Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

O objetivo dos experimentos a seguir é propor uma ferramenta para estudos ultraestruturais e de imunolocalização de células em suspensão para visualização em microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é fácil de usar, de baixo custo e proporciona excelente preservação da estrutura celular. Esta é uma cultura de células em suspensão.

Primeiro, as células são colhidas por diferentes centrifugações para obter um pellet em um tubo de microcentrífuga. Em uma segunda etapa, a amostra é rapidamente congelada por congelamento por imersão, que imobiliza as células e limita a formação de cristais de gelo. Em seguida, a substituição por congelamento é realizada para substituir a água por solvente contendo tetróxido de ósmio como fixador para estabilizar as estruturas celulares.

Os resultados mostram que o congelamento por imersão e a substituição por congelamento preservam perfeitamente a infraestrutura das células. A fixação química foi um método primário para fixação de tecidos ou células para microscopia eletrônica de transmissão, mas com esse método, artefatos e extração de conteúdo celular são geralmente observados. Uma alternativa à fixação química é a criofixação.

Este método representa a melhor escolha para produzir a mais alta qualidade de morfologia em seções finas de resina. O congelamento por imersão é uma técnica de criofixação que imobiliza moléculas na célula instantaneamente para evitar danos causados pela fixação química convencional. Antes de congelar a amostra por imersão, deve-se preparar uma grelha cortada com película Formvar para ser utilizada como suporte para congelação.

Polir o vidro deslize com um pano sem fiapos até ficar brilhante e limpe. Mergulhar a lâmina de vidro numa solução de Formvar 0,3% em clorofórmio durante alguns segundos e deixar secar na vertical num copo. A manipulação deve ser realizada sob uma hotte com equipamento de proteção individual devido à presença de clorofórmio.

Depois de encher um cristalizador com água destilada, passe sobre a superfície da água uma barra de vidro para remover a poeira. Quando o filme estiver seco, corte as bordas com uma lâmina de barbear afiada para que o filme possa se soltar. Congele a lâmina exalando pesadamente na lâmina para obter uma camada de vapor de água no filme.

Flutue imediatamente o filme na superfície da água tocando a parte inferior da lâmina com um ângulo de cerca de 30 graus em relação à superfície da água. Abaixe lentamente o slide no banho, puxando o filme conforme necessário. O filme Formvar se deposita lentamente na superfície da água.

Prenda o filme na borda do cristalizador usando uma pinça. Coloque suavemente as grades de cobre de 400 mesh voltadas para baixo no filme nas regiões com a espessura adequada e sem rugas. O filme com grades é captado cobrindo-os com papel Joseph enquanto flutuam na superfície da água.

Pegue a borda do papel Joseph e o filme com grades deve vir com ele. Não deixe seus dedos tocarem a superfície da água ou você corre o risco de deixar uma película na água. Deixe as grades secarem várias horas antes de usá-las.

Para estudos ultraestruturais, colocar a ampola de tetróxido de ósmio num frasco de vidro. Agite bem o frasco para quebrar a ampola. Adicionar um volume adequado de acetona a 100% para obter uma concentração final de 4% Agitar o balão que contém o meio de substituição por congelação e distribuir alíquotas de 1,5 mililitros em criogenias com uma pipeta de transferência de plástico.

Feche todas as tampas e mantenha no freezer a 84 graus negativos antes de usar. Para estudos de imunomarcação de proteínas, prepare 0,1% de acetato de uranila em acetona. Quando a solução ficar límpida, filtrar com filtro de 0,2 micrómetros e distribuir alíquotas de 1,5 mililitros em crioviais.

Mantenha no freezer a 84 graus negativos antes de usar. Para ter certeza de ter a consistência apropriada de pellets de diferentes tipos de células, células de levedura cruas no mínimo de meio líquido completo para obter um 10 a nove células. Escherichia coli em meio DTY para obtenção de cinco células bacterianas de 10 a 10

Leishmania flagellum em meio AM e Trypanosoma brucei em meio SDM79 para obter cinco 10 a oito células do parasito. Transferir o meio de cultura contendo células em suspensão para um tubo de propileno de 50 ml e centrifugar durante três minutos a 1 500 g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento num mililitro do respectivo meio de cultura celular.

Centrifugar num tubo de microcentrífuga durante um minuto a 3 900 g. Retirar completamente o sobrenadante. Para o método de congelamento por imersão, deve-se usar uma garrafa de propano com um tubo conectado ao cilindro de propano.

Sendo o propano potencialmente explosivo, realize a liquefação em uma sala bem ventilada ou em uma capela de exaustão. Não são permitidas chamas abertas. Equipamentos de proteção individual, incluindo criogloves, devem sempre ser usados ao usar nitrogênio líquido.

Coloque uma pequena quantidade de nitrogênio líquido na bandeja de poliestireno. Coloque o copo de latão em nitrogênio líquido. Bolhas aparecem.

Espere até que as bolhas desapareçam. O copo de latão é então congelado. Coloque o tubo conectado ao cilindro de propano em contato com a parede da tampa de latão.

Abra suavemente a válvula do cilindro de propano. Muita fumaça se forma quando o propano não começa a se liquefazer. Quando o propano começa a se liquefazer, a fumaça desaparece.

Pare a liquefação fechando a válvula do cilindro de propano e removendo rapidamente o tubo conectado ao cilindro de propano. Encha a bandeja de poliestireno com nitrogênio líquido até cinco milímetros do topo do copo de latão. Congele pequenos copos de latão onde substituiremos a amostra após o congelamento, colocando-os em nitrogênio líquido.

Coloque um copo para uma amostra. Tenha cuidado para não misturar amostras. Para obter a consistência adequada do pellet, basta respeitar as condições de cultura e os parâmetros de centrifugação indicados anteriormente.

Congele as pinças antes de usá-las. Pegue uma grade de microscopia de cobre de 400 mesh cortada com Formvar. Mergulhe uma agulha de dissecação de dois gumes no pellet.

Coloque, usando a ferramenta, uma gota de pellet na grade. Mergulhe rapidamente a grade em propano líquido e mexa alguns segundos. Transfira rapidamente a grade congelada no pequeno copo de latão.

Para cada amostra, faça pelo menos três grades. Não se esqueça de congelar a pinça antes de pegar uma grade. Congele as pinças antes de usá-las.

Remova rapidamente o copo e transfira as grades congeladas para o criogênico usando a pinça. Coloque a tampa de volta no criogenial. Repita a operação para cada grade de cada amostra.

Feche as tampas e mexa o criogenio para ter certeza de que as amostras estão em meio de substituição por congelamento. Deixe os criotubos por três dias no freezer de 84 graus negativos. Transporte os criogenianos em uma bandeja de poliestireno para evitar um aumento repentino de temperatura para o freezer de 30 graus negativos.

Deixe uma hora a menos 30 graus. Carregue os criotubos a menos 15 graus por duas horas, depois coloque as amostras a quatro graus por duas horas e 30 minutos em temperatura ambiente. Remover o meio de substituição por congelação com pipetas de transferência de plástico e colocá-lo num frasco de resíduos apropriado claramente identificado.

Coloque cerca de 500 microlitros de acetona 100%. Abra o frasco de vidro e agite o criogenio e coloque rapidamente o meio de substituição por congelamento em um frasco de vidro. Enxágue um criogenial com 100% de acetona.

Enxágue três vezes por 10 minutos com 100% de acetona. Transporte os criogenianos em uma bandeja de poliestireno para evitar um aumento repentino de temperatura para o freezer de 30 graus negativos. Deixe duas horas a menos 30 graus.

Depois de colocar as amostras em um frasco de polipropileno, substitua o meio de substituição por congelamento fresco e deixe duas horas a menos 30 graus. Enxágue uma hora com 100% de acetona e três vezes uma hora com 100% de etanol. O método de congelamento por imersão/substituição por congelamento resultou em excelente preservação das estruturas intracelulares das células em suspensão.

Em Saccharomyces cerevisiae, as estruturas não são encolhidas e o citoplasma parece denso. Além disso, as membranas são lisas, o que é uma prova de uma boa preservação. Todas as organelas, como núcleo, mitocôndrias e vacúolos, podem ser perfeitamente identificadas.

Excelente preservação também é observada em Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei e Escherichia coli. No núcleo, a membrana dupla formando o envelope nuclear, o poro nuclear, o corpo do pólo do fuso e os ribossomos ligados à membrana externa do envelope nuclear são distintamente visíveis. Nas mitocôndrias, as invaginações da membrana interna, chamadas cristas, são claramente visíveis.

Organelas críticas são os vacúolos, porque grandes cristais de gelo podem se desenvolver facilmente. Na imagem, os vacúolos estão perfeitamente preservados sem danos aos cristais de gelo. O método de congelamento por imersão/substituição por congelamento também pode ser usado para realizar a imunolocalização de proteínas.

O procedimento preserva perfeitamente a antigenicidade da proteína e, como mencionado anteriormente, as organelas são claramente identificadas. Diferentes anticorpos já foram testados para atingir diferentes proteínas em leveduras, como anti-ATP sintase e anti-porina. Tal experimento também é possível para diferentes sistemas experimentais, como em Leishmania, onde a proteína flabarina foi localizada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras com o método de congelamento por imersão/substituição por congelamento para visualizá-las em microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é rápida, fácil de usar, de baixo custo e oferece excelente preservação das infraestruturas celulares. Tenha cuidado com o nitrogênio líquido, mas especialmente com o tetróxido de ósmio e o acetato de uranila.

Eles devem ser manuseados na hotte usando equipamento de proteção individual adequado, incluindo jaleco e luvas.