Name: Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Aprenda a técnica de congelamento plunge para preservação ultraestrutural de células em suspensão em microscopia eletrônica de transmissão. Este método de baixo custo imobiliza células rapidamente, limita cristais de gelo e estabiliza estruturas celulares para estudos de imunolocalização.

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Nós expressamos nossa gratidão a M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, e A. Devin por sua ajuda e comentários sobre o manuscrito. Somos gratos ao pólo imagens eletrônicas de Bordeaux Imaging Center, onde as imagens foram tiradas. Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de la Recherche Scientifique.

1. Preparação de Formvar Grade Film NOTA: Executar manipulação clorofórmio sob uma coifa utilizando equipamento de protecção individual (luvas, bata de laboratório, copos). Use 400 mesh grelhas de cobre de microscopia electrónica. Com outros tipos de grade (outros tamanhos de malha, ouro e grades níquel), a qualidade do congelamento é pior. <ol><li> Prepara-se uma solução de 100 mL de 0,3% formvar em clorofórmio. Permita que ele se dissolver durante a noite sem agitação. </li><li> Coloque 400 malhas (série de furos por polegada quadrada) grelhas microscopycopper electrões (diâmetro 3,05 mm) em um frasco de vidro (altura de 3 cm e 2 cm de diâmetro) contendo acetona. Agita-se o frasco de vidro com um movimento circular da mão. Remover a acetona, com uma pipeta de transferência de plástico. Permitir que o solvente evapora-se durante 5 min. Transferir as grades ao derramá-las para um papel de filtro e permitir-lhes secar durante 5 min. </li><li> Polir uma lâmina de vidro 76 x 26 mm2 esfregando-o com um pano que não solte fiapos até brilhante / escorregadio.</li><li> Tomar um cristalizador (diâmetro 15 cm, altura: 7 cm e capacidade de 1200 mL) e preenchê-lo até a borda com água destilada. Limpar a superfície da água por passagem de uma barra de vidro sobre a superfície de duas vezes para remover o pó. </li><li> Segure a lâmina de vidro entre dois dedos e mergulhá-lo na solução formvar por alguns segundos. Segurá-la na posição vertical para secar sob uma proveta de cabeça para baixo durante 5 min. </li><li> Quando a película é seca, marcar as extremidades da lâmina de vidro com uma lâmina de barbear afiada para definir os limites da película a ser deslocado a partir do slide. </li><li> Respire fundo e expire fortemente sobre a lâmina para obter uma camada de vapor de água sobre e sob o filme para tornar o filme um pouco opaco e aumentar a sua visibilidade. <ol><li> flutuar imediatamente a película sobre a superfície da água do cristalizador por tocar o fundo da lâmina com um ângulo de cerca de 30 °. Deixe o filme de libertação a partir do slide e retire-a sobre a superfície da água cristalizador. Com cuidado, puxe o filme fora com opinças, se necessário. </li></ol></li><li> Cuidadosamente, coloque as grelhas de face voltada para baixo sobre a película que flutua na superfície da água nas regiões que são de espessura adequada (cerca de 10 nm) e sem rugas. </li><li> Escolher-se a película, cobrindo as grelhas com papel Joseph enquanto flutuam sobre a superfície da água cristalizador. <ol><li> Segurando o papel Joseph com uma mão, toque em uma das extremidades do papel Joseph a uma extremidade do filme. Espere até que o papel Joseph é completamente molhado. Retire o papel Joseph com as grades preso por diante. </li></ol></li><li> Coloque as grades durante 24 horas, em uma placa de Petri coberta para a secagem e armazenamento antes da sua utilização, à temperatura ambiente final. </li></ol> 2. Preparação de Meio Freeze-substituição NOTA: tetróxido de ósmio (OsO4) e acetato de uranilo são produtos químicos perigosos. Segurá-los no exaustor enquanto vestindo equipamento adequado de protecção individual (EPI), incluindo um jaleco e luvas. Follow os avisos de segurança para a manipulação (OsO 4) e acetato de uranilo. Use criotubos de O-ring, para evitar a fuga de OsO4. <ol><li> estudos ultra-estruturais <ol><li> Coloque vidro OsO4 ampola, num frasco de vidro. </li><li> Quebrar a ampola por agitação do balão. </li><li> Adicionar um volume apropriado de acetona 100% para obter uma concentração final de 4%. </li><li> Agita-se e dispensar 1,5 mL de alíquotas em criotubos de 1,8 ml. </li></ol></li><li> imunomarcação de proteínas <ol><li> Coloque 0,05 g de acetato de uranilo em um frasco de vidro. </li><li> Adicionar 50 ml de 100% de acetona. </li><li> Agita-se a solução com um agitador magnético. Quando a solução se torna claro, filtrá-lo utilizando um filtro de 0,2? M. </li><li> Dispensar 1,5 mL de alíquotas em criotubos de 1,8 ml. NOTA: Prepare os criotubos contendo meio de congelamento e de substituição antes de o processo de congelação de imersão e mantê-los em -84 ° C congelador. Inverter o frasco de vidro para jogar fora oOsO4 ampola na resíduos perigosos. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de células NOTA: Esta etapa é fundamental para o sucesso do método. Para todos os tipos de células, as células crescem para obter o número indicado de células. Centrífuga no tubo indicado no tempo e velocidade especificada. <ol><li> Para se obter a consistência adequada dos peletes a partir de diferentes tipos de células, crescimento de células como se segue: <ol><li> Para Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe, inocular levedura em 5 ml de meio líquido mínimo ou completa. Incubar durante a noite a 28 ° C, rotação (180 rpm). Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) da cultura durante a noite. Dilui-se células de levedura para um OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 28 ° C, rotação, para se obter 1 x 10 9 culas de levedura 7. </li><li> Para Leishmania flagelo, inoculate parasitas em meio 5 mL de AM com 7,5% de FCS (soro fetal de vitelo). Incubar durante a noite a 24 ° C, rotação (180 rpm). Medir a OD 600 da cultura durante a noite. Dilui-se as células de parasitas para uma OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 24 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 8 culas parasita 12. </li><li> Para Trypanosoma brucei, inocular parasitas em 5 ml de meio SDM-79 com 10% de FCS e 30? G / ml de higromicina. Incubar durante a noite a 27 ° C, rotação (180 rpm). Medir a OD 600 da cultura durante a noite. Dilui-se as células de parasitas para uma OD600 de 0,2 em 50 mL de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 27 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 8 culas parasita 13. </li><li> Para a Escherichia coli, as bactérias em inocular 5 ml de meio DYT com 100 ug / mL de ampicilina. Incubar durante a noite a 37 ° C, rotação (180rpm). Medir a OD 600 da cultura durante a noite. Dilui-se células de bactérias a uma OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 37 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 10 culas 14 bacterianas. NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as culas em cultura podem ser em qualquer fase de crescimento logarítmica ou estacionária. De crescimento muito lento estirpes celulares podem exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente. </li></ol></li><li> Para todos os tipos de células, a transferência do meio de cultura contendo as células para 50 ml de tubo de polipropileno e centrifuga-se durante 3 min a 1500 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de todos os tipos de células em 1 ml de meio de cultura celular relevante. </li><li> Centrifugar todos os tipos de células em um tubo de microcentrífuga durante 1 min a 3900 x g. Completamente remover o sobrenadante. </li><li> Manter as células no gelo. </li></ol> Nota: Pega de azoto líquido com cuidado. Use equipamento de protecção individual, incluindo cryogloves e googles. O propano é potencialmente explosivo, de modo realizar a liquefacção em um espaço bem ventilado ou sob um exaustor de fumos. Não há chamas são permitidos. <ol><li> Colocar aproximadamente 150 ml de azoto líquido num tabuleiro de poliestireno. Colocar um copo de bronze (altura 3,6 cm, diâmetro de 2 cm e uma espessura de 1,5 mm) em azoto líquido para congelar. Não deixe que o nitrogênio líquido penetrar no copo de bronze. </li><li> Espere até que as bolhas desaparecem ter certeza de que a taça de bronze está congelado. </li><li> Coloque a mangueira ligada ao cilindro de gás em contacto com a parede da taça de latão. </li><li> Suavemente abrir a válvula de cilindro de gás propano. NOTA: Nesta etapa, o propano liquefaz no copo de bronze. </li><li> Pare a liquefacção fechando a válvula de cilindro de gás propano e rapidamente removendo a mangueira de gás. </li><li> Encher o tabuleiro de poliestireno com líquido nitrogen até 5 mm do topo da taça de latão. Não deixe que o nitrogênio líquido penetrar no copo de bronze. </li></ol> 5. Imersão de congelação da amostra <ol><li> Colocar aproximadamente 200 ml de azoto líquido no tabuleiro de poliestireno. Congelar pequenos copos de latão (altura de 1,5 cm de diâmetro de 2,5 cm e espessura de 1 mm), colocando-os em azoto líquido. Colocar um copo para uma amostra de células em suspensão. Tenha cuidado para não misturar as amostras. Para este fim, colocar uma amostra no copo 1, a amostra 2, em forma de taça 2, etc. </li><li> Congelar as pinças, mergulhando a sua ponta em azoto líquido. </li><li> Mergulhar uma agulha de dupla extremidade de dissecção no sedimento obtido em 3.5. </li><li> Usando pinças, tomar uma malha de grade 400 microscopia de cobre revestida com Formvar preparada na secção 1. </li><li> Usando a agulha de dissecação, colocar uma gota do sedimento obtido em 3.5 em grelha. Tente diferentes tamanhos de gotas (por exemplo, 2, 5 e 10? L). </li><li> Muito rapidamente mergulhar a grade realizada pelas pinças em propano líquido geneavaliado na seção 4 e agitar a grade com movimento circular por alguns segundos. </li><li> Rapidamente transferir a grade congelada com a pinça para o pequeno copo de bronze congelado na secção 5.1. NOTA: Para cada amostra, fazer pelo menos 3 grades. Sempre congelar as pinças antes de tomar uma grade de cobre. </li></ol> 6. Freeze-substituição NOTA: tetróxido de ósmio é potencialmente volátil, portanto, use um respirador purificador de ar com cartuchos de vapor. Congelamento do fixador em azoto líquido antes de mergulhar de congelação é também uma solução. <ol><li> Para os estudos de ultra-estrutura, abrir os tubos de 1,8 ml criotubo contendo meio de congelamento-substituição preparada na secção 2.1. Para os estudos de imunolocalização, abrir os tubos de 1,8 ml criotubo contendo meio de congelamento-substituição preparada na secção 2.2. Coloque a tampa sobre os criotubos. </li><li> Congelar as pinças, mergulhando a sua ponta em azoto líquido. </li><li> Rapidamente remover a tampa e transferir as grades congeladas into as cryovials usando a pinça. </li><li> Coloque a tampa de volta nas cryovials. </li><li> Repita a operação para cada grade de cada amostra. </li><li> Fechar todas as tampas e agitar os criotubos com um movimento circular da mão para assegurar que as amostras são no meio de congelamento-substituição. </li><li> Colocar os frascos criogénicos numa caixa estanque ao ar, durante 3 dias em um congelador -84 ° C durante o processo de congelação-substituição. </li></ol> Aquecimento 7. Amostra <ol><li> estudos ultra-estrutura <ol><li> Transportar os criotubos em uma bandeja de poliestireno (para evitar um aumento repentino da temperatura) para um congelador de -30 ° C. Colocá-los no congelador -30 ° C durante 1 h. </li><li> Coloque as criotubos em um congelador a -15 ° C durante 2 h. Colocar as amostras a 4 ° C durante 2 h e, em seguida, durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remover o meio de substituição de congelação com uma pipeta de transferência de plástico. Adicionar aproximadamente 500 mL de 100% de acetona. </li><li> Agita-se a 1,8 ml criotubocom um movimento circular da mão e rapidamente despeje a acetona (1,5 ml) contendo as grades em um frasco de vidro (altura de 3 cm e um diâmetro de 2 cm). </li><li> Lavar o mesmo criotubo com 1 ml de 100% de acetona para ter a certeza de ter transferido todas as grades. Agita-se a criotubo com um movimento circular da mão e derramar o conteúdo do criotubo para um frasco de vidro. </li><li> Lavar cada frasco de vidro com 3 mL de 100% de acetona 3 vezes durante 10 min. </li><li> Seguir os procedimentos de incorporação e de inclusão como descrito na referência 15. Impregnar a amostra com concentrações crescentes de resina epoxi em acetona (25%, 50%, e 75%) e incorporar a amostra com resina epóxi de 100% em cápsulas de gelatina. </li></ol></li><li> immunolabeling estudos <ol><li> Transportar os 1,8 criotubos ml num tabuleiro de poliestireno (para evitar um aumento repentino da temperatura) para a -30 ° C congelador. </li><li> Colocar os frascos criogénicos de 2 h, num congelador de -30 ° C. </li><li> Em -30 °<html> C congelador, agita-se o frasco de congelação com um movimento circular da mão e verter rapidamente o meio substituição congelamento num frasco de polipropileno (5 cm de altura e 1,5 cm de diâmetro). </li><li> Substituir o meio de congelamento substituição com 2 ml de meio de congelação-substituição fresco. </li><li> Colocar o frasco de polipropileno durante 2 horas num congelador de -30 ° C. </li><li> Lavar o frasco de polipropileno durante 1 hora com 2 ml de 100% de acetona e três vezes durante 1 h com 2 mL de etanol a 100%. </li><li> Seguir os procedimentos de incorporação e de inclusão como descrito na referência 15. Impregnar a amostra com concentrações crescentes de resina acrílica (25%, 50%, e 75% em acetona) e incorporar a amostra com uma resina acrílica de 100% em cápsulas de gelatina. </li></ol></li></ol> 8. A visualização das Amostras <ol><li> Após a incorporação, fazer 80 nm secções ultra-finas das amostras com um ultramicrotomo. Contrastar as secções com citrato de chumbo a 2% à temperatura ambiente durante 1 minAss = &quot;xref&quot;&gt; 15. </li><li> Use um microscópio eletrônico de 80 kV ou 120 kV para observar as seções 15 . </li></ol>

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Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesse.

TEM é um método poderoso para a observação ultraestrutural de organelos, células e tecidos. Criofixação / congelamento-substituição é actualmente o melhor método para a preservação de ambos ultraestrutura e proteína antigenicidade. Fixadores químicos penetrar e actuar, desse modo permitindo que muito lentamente rearranjos estruturais antes da estabilização completa da ultra-estrutura 2. Por outro lado, a criofixação / congelamento-substituição estabiliza instantaneamente estruturas celulares <sup...

A preparação da amostra é crítico para o sucesso de qualquer estudo de microscopia electrónica. EM convencional de fixação foi o principal método para a fixação de tecidos ou células por microscopia electrónica de transmissão (TEM) 1. Em primeiro lugar, aldeídos e tetróxido de ósmio são usados ​​para fixar o material quimicamente à temperatura ambiente. Em seguida, o material é desidratado com solventes orgânicos, infiltrados e embebidos em resina epoxi. Este método é dependente da taxa de penetração de fixadores para dentro da célula. Por conseguinte, os artefactos e extracção de conteúdos celulares são geralmente observados dois. Criofixação é claramente a melhor alternativa para a preservação de estruturas celulares 3, mantendo-as intactas. A mais alta qualidade de imagens de TEM em 4 secções finas de resina pode ser obtida utilizando o método de substituição criofixação / congelamento. O objectivo desta técnica é a obtenção de bi vitrificadosamostras ological sem formação de cristais de gelo ou contendo cristais de gelo pequenos o suficiente para não danificar a ultra-estrutura das células. congelamento de alta pressão (HPF) e criofixação ultra-rápida, que também é chamado mergulho congelação (PF), são dois métodos para cryofix amostras. HPF imobiliza moléculas na célula instantaneamente e evita o dano causado por fixação EM convencional. Vários tipos de máquinas de congelamento e dispositivos de substituição automática foram desenvolvidos 5. As máquinas de congelamento e de consumo (azoto líquido, espécime transportadoras, etc.) são caros, mas eles permitem a produção de micrografias electrónicas de alta qualidade 6, 7. PF é uma técnica que foi usada no início dos anos 1950 e está descrito na literatura como simples e barato 8 .Durante o procedimento PF, a amostra preparada é congelado a uma taxa rápida para se obter cristais de gelo com tamanho inferior a 3 a 5 nm. Para este fim, a amostra émergulhado num líquido criogénico, tal como etano, propano, ou uma mistura de etano-propano. Desde 1950, as melhorias de PF ter sido feito para tornar esta técnica disponível para um número maior de usuários. Congelamento de alta pressão é actualmente o único meio viável para congelar uma grande variedade de amostras mais espessa do que 50? M (até uma espessura de 200 um para as amostras em forma de disco) 5, enquanto que PF é amplamente utilizado para a imagem objectos pequenos (&lt;100 nm ), tal como complexos macromoleculares em suspensão em um filme fino de gelo amorfo 9. Amostras maiores, por exemplo células eucarióticas, pode ser criofixados por PF, mas requer suportes de amostra, tais como tubos de cobre capilar ou sistemas de sanduíche 8, 10, 11. Aqui, um rápido, fácil de usar e de baixo custo mergulhar tecnologia / congelamento de substituição de congelamento utilizável para várias culturas de células em suspensão é apresentada.

<table><tbody><tr><td>Grids</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>T400-</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>Propano N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Agulha de dissecação de borda dupla</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica</td><td>de tetróxido de ósmio</td> Sciences <td>19130</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro 8,5 mL</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td> <td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Vidro slides</td><td>VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina acrílica</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>Resina epóxi M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>Resina epóxi M endurecedor</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>Dibutil ftalato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Resina epóxi M accelerateur</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>Cristalizador</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Joseph paper</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>Copos</td><td></td><td></td> de latão <td>faça você mesmo, compre ou faça por você</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa hermética</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Respirador purificador de ar</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho para respirador</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de partículas</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

congelamento plunge: uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em microscopia eletrônica de transmissão

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é uma ferramenta extraordinária para estudar a ultra-estrutura celular, a fim de localizar proteínas e visualizar complexos macromoleculares em resolução muito alta. No entanto, para chegar o mais perto possível do estado nativo, preservação amostra perfeita é necessária. fixação convencional microscopia electrónica (EM) com aldeídos, por exemplo, não proporcionar uma boa preservação ultraestrutural. A penetração lenta de fixadores induz reorganização de células e perda de vários componentes celulares. Portanto, a fixação EM convencional não permite para uma estabilização instantânea e preservação de estruturas e antigenicidade. A melhor escolha para examinar eventos intracelulares é usar criofixação seguido pelo método de fixação de congelamento e de substituição que mantém as células em seu estado nativo. congelamento de alta pressão / congelar-substituição, o qual preserva a integridade da ultra-estrutura celular, é o método mais vulgarmente utilizado, mas requer expensive equipamento. Aqui, um método fácil de usar e congelamento de fixação de baixo custo seguido de congelamento de substituição de culturas de células de suspensão é apresentado.

Neste artigo, um método de congelação fácil de usar e de imersão de baixo custo para ultra-estruturais (Figuras 1 e Figura 2) e estudos de imunomarcação (Figura 3) é apresentada. Nós demonstramos que não é necessário ter um equipamento especial para o processo de congelamento e de substituição e que o procedimento de aquecimento leva menos de 6 h, em vez das 24 h usando um sistema dedicado. <p c...

Este manuscrito descreve um método fácil de usar e criofixação de baixo custo para a visualização de células em suspensão por meio de microscopia electrónica de transmissão.

Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

O objetivo dos experimentos a seguir é propor uma ferramenta para estudos ultraestruturais e de imunolocalização de células em suspensão para visualização em microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é fácil de usar, de baixo custo e proporciona excelente preservação da estrutura celular. Esta é uma cultura de células em suspensão.Primeiro, as células são colhidas por diferentes centrifugações para obter um pellet em um tubo de microcentrífuga. Em uma segunda etapa, a amostra é rapidamente congelada por congelamento por imersão, que imobiliza as células e limita a formação de cristais de gelo. Em seguida, a substituição por congelamento é realizada para substituir a água por solvente contendo tetróxido de ósmio como fixador para estabilizar as estruturas celulares.Os resultados mostram que o congelamento por imersão e a substituição por congelamento preservam perfeitamente a infraestrutura das células. A fixação química foi um método primário para fixação de tecidos ou células para microscopia eletrônica de transmissão, mas com esse método, artefatos e extração de conteúdo celular são geralmente observados. Uma alternativa à fixação química é a criofixação.Este método representa a melhor escolha para produzir a mais alta qualidade de morfologia em seções finas de resina. O congelamento por imersão é uma técnica de criofixação que imobiliza moléculas na célula instantaneamente para evitar danos causados pela fixação química convencional. Antes de congelar a amostra por imersão, deve-se preparar uma grelha cortada com película Formvar para ser utilizada como suporte para congelação.Polir o vidro deslize com um pano sem fiapos até ficar brilhante e limpe. Mergulhar a lâmina de vidro numa solução de Formvar 0,3% em clorofórmio durante alguns segundos e deixar secar na vertical num copo. A manipulação deve ser realizada sob uma hotte com equipamento de proteção individual devido à presença de clorofórmio.Depois de encher um cristalizador com água destilada, passe sobre a superfície da água uma barra de vidro para remover a poeira. Quando o filme estiver seco, corte as bordas com uma lâmina de barbear afiada para que o filme possa se soltar. Congele a lâmina exalando pesadamente na lâmina para obter uma camada de vapor de água no filme.Flutue imediatamente o filme na superfície da água tocando a parte inferior da lâmina com um ângulo de cerca de 30 graus em relação à superfície da água. Abaixe lentamente o slide no banho, puxando o filme conforme necessário. O filme Formvar se deposita lentamente na superfície da água.Prenda o filme na borda do cristalizador usando uma pinça. Coloque suavemente as grades de cobre de 400 mesh voltadas para baixo no filme nas regiões com a espessura adequada e sem rugas. O filme com grades é captado cobrindo-os com papel Joseph enquanto flutuam na superfície da água.Pegue a borda do papel Joseph e o filme com grades deve vir com ele. Não deixe seus dedos tocarem a superfície da água ou você corre o risco de deixar uma película na água. Deixe as grades secarem várias horas antes de usá-las.Para estudos ultraestruturais, colocar a ampola de tetróxido de ósmio num frasco de vidro. Agite bem o frasco para quebrar a ampola. Adicionar um volume adequado de acetona a 100% para obter uma concentração final de 4% Agitar o balão que contém o meio de substituição por congelação e distribuir alíquotas de 1,5 mililitros em criogenias com uma pipeta de transferência de plástico.Feche todas as tampas e mantenha no freezer a 84 graus negativos antes de usar. Para estudos de imunomarcação de proteínas, prepare 0,1% de acetato de uranila em acetona. Quando a solução ficar límpida, filtrar com filtro de 0,2 micrómetros e distribuir alíquotas de 1,5 mililitros em crioviais.Mantenha no freezer a 84 graus negativos antes de usar. Para ter certeza de ter a consistência apropriada de pellets de diferentes tipos de células, células de levedura cruas no mínimo de meio líquido completo para obter um 10 a nove células. Escherichia coli em meio DTY para obtenção de cinco células bacterianas de 10 a 10.Leishmania flagellum em meio AM e Trypanosoma brucei em meio SDM79 para obter cinco 10 a oito células do parasito. Transferir o meio de cultura contendo células em suspensão para um tubo de propileno de 50 ml e centrifugar durante três minutos a 1 500 g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento num mililitro do respectivo meio de cultura celular.Centrifugar num tubo de microcentrífuga durante um minuto a 3 900 g. Retirar completamente o sobrenadante. Para o método de congelamento por imersão, deve-se usar uma garrafa de propano com um tubo conectado ao cilindro de propano.Sendo o propano potencialmente explosivo, realize a liquefação em uma sala bem ventilada ou em uma capela de exaustão. Não são permitidas chamas abertas. Equipamentos de proteção individual, incluindo criogloves, devem sempre ser usados ao usar nitrogênio líquido.Coloque uma pequena quantidade de nitrogênio líquido na bandeja de poliestireno. Coloque o copo de latão em nitrogênio líquido. Bolhas aparecem.Espere até que as bolhas desapareçam. O copo de latão é então congelado. Coloque o tubo conectado ao cilindro de propano em contato com a parede da tampa de latão.Abra suavemente a válvula do cilindro de propano. Muita fumaça se forma quando o propano não começa a se liquefazer. Quando o propano começa a se liquefazer, a fumaça desaparece.Pare a liquefação fechando a válvula do cilindro de propano e removendo rapidamente o tubo conectado ao cilindro de propano. Encha a bandeja de poliestireno com nitrogênio líquido até cinco milímetros do topo do copo de latão. Congele pequenos copos de latão onde substituiremos a amostra após o congelamento, colocando-os em nitrogênio líquido.Coloque um copo para uma amostra. Tenha cuidado para não misturar amostras. Para obter a consistência adequada do pellet, basta respeitar as condições de cultura e os parâmetros de centrifugação indicados anteriormente.Congele as pinças antes de usá-las. Pegue uma grade de microscopia de cobre de 400 mesh cortada com Formvar. Mergulhe uma agulha de dissecação de dois gumes no pellet.Coloque, usando a ferramenta, uma gota de pellet na grade. Mergulhe rapidamente a grade em propano líquido e mexa alguns segundos. Transfira rapidamente a grade congelada no pequeno copo de latão.Para cada amostra, faça pelo menos três grades. Não se esqueça de congelar a pinça antes de pegar uma grade. Congele as pinças antes de usá-las.Remova rapidamente o copo e transfira as grades congeladas para o criogênico usando a pinça. Coloque a tampa de volta no criogenial. Repita a operação para cada grade de cada amostra.Feche as tampas e mexa o criogenio para ter certeza de que as amostras estão em meio de substituição por congelamento. Deixe os criotubos por três dias no freezer de 84 graus negativos. Transporte os criogenianos em uma bandeja de poliestireno para evitar um aumento repentino de temperatura para o freezer de 30 graus negativos.Deixe uma hora a menos 30 graus. Carregue os criotubos a menos 15 graus por duas horas, depois coloque as amostras a quatro graus por duas horas e 30 minutos em temperatura ambiente. Remover o meio de substituição por congelação com pipetas de transferência de plástico e colocá-lo num frasco de resíduos apropriado claramente identificado.Coloque cerca de 500 microlitros de acetona 100%. Abra o frasco de vidro e agite o criogenio e coloque rapidamente o meio de substituição por congelamento em um frasco de vidro. Enxágue um criogenial com 100% de acetona.Enxágue três vezes por 10 minutos com 100% de acetona. Transporte os criogenianos em uma bandeja de poliestireno para evitar um aumento repentino de temperatura para o freezer de 30 graus negativos. Deixe duas horas a menos 30 graus.Depois de colocar as amostras em um frasco de polipropileno, substitua o meio de substituição por congelamento fresco e deixe duas horas a menos 30 graus. Enxágue uma hora com 100% de acetona e três vezes uma hora com 100% de etanol. O método de congelamento por imersão/substituição por congelamento resultou em excelente preservação das estruturas intracelulares das células em suspensão.Em Saccharomyces cerevisiae, as estruturas não são encolhidas e o citoplasma parece denso. Além disso, as membranas são lisas, o que é uma prova de uma boa preservação. Todas as organelas, como núcleo, mitocôndrias e vacúolos, podem ser perfeitamente identificadas.Excelente preservação também é observada em Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei e Escherichia coli. No núcleo, a membrana dupla formando o envelope nuclear, o poro nuclear, o corpo do pólo do fuso e os ribossomos ligados à membrana externa do envelope nuclear são distintamente visíveis. Nas mitocôndrias, as invaginações da membrana interna, chamadas cristas, são claramente visíveis.Organelas críticas são os vacúolos, porque grandes cristais de gelo podem se desenvolver facilmente. Na imagem, os vacúolos estão perfeitamente preservados sem danos aos cristais de gelo. O método de congelamento por imersão/substituição por congelamento também pode ser usado para realizar a imunolocalização de proteínas.O procedimento preserva perfeitamente a antigenicidade da proteína e, como mencionado anteriormente, as organelas são claramente identificadas. Diferentes anticorpos já foram testados para atingir diferentes proteínas em leveduras, como anti-ATP sintase e anti-porina. Tal experimento também é possível para diferentes sistemas experimentais, como em Leishmania, onde a proteína flabarina foi localizada.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras com o método de congelamento por imersão/substituição por congelamento para visualizá-las em microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é rápida, fácil de usar, de baixo custo e oferece excelente preservação das infraestruturas celulares. Tenha cuidado com o nitrogênio líquido, mas especialmente com o tetróxido de ósmio e o acetato de uranila.Eles devem ser manuseados na hotte usando equipamento de proteção individual adequado, incluindo jaleco e luvas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Que vamos mostrar aqui como usar elétron cryotomography (ECT) para estudar a ultra-estrutura das células bacterianas em quase nativo estados, a "macromolecular" (~ 4 nm) resolução.

Electron Cryotomography de células bacterianas

Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

São descritas as técnicas básicas e refinamentos de processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas e nanomateriais para exame por microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é um método preferido para revelar características ultra-estruturais e especializações de membranas biológicas e para a obtenção de dados dimensionais e espaciais de nível ultra-estrutural em ciências dos materiais e produtos da nanotecnologia.

Fundamental Elements Técnica de Freeze-fratura / Freeze-etch em Biológica de Microscopia Eletrônica

Obter imagens de microscopia eletrônica de transmissão de alta qualidade é um desafio, especialmente no caso de células vegetais, que possuem grandes vacúolos cheios de água e espaços aerados abundantes. O congelamento de alta pressão em tandem e a substituição rápida por congelamento reduzem muito o tempo de preparação de amostras de plantas para TEM, ao mesmo tempo em que produzem amostras com excelente preservação ultraestrutural.

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Nós desenvolvemos uma nova técnica de microscopia electrónica, de "flash-e-congelamento", que permite a visualização da dinâmica da membrana com ms resolução temporal. Esta técnica combina a estimulação optogenetic de neurónios com congelamento de alta pressão. Aqui, demonstramos os procedimentos e descrever os protocolos em detalhe.

Flash-e-Freeze: uma nova técnica para capturar Membrane Dynamics com Electron Microscopy

Apresentado aqui é um protocolo para a cultura celular em membranas de nitreto de silício e congelamento de mergulho antes da imagem de fluorescência de raios-X com uma nanossonda de raios-X criogênico síncrotron. Quando apenas a temperatura ambiente nano-análise é fornecida, as amostras congeladas podem ser mais liofilizadas. Estes são passos críticos para obter informações sobre a composição elementar intracelular.

Cultura celular em membranas de nitreto de silício e criopreparação para a fluorescência de raios-X synchrotron Nano-análise

Aqui, é apresentado um protocolo descrevendo as etapas de preparação da amostra e coleta de dados necessárias na tomografia criobada de raios-X (SXT) para a imagem da ultraestrutura de células inteiras preservadas de crio-preservo em uma resolução de 25 nm meio passo.

Uma descrição cartográfica 3D da célula por crioma tomografia de raios-X suave

Aqui mostramos como usar o dispositivo de congelamento de sanduíches para congelamento rápido de espécimes biológicos, incluindo bactérias, leveduras, células cultivadas, células isoladas, tecidos animais e humanos e vírus. Também mostramos como preparar espécimes para seção ultrathin após congelamento rápido.

Congelamento rápido usando dispositivo de congelamento de sanduíches para boa preservação ultraestrutural de espécimes biológicos em microscopia eletrônica

Este manuscrito descreve o método de mancha e mergulho para congelar manualmente espécimes biológicos para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas.

Congelamento manual de amostras biológicas para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas

Aqui, apresentamos um pipeline para fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D na orientação da preparação de amostras celulares para tomografia crio-eletrônica. A posição 3D das proteínas fluorescentemente marcadas de interesse é primeiramente determinada por microscopia de criofluorescência e, em seguida, direcionada para moagem. O protocolo é adequado para células de mamíferos, leveduras e bactérias.

Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

Este protocolo de vídeo ilustra como realizar a tomografia por microscopia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes virológicos. Para obter os melhores resultados, as amostras são preparadas por congelamento de alta pressão e subsequente substituição por congelamento.

Tomografia por Microscopia Eletrônica de Transmissão de Varredura em Virologia: Imagem 3D de Amostras Congeladas de Alta Pressão e Substituídas por Congelamento

Aprenda a técnica de congelamento plunge para preservação ultraestrutural de células em suspensão em microscopia eletrônica de transmissão. Este método de baixo custo imobiliza células rapidamente, limita cristais de gelo e estabiliza estruturas celulares para estudos de imunolocalização.

Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão (Vídeo) | JoVE Journal

Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

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