadas dos agentes para estudos in vitro e in vivo. Como as terapias fotodinâmicas são amplamente utilizadas nas áreas de oncologia, estudos pré-clínicos com fotossensibilizadores convencionais ou novas indicações podem ser realizados com esta técnica.As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento de diversas doenças, como tuberculose, úlceras e áreas da dermatologia, utilizando diferentes módulos anuais. Para começar, sintetize o ceramida de ácido hialurônico conforme descrito no protocolo textual complementar. Purifique o produto utilizando uma membrana de diálise de 3,5 kilodaltons e liofilize-o.Em seguida, prepare nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida por si só. As nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida juntamente com um fotossensibilizador e as nanopartículas de ácido hialurônico-ceramida com um agente antineoplásico e o fotossensibilizador. Semee a linhagem celular de câncer de pulmão, A549, nos poços de uma placa de cultura celular de 24 poços numa densidade de um vezes 10 elevado à quinta células por poço e incube as células por 24 horas.No dia seguinte, remova o meio e lave as células com um mililitro de PBS. Em seguida, dissolva as nanopartículas preparadas em PBS até uma concentração final de dois micromoles por mililitro do fotossensibilizador Hipocrellin B por vortexagem. Adicione a quatro poços cada: um mililitro de PBS, um mililitro das nanopartículas vazias de ácido hialurônico-ceramida, um mililitro das nanopartículas contendo o fotossensibilizador e um mililitro das nanopartículas contendo tanto o fotossensibilizador quanto o fármaco anticâncer.Quando terminar, cubra a placa e incube-a a 37 graus Celsius por quatro horas no escuro para permitir a captação de nanopartículas pelas células. Em seguida, remova todo o meio e lave as células adicionando um mililitro de PBS frio. Repita o passo de lavagem mais uma vez e, então, adicione meio de cultura fresco.Em seguida, posicione a placa de cultivo de 24 poços sob uma fibra de terapia fotodinâmica e coloque a fibra a um centímetro do primeiro poço. A distância entre a fibra de terapia fotodinâmica e as células foi o fator crítico neste estudo. Foi importante determinar a distância ideal capaz de cobrir completamente a camada celular com a luz.Em seguida, coloque óculos de segurança e apague as luzes. Ilumine as células com o laser no escuro por entre cinco e 40 segundos para ativar o oxigênio singlete altamente reativo e outros radicais livres nas nanopartículas contendo o fotossensibilizador. Após a exposição à luz, incube as células no escuro por 24 horas.Em seguida, aspire o meio de cultura e lave as células com um mililitro de PBS frio. Repita a etapa de lavagem mais uma vez e, então, adicione 100 microlitros de meio e 10 microlitros de solução para medição de citotoxicidade a cada poço. Incube as células na solução por duas horas no escuro e, em seguida, transfira todas as amostras para uma placa de 96 poços.Meça a absorbância em 450 nanômetros utilizando um leitor de microplacas. Colete as células A549 e re-suspenda um milhão de células em 0,1 mililitros de meio RPMI-1640. Coloque as células re-suspensas no gelo.Em seguida, prepare um camundongo macho nu da linhagem BALB/C para injeção. Então, carregue as células em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 26 graus e injete-as no flanco esquerdo do camundongo. Meça o tamanho do tumor com paquímetro diariamente.Quando o tamanho do tumor atingir aproximadamente 200 milímetros cúbicos em volume, inicie o experimento pesando primeiramente cada camundongo. Em seguida, dissolva as nanopartículas em PBS para uma concentração final de dois miligramas por mililitro e carregue um microlitro da suspensão por grama de camundongo em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 26 graus. Injete as nanopartículas por injeção na veia da cauda no dia zero e no dia sete.24 horas após cada injeção, anestesie o camundongo e posicione o local do tumor sob a fibra de terapia fotodinâmica, de modo que fique a um centímetro da fibra. É importante cobrir toda a superfície do tumor com a luz para obter os melhores resultados. Coloque os óculos de segurança para laser, desligue o interruptor da sala e ilumine o tumor com um laser de terapia fotodinâmica durante 500 segundos tanto no primeiro quanto no oitavo dia.Após o tratamento a laser, mantenha os camundongos em suas gaiolas no escuro por 24 horas. Monitore diariamente o volume do tumor e as alterações no local do tumor por meio de exame visual. Utilize paquímetros para medir o tamanho do tumor e tire fotografias dos locais dos tumores diariamente para verificar alterações na superfície.A viabilidade das células de câncer de pulmão é mostrada aqui após quatro horas de incubação com as nanopartículas seguida de irradiação com luz. Na ausência de luz, as células expostas às nanopartículas contendo apenas o fotossensibilizador não apresentaram qualquer sinal de toxicidade, enquanto as células expostas às nanopartículas contendo tanto o fotossensibilizador quanto o paclitaxel apresentaram cerca de 81% de viabilidade celular. Com o aumento do tempo de irradiação, a viabilidade celular diminuiu em ambos os grupos tratados com o fotossensibilizador.O grupo de tratamento que também continha paclitaxel apresentou a maior quantidade de fototoxicidade. Isso também foi refletido no estudo com modelo tumoral, uma vez que o volume tumoral em camundongos tratados com esses dois grupos de tratamento foi menor do que nos controles. Além disso, o grupo tratado com nanopartículas contendo paclitaxel e fotossensibilizador foi significativamente menor do que todos os outros grupos.Embora o tamanho do tumor fosse significativamente menor, os camundongos tratados com nanopartículas contendo tanto o fotossensibilizador quanto o paclitaxel apresentaram hemorragia grave e o desenvolvimento mais rápido de necrose. Após o desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o uso de laser no campo da terapia fotodinâmica, possibilitando a exploração do tratamento do câncer em sistemas in vitro e in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar a terapia fotodinâmica em sistemas in vitro e in vivo.

anticancer-efficacy-photodynamic-therapy-with-lung-cancer-targeted

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A terapia fotodinâmica (PDT) é um método não invasivo e não cirúrgico para o tratamento do câncer de pulmão. Os fotossensibilizadores se acumulam seletivamente no tecido tumoral e levam à morte das células tumorais na presença de oxigênio e no comprimento de onda adequado da luz. Neste vídeo de protocolo, o método baseado em PDT é usado para avaliar o potencial fototóxico de um potencial fotossensibilizador em células de câncer de pulmão.

Ensaio de fototoxicidade in vitro: um método baseado em PDT para avaliar o potencial fototóxico de um fotossensibilizador em células de câncer de pulmão

A terapia fotodinâmica (PDT) é um método não invasivo e não cirúrgico para o tratamento do câncer de pulmão. Os fotossensibilizadores se acumulam seletivamente no tecido tumoral e levam à morte das células tumorais na presença de oxigênio e no comprimento de onda adequado da luz. Este vídeo descreve a análise de eficácia antitumoral in vivo usando fotossensibilizador contendo nanopartículas em um camundongo portador de tumor, para determinar o potencial fototóxico do fotossensibilizador.

Análise de eficácia antitumoral in vivo da PDT: uma técnica para determinar o potencial fototóxico de um fotossensibilizador em camundongos portadores de tumor

Este vídeo demonstra uma técnica de fotoimunoterapia de infravermelho próximo para tratar o câncer de pulmão em um modelo de camundongo projetado exibindo células tumorais que expressam luciferase. Ao injetar um conjugado anticorpo-fotossensibilizador (APC) que se liga a antígenos específicos nas células tumorais, o camundongo é exposto à radiação infravermelha próxima, induzindo alterações fotoquímicas no APC e levando à morte necrótica das células tumorais ligadas. A eficácia do tratamento é...

Uma técnica de fotoimunoterapia no infravermelho próximo para tratar o câncer de pulmão em um modelo murino

O protocolo relatado aqui permite a avaliação da eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) em linhas de células e a optimização das condições de PDT, antes de aplicar a terapia em modelos animais.

Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células<em&gt; In Vitro</em

Este protocolo descreve um método para a fabricação de nanopartículas poliméricas condutoras misturadas com fulereno. Essas nanopartículas foram investigadas quanto ao seu potencial uso como fotossensibilizadores de próxima geração para Terapia Fotodinâmica (PDT).

Terapia Fotodinâmica com Blended polímero condutor / Fullerene Nanoparticle Fotossensibilizadores

A fotoimunoterapia quase infravermelha (NIR-PIT) é uma estratégia terapêutica emergente do câncer que utiliza um conjugado de anticorpos fotoabsorto (IR700Dye) e luz NIR para destruir células cancerosas. Aqui, apresentamos um método para avaliar o efeito antitumoral do NIR-PIT em um modelo de camundongo de câncer de pulmão disseminado pleural e mesotelioma pleural maligno usando bioluminescência por imagem.

Fotoimunoterapia infravermelha próxima para modelos de mouse de disseminação pleural

Aqui, descrevemos um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar com sucesso ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD) usando cultura de células HeLa bidimensionais e verteporfina como fotossensibilizador.

Um dispositivo de terapia fotodinâmica interno construído internamente e baseado em diodo emissor de luz para melhorar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D

Este manuscrito apresenta um novo e inovador dispositivo de iluminação impresso em 3D para estudar a terapia fotodinâmica mediada por Rosa Bengala in vitro.

Desenvolvimento de um Dispositivo Inovador de Iluminação Baseado em LED para Aplicação In Vitro de Terapia Fotodinâmica com Rosa Bengala

Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para terapia hipertérmica direcionada em modelos de tumores sólidos. A abordagem aproveita a conversão fototérmica da luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro injetados intratumoralmente para induzir o aquecimento localizado dentro do microambiente tumoral.

Induzindo hipertermia leve direcionada em modelos de tumores murinos por meio da conversão fototérmica de luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro intratumorais

Um procedimento para implantar células cancerígenas pancreáticas que expressam proteínas fluorescentes verdes (PANC-1 GFP) ortotopicamente no pâncreas de camundongos Balb-c Ola Hsd-Fox1nu para avaliar a progressão e metástase do tumor é apresentado aqui.

Fluorescente modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas

Aprenda a aumentar o efeito terapêutico da terapia fotodinâmica em câncer de pulmão usando nanopartículas direcionadas com fotossensibilizador e drogas anticâncer. Este método avalia a eficácia in vitro e in vivo.

Anticancer eficácia da terapia fotodinâmica com Nanopartículas Lung Cancer segmentadas

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