Name: Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a quantificar óxido nítrico em amostras biológicas por quimioluminescência, medindo níveis de nitrito e nitrato com soluções redutoras de triiodeto e cloreto de vanádio. Este método sensível permite rastrear o metabolismo do NO.

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Autores querem reconhecer contribuições críticas do Dr. A. Dejam e MM Pelletier no desenvolvimento do uso da solução de nitrito de preservação para as medições de nitrito no sangue.

Todos os protocolos, incluindo o uso de animais foram aprovados para uso pelo NIDDK Animal Care e do Comitê Use e sangue humano foi obtido a partir dos bancos de sangue NIH de doadores saudáveis. Preparação 1. Amostra <ol><li> Preparação da solução de nitrito de preservação <ol><li> Prepara-se uma solução contendo 890 mM de ferricianeto de potássio (K 3 Fe (CN) 6) e NEM 118 mM (N-etilmaleimida) em água destilada. Dissolva bem até que fique claro amarelo sem cristais presentes. Adicionar NP-40 (octil phenoxylpolyethoxylethanol) em uma proporção de 1: 9 (v / v, NP-40 / solução). Misture com cuidado para evitar a formação de espuma e armazenar a 4 ° C, durante cerca de uma semana). </li></ol></li><li> Recolha e preparação de amostras de sangue <ol><li> Recolha de sangue, utilizando, pelo menos, uma agulha de 20 G para evitar hemólise com a heparina para evitar a coagulação (5 U / ml). Para a amostra de sangue, misturar sangue com nitrito de solução conservante imediatamente em uma proporção de 1: 4 (v/ V / solução de sangue). </li><li> Para as amostras de plasma e células vermelhas do sangue, centrifugação do sangue recolhido durante 5 min a 4000 xg, a 4 ° C para separar as células vermelhas do sangue (RBC) e plasma. Tome-se o sobrenadante (plasma) e misturá-lo com nitrito de solução conservante, como descrito acima para a determinação dos níveis de nitrito no plasma. </li><li> Cuidadosamente remover a restante plasma e buffy coat a partir da amostra e da pipeta da amostra de glóbulos vermelhos a partir do fundo do tubo para evitar a contaminação por outros tipos de células do sangue, utilizando uma ponta de pipeta de corte, e transferi-lo para um tubo contendo solução conservante nitrito na mesma razão como acima. </li><li> Misturar cada amostra (plasma e glóbulos vermelhos) com metanol frio a uma razão de 1: 1 ou 1: 2 (v / v da amostra / metanol) e centrifugar para a 13.000 xg, a 4 ° C durante 15 min para precipitar as proteínas. Leve o sobrenadante e usá-lo para a medição de nitrito ou congelar amostras preparadas, se necessário, em gelo seco e armazenar a -80 ° C. Nota: Nitrito rea rapidamentects com oxi-hemoglobina (oxiHb) em nitrato de formação de sangue. Desde oxiHb está sempre presente em grande excesso em relação nitrito, esta reacção conduz à aniquilação quase completa de nitrito de sangue nativo com um prazo de ~ 10 min. A fim de preservar a maioria de nitrito de sangue endógena, solução de preservação é adicionado nitrito de toda a amostra de sangue imediatamente após a colheita de sangue. A solução irá rapidamente lisar as células vermelhas do sangue e oxidar oxiHb em metemoglobina (metHb), uma forma inactiva de hemoglobina que não reage quimicamente com o nitrito. </li></ol></li><li> Preparação de amostras de outros tipos de fluido corporal <ol><li> Após a coleta de amostra para um recipiente adequado, misture bem com nitrito de preservar solução, deproteinate e medir imediatamente ou congelar e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Recolha e preparação de amostras de tecido <ol><li> Recolha de tecidos animais perfundidos com solução salina heparinizada (10 U HEPARin / ml). Especial de consumo de cerca de 1 g de tecido desejado e homogeneizar ou usando um homogeneizador manual ou automatizado um homogeneizador. </li><li> Adicionar quantidade conhecida de solução de nitrito de preservação, conforme necessário para atingir homogenato suave. </li><li> Uma vez que o tecido é homogeneizado, precipitar as proteínas utilizando metanol frio (1: 1 ou 1: 2, razão v / v de amostra / metanol), como descrito acima, as amostras depois de centrifugação a 13.000 xg, a 4 ° C durante 15 min. </li><li> Recolha níveis de nitrito sobrenadante e medida. Se necessário, congelar amostras em qualquer fase da preparação sobre gelo seco e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de reduzir Soluções <ol><li> Tri-iodeto (I 3) reduzir a solução de nitrito e R- (X) -NO espécies determinação 1,3,4 <ol><li> Prepara-se uma solução de Kl 301 mM em conjunto com 138 mM de solução de I2 em água. Misturar-se com ácido acético glacial na proporção de 2: 7 (v / v / solução de ácido) num agitador magnético durante ~ 30 min, até que todoscristais são dissolvidos. Preferencialmente manter em garrafa escura, como iodeto é sensível à luz, e usar dentro de uma semana de preparação. Nota: Esta solução reduzirá o nitrito em NO e que também irá liberar NO a partir de R-SNO, R-NNO e Fe-NO grupos funcionais (R- (X) -NO), mas o nitrato não será afetado. O sinal a partir dos grupos funcionais à base de NO acima podem ser separados a partir do sinal verdadeiro nitrito por tratamento de metade da amostra com sulfanilamida acidificada (AS) e comparando-tratado como sinal e não tratada. AS irreversivelmente forma de diazónio catião com nitrito e este complexo não pode ser reduzida em I 3 solução. Porque, assim como o tratamento, prepare uma solução 290 mM de sulfanilamida em HCl 1 M e adicioná-lo a uma alíquota de amostra na proporção de 1: 9 (v / v AS / amostra). Medir o sinal de CL em partes AS-tratadas e não tratadas da amostra. Calcule o sinal de nitrito de verdade, como uma diferença de parte AS-tratados e não tratados da amostra. Nitrito pode também ser medido usando um nit selectivarito de redução de solução de / mistura de ácido acético ascórbico como descrito na parte 2.2. No entanto, devido à pequena quantidade geralmente de R- (X) -NO espécies presentes, medições usando como amostras-não tratados são na maioria dos casos, uma muito boa aproximação do teor total de nitrito. </li></ol></li><li> O ácido ascórbico / ácido acético solução (4A) para a determinação selectiva de nitrito de dois <ol><li> Prepare o ácido ascórbico 500 mm de água. Misturar esta solução com ácido acético glacial numa razão de 1: 7 (v / v, ácido ascórbico / ácido acético) para se preparar a mistura de reacção. Nota: Esta solução é específico para nitrito, não vai liberar NO a partir de qualquer R- (X) -NO espécie ou nitrato. No entanto, a solução de ácido acético e ascórbico deve ser preparada de fresco a cada dia antes das medições, como o ácido ascórbico oxida facilmente em solução. Conclusão de redução de nitritos depende da concentração de ácido ascórbico; e ácido ascórbico 50 mM, pelo menos, é recomendado para R completaedução de nitrito de plasma. No entanto, recomenda-se realizar algumas experiências piloto com diferentes concentrações de ácido ascórbico e padrões de nitrito no intervalo de concentração de nitrito esperado antes das medições por amostra final. Tenha em atenção que o ácido ascórbico esgota ligeiramente durante as medições, mudanças frequentes de modo de mistura de reacção na câmara de reacção de vidro são recomendados. </li></ol></li><li> Vanádio (III) solução de cloreto de redução para a determinação de nitrato de 9 <ol><li> Preparar uma solução 51 mM de VCl 3 em HCl 1M. Filtrar a solução através de um filtro de 200 um e armazenar em um frasco escuro, use dentro de duas semanas. Nota: Esta solução irá reduzir o nitrato, nitrito e todos R- (X) -NO espécies, por isso, se quantidades comparáveis de nitrito ou outro R- (X) -NO espécies estão presentes em conjunto com o nitrato, o teor final de nitrato tem de ser calculado como a diferença entre os sinais obtidos com CL VCl 3 e I3 reduzindo soluções. </li></ol></li></ol> 3. A quimiluminescência (CL) de configuração e Medidas Analyzer <ol><li> Solução padrão <ol><li> Prepare 1 uM solução de nitrito de sódio (NaNO 2). A mesma solução pode ser utilizado para determinações de nitrito e nitrato. </li></ol></li><li> Usando analisador Nota: Atualmente, existem dois disponíveis comercialmente NÃO analisadores que são sensíveis o suficiente para fins de pesquisa biológica - Sievers NOA e Ecophysics CLD 88Y. Ambos operam no mesmo princípio; a diferença principal é que CLD 88Y utiliza oxigénio do ar ambiente para fazer o ozono (O3), enquanto NOA requer um tanque de oxigénio exterior para o efeito. O procedimento abaixo descreve o conjunto para o Sievers NOA. <ol><li> configuração do instrumento <ol><li> Faça um ajuste inicial do analisador de acordo com as recomendações do fabricantecomo visto na Figura 1. </li><li> Abrir O tanque 2 ligado ao instrumento. Escolha &quot;análise&quot; e &quot;enter&quot; no menu principal no painel frontal. Na tela seguinte, escolha &quot;iniciar&quot; e pressione &quot;Enter&quot;. Ligar a armadilha de ácido (contendo NaOH 1 M) para o instrumento, conforme visto na Figura 1. </li><li> Esperar até fotomultiplicador arrefece para a temperatura inferior a -12 ° C e a câmara de reacção é evacuado a 6 Torr. Demora cerca de 30 min para chegar a uma linha de base plana e estável. A linha de base precisa para estabilizar dentro de 1 - 2 mV, o seu valor nominal é menos importante do que a sua estabilidade. Nota: Se o nitrato é medido, ligar o banho de arrefecimento de água (definido a 4 ° C, o que serve como armadilha fria por vapores de ácido e água) e o banho de água com aquecimento (a câmara de reacção principal, 95 ° C). A taxa de redução de nitrato em NO VCl 3 em solução é dependente da temperatura, e é muito lenta em Tempe quartotura, de modo substancial aumento da temperatura é necessária para observar a reacção. </li><li> Abra o tanque Ele e ligar a câmara de reacção de vidro para armadilha de ácido, como visto na Figura 1. Encha a câmara de reacção com uma solução de redução apropriado, reduzir a borbulhar para o mínimo e ligar câmara de reação para a armadilha de ácido. Usando tentativa e erro, ajustar a taxa de borbulhamento Ele para coincidir com a taxa de aspiração do instrumento (normalmente a ~ 200 mL / min para NOA de Siever). </li><li> Ligue o computador que controla o instrumento e iniciar o software líquido baseado em LabVIEW. Para ativar a comunicação entre o instrumento e o software de aquisição, pressione &quot;Enter&quot; quando em &quot;menu de dados&quot; até que a tela lê &quot;saída habilitado&quot;, em seguida, pressione &quot;claro&quot; para voltar para a tela de dados. </li><li> Espere por um traço linha de base estável na tela e começar a injetar amostras e padrões de nitrito na solução redutora através do septo. Sempre esperar para chegar a um ré linha de base estáveler o pico. Isso pode levar até 2 min. O software líquido tem uma opção para &quot;marcar&quot; tempos de injecção e anotar a injeção e vai exportar estes comentários em um arquivo separado (filename.info) como um complemento útil para o arquivo de dados (filename.data). </li><li> Uma vez que as amostras e padrões são medidos, escolha &quot;stop&quot; opção no menu de software líquido - o que irá gravar dados de um arquivo temporário em um arquivo permanente conhecido como &quot;filename.data&quot;. Pressionando opção &quot;abortar&quot; irá terminar a medição sem escrever dados adquiridos em um arquivo permanente. </li><li> Para terminar experimento, desligue o aparelho do recipiente de reacção, desligando a torneira na parte superior do recipiente de reacção e desligue o tubo entre a armadilha ácida e vaso de reação (ver Figura 1). Agora, pare de analisador NOA - pressione &quot;claro&quot;, vá para &quot;análise&quot;, colocar máquina em &quot;standby&quot; e espera &quot;confirmar&quot;. Se usado regularmente, oinstrumento pode ser deixado em modo de espera durante várias semanas. Desligue o fornecimento de oxigênio. Em seguida, lavar a solução redutora da câmara de reacção, de desconexão e fechar o tanque Ele a partir do vaso de reacção de vidro e proceder ao acabamento vaso de reacção. </li></ol></li><li> Padrões e amostras injecções <ol><li> Injecte 50 ul de solução de nitrito de 1 uM na mistura reaccional utilizando uma seringa de Hamilton bem lavadas. Aguarde pelo menos 1 - 2 min entre as injeções para conseguir uma boa separação dos picos. Repita injecção de 50 ul para chegar duplicados para cada ponto de dados. Lavar seringa com água desionizada após cada injecção. </li><li> Para adquirir conjunto completo de dados para curva padrão, continue com injecções em duplicado de 100, 150 mL (adicional de 200 mL pode ser necessária se altas concentrações de nitrito ou nitrato são esperados) de solução de nitrito de 1 ï¿½. Em cada caso, ter o cuidado de esperar até que o sinal cai de volta para a linha de base e, em seguida, adquirir 1 - 2 min da linha de base para alcançar uma boa separação dos picos. Nota: os padrões de nitrito pode ser medido em qualquer momento durante as experiências. No entanto, é preferível para obter a curva padrão, antes da medição de dados, como também serve como um controlo independente de funcionalidade instrumento. Quando os dados são coletados, quantidade de amostra injetada deve levar a picos bem pronunciadas. No entanto, deve ser mantido em mente que o fotomultiplicador é linear apenas até ~ 800 mV, de modo nenhum o pico deve ser superior a ~ 700 mV. Isto pode ser conseguido quer através da diminuição da quantidade injectada amostra ou a diluição da amostra com a água desionizada. Cada ponto deve ser medida pelo menos em duplicado. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+serum+nitrate%2C+a+stable+end+product+of+nitric+oxide%2C+in+women+with+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li>
<li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%3A+A+companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li>
<li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroprotocols%3A+A+companion+to+Methods+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li>
</ol>

Dr. Alan Schechter está listado como um co-inventor de várias patentes emitidas para os Institutos Nacionais de Saúde para o uso de sais de nitrito para o tratamento de doenças cardiovasculares. Ele recebe royalties com base no licenciamento NIH destas patentes para o desenvolvimento clínico, mas nenhuma outra compensação.

Passos críticos dentro do Protocolo Alíquotas de todas as soluções (incluindo a água) utilizados para preparar, diluir ou de outro modo tratar amostras originais têm de ser salvo e devolvido para possível nitrito ou (mais frequentemente) contaminação por nitrato. Nós descobrimos que a maioria vem de contaminação de água e muitos produtos químicos utilizados para tratar a amostra (ferricianeto em particular) também contém quantidades significativas de contaminação de nitrato em alguns lotes que ...

Nitrito, e um nitrato menos estender, os níveis no sangue refletem o estado geral do corpo NO metabolismo. concentrações de nitrito no sangue e a maioria dos órgãos e tecidos são apenas em nanomolar alta ou baixa gama micromolar, nitrato está normalmente presente em quantidades muito mais elevadas - na gama micromolar. Alterações nos níveis de nitrito devido à progressão da doença ou mudanças nos hábitos alimentares são bastante pequeno e só pode ser medido utilizando um método muito sensível. Por causa de seus níveis muito diferentes e diversos processos metabólicos, determinação separada dos níveis de nitrito e nitrato é essencial. Os chamados &quot;NO x determinação&quot;, onde nitrito e nitrato são medidos em conjunto tem muito pouco valor. Vários métodos para a quantificação de nitrito em várias amostras biológicas foram desenvolvidos - sendo o mais comum o mais antigo, com base na reacção de Griess, que tinha sido originalmente descrita em 1879. Mesmo com modificatio modernans, o limite de sensibilidade para nitrito atingível pelo método de Griess &#39;está em baixa gama micromolar. Quimiluminescência (CL), combinado com o tri-iodeto de solução redutora, é actualmente considerado como o método mais sensível, permitindo a quantificação na gama baixa nanomolar das concentrações de nitrito 1-8,10,11. O mesmo método CL, combinado com vanádio (III), cloreto de solução redutora, pode ser usado para medições sensíveis de nitrato, com precisão na gama nanomolar 9. CL detecta NO gás livre. Portanto, nitrito, nitrato, R-nitrosotióis (R-SNO), R-nitrosaminas (R-Nno), ou compostos de metal-Não (posteriormente referido como manuscrito &quot;R- (X) -NO&quot;), tem de ser convertida em grátis Sem gás, a fim de quantificar seus valores originais via CL. Conversão de NO é efectuada através de várias soluções redutoras diferentes, dependendo da natureza do NO metabolito. Após a conversão, livre Nenhum gás é purgado do recipiente de reacção por um gás transportador (He, N2 ou Ar) para dentro da câmara de reacção de um analisador CL onde o ozono (O3) é combinado com NO para formar dióxido de azoto (NO2) no seu estado activado. Com o retorno ao estado fundamental, NO 2 * emite na região do infravermelho e fóton emitido é detectada pelo fotomultiplicador (PMT) de instrumento de CL. A intensidade de luz emitida é directamente proporcional à concentração de NO na câmara de reacção, o que permite o cálculo da concentração das espécies originais usando curvas de calibração adequada. Em nosso protocolo, primeiro presente deliberação baseada em CL de nitrito e nitrato nos ambientes clínicos mais utilizados - em sangue e plasma, e depois discutimos como determinar estes íons em amostras de tecido. Nós também explicar em detalhes como preservar a concentração de nitrito fisiológica original, em ambientes de nitrito-reativa, como o sangue e seus componentes, plasma e glóbulos vermelhos.

<table><tbody><tr><td>ferricianeto de potássio; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-nonilfenil-polietilenoglicol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamida; AS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético, glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>ácido ascórbico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>iodeto de potássio; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>iodo; I2</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td></td></tr><tr><td>nitrito de sódio tóxico e sensível à luz; NaNO2</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de vanádio(III); VCl3</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>sensível à luz, tóxico</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&nbsp; Ecofísica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido nítrico pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

O óxido nítrico (NO) é um dos principais reguladores de moléculas na homeostase vascular e também um neurotransmissor. NO enzimaticamente produzido é oxidado em nitrito e nitrato por interações com várias proteínas oxi-heme e outras vias ainda não são bem conhecidos. O processo inverso, a redução de nitrito e nitrato em NO tinha sido descoberto em mamíferos na última década e está ganhando a atenção como um dos possíveis caminhos para prevenir ou aliviar toda uma gama de doenças cardiovasculares, doenças metabólicas e musculares que são pensados ​​para estar associado a diminuição dos níveis de NO. É, portanto, importante para estimar a quantidade de NO e dos seus metabolitos em diferentes compartimentos do corpo - sangue, fluidos corporais e os vários tecidos. Sangue, devido à sua fácil acessibilidade, é o compartimento preferido utilizado para a estimativa de metabólitos. Devido à sua curta vida (alguns milissegundos) e baixa concentração de sub-nanomolar, medições confiáveis ​​diretos de sangue NO &lt;em&gt; in vivo apresentam grandes dificuldades técnicas. Assim NO disponibilidade geralmente é estimado com base na quantidade de seus produtos de oxidação, nitrito e nitrato. Estes dois metabolitos são sempre medidos separadamente. Existem vários métodos bem estabelecidos para determinar as suas concentrações em fluidos biológicos e tecidos. Aqui é apresentado um protocolo para o método de quimioluminescência (CL), com base na detecção espectrofotométrico de NO após nitrito ou nitrato de redução de tri-iodeto ou de vanádio (III) soluções de cloreto, respectivamente. A sensibilidade para nitrito e nitrato de detecção é em baixa gama nanomolar, que define CL como o método mais sensível disponível atualmente para determinar mudanças na NO vias metabólicas. Nós explicar em detalhe como preparar amostras de fluidos e tecidos biológicos, a fim de preservar valores originais de nitrito e nitrato presente no momento da coleta e como determinar os respectivos montantes em amostras. Limitações da técnica CL também são explained.

A Figura 2 mostra resultados representativos recolhidos a partir de padrões e cinco amostras diferentes. Como mostrado nesta figura, os aumentos de tensão fotomultiplicador imediatamente após nitrito contendo a solução (padrões ou amostras) é injectado na solução redutora (injecções de tempos estão indicados por setas vermelhas abaixo da curva) e regressa ao valor basal, uma vez todos os nitritos presentes no injectado solução foi reduzida. É também evidente a partir des...

O óxido nítrico (NO) é uma importante molécula de sinalização na homeostase vascular. A produção de NO in vivo é muito baixa para medição direta. A quimioluminescência fornece informações úteis sobre o ciclo de NO por meio da medição de seus precursores e produtos de oxidação, nitrito e nitrato. A determinação de nitrito / nitrato nos tecidos e fluidos do corpo é explicada.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

O objetivo deste protocolo é usar quimioluminescência para quantificar o óxido nítrico em amostras biológicas, quantificando os níveis de nitrito e nitrato, usando soluções redutoras de triiodeto e cloreto de vanádio. Este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para rastrear o metabolismo e a sinalização do óxido nítrico, tanto regional quanto longitudinalmente a partir de uma variedade de amostras biológicas. A principal vantagem desta técnica é sua simplicidade e alta sensibilidade.Demonstrando este procedimento estará Katelyn Cassel, nossa bolsista IRTA. Ela nos mostrará como medir o nitrito por quimioluminescência acoplada à solução de triiodeto. Para começar, faça uma solução de preservação de nitrito.Preparar uma solução contendo um NEM 118 milimolar e um ferrocianeto de potássio 890 milimolar em água destilada. Dissolva os sólidos até que a solução fique amarela clara, sem cristais. Em seguida, adicionar esta solução à NP 40 numa relação volume a volume de 9 para 1.Misture a solução delicadamente para evitar a formação de espuma. Nunca vórtice esta mistura. A solução de preservação de nitrito pode ser usada por cerca de uma semana se armazenada a 4 graus Celsius.O protocolo pode ser usado em muitas amostras biológicas recém-obtidas. Neste caso, o sangue recém-coletado foi centrifugado para obter uma amostra de plasma para teste. É muito importante processar sangue ou quaisquer amostras biológicas contendo uma grande quantidade de proteínas heme, como hemoglobina ou mioglobina, o mais rápido possível, porque as proteínas heme reagirão com o nitrito e destruirão o nitrito.Agora, para preservar a maior parte do nitrito sanguíneo endógeno, misture imediatamente o plasma com uma solução de preservação de nitrito em uma proporção de 1 a 4 volume por volume. Durante qualquer etapa desta preparação, a amostra pode ser congelada em gelo seco. Para desproteinar a amostra, misture-a com uma parte igual de metanol frio.Em seguida, centrifugue a amostra a 13000 G por 15 minutos a 4 graus Celsius para precipitar proteínas. Pegue o sobrenadante e use-o para medição de nitrito. Para uma medida sensível de nitrito, uma solução redutora de triiodeto é considerada mais eficaz.Ao prepará-lo, certifique-se de que todos os cristais se dissolvam. Mantenha a solução em um frasco escuro e use-a dentro de uma semana após o preparo. Uma solução redutora de cloreto de vanádio oferece a maior precisão para medir nitrato.Uma solução 1 micromolar de nitrito é usada para determinar a curva padrão para nitrito, bem como nitrato. Configure o analisador de óxido nítrico de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro, abra o tanque de oxigênio, ligue o instrumento e conecte-o a uma armadilha de ácido, que contém um molar de hidróxido de sódio.Em seguida, abra o tanque de hélio e conecte a câmara de reação de vidro ao tanque de hélio. Agora, carregue a câmara de reação com solução de triiodeto para medição de nitrito. Adicione agente antiespumante.Ajuste a taxa de fluxo de gás para diminuir o borbulhamento. Em seguida, conecte a armadilha de ácido à câmara de reação. Usando tentativa e erro, ajuste o fluxo de hélio corretamente, para corresponder à sucção do instrumento.Agora, inicie o software líquido baseado em programação visual. Primeiro, habilite a comunicação entre o instrumento e o software de aquisição no menu Dados e, em seguida, no menu principal do painel frontal, inicie a análise. Aguarde até que o resfriador do fotomultiplicador esfrie abaixo de 12 graus Celsius negativos e que o fotomultiplicador se estabilize.Após cerca de 30 minutos, a linha de base terá se estabilizado em 1 ou 2 milivolts. A estabilidade do valor é crítica, não o valor em si. Depois que o analisador estiver estabilizado, use uma seringa Hamilton bem lavada para injetar soluções.Primeiro, injete pelo menos três volumes diferentes do padrão de nitrito 1 micromolar. Injete as soluções na solução redutora através do septo. Injete cada padrão ou amostra duas vezes.Se forem previstos altos níveis de nitrito e amostras, considere injetar um grande quarto volume de solução de nitrito padrão para melhor determinação da inclinação da curva padrão. Sempre observe a saída e aguarde até que o analisador se estabilize novamente na linha de base antes de injetar a próxima amostra. Isso leva pelo menos um minuto.Use volumes de amostra com pico abaixo de 700 milivolts para obter resultados precisos. Entre as corridas, lave bem a seringa com água deionizada. É muito importante lavar bem a seringa.Depois que todas as medições forem feitas, pressione a opção de parada no software. Os dados serão salvos automaticamente. Pressionar abortar encerrará a medição sem salvar os dados.Feche a torneira de parada na parte superior do vaso de reação e desconecte a tubulação que conecta o coletor de ácido e o vaso de reação. Após o experimento, coloque o analisador em espera. Pressione a análise no painel principal e confirme se ela entra no modo de espera.Em seguida, desligue o suprimento de oxigênio. Desconecte a tubulação do tanque de O2 ao coletor de ácido. Em seguida, lave a solução de triiodeto com hélio.Em seguida, feche e desconecte o tanque de hélio do recipiente de reação de vidro. Por fim, limpe o recipiente com etanol e água, conforme necessário. Os padrões de teste junto com amostras de plasma mostram que imediatamente após a injeção, a tensão do fotomultiplicador aumenta e retorna à linha de base assim que todo o nitrito for reduzido, o que pode levar até um minuto.Para quantificar o sinal, uma curva padrão foi construída a partir dos padrões, usando a área sob o pico de salto de tensão. Usando a curva padrão, a quantificação das amostras foi muito reprodutível entre suas injeções duplicadas. A quimioluminescência é considerada o padrão-ouro para determinar as concentrações de nitrito.Uma vez dominado, o limite de sensibilidade para nitrito é tão baixo quanto vinte milimolares. A coisa mais importante para trabalhar com quimioluminescência é a precisão. Devido à alta sensibilidade do método, cada erro afetará o resultado final.Portanto, não tenha pressa e não se apresse. Depois que essa técnica foi desenvolvida no início dos anos 2000, ela abriu caminho para os pesquisadores explorarem as vias metabólicas do óxido nítrico e aprenderem que a deficiência de óxido nítrico está causando muitas doenças, especialmente doenças cardiovasculares.

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Biology

Biologia

A produção endógena de óxido nítrico (NO) regula uma grande variedade de funções biológicas. Está se tornando cada vez mais claro que a ruptura ou desregulagem de sinalização NO base está envolvida em muitas doenças humanas. Os métodos para quantificar relevante metabólitos podem fornecer novos biomarcadores de diagnóstico ou de prognóstico para a doença humana.

Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

Os níveis da molécula inflamatória de sinalização celular óxido nítrico (NO) são comumente testados usando o reagente de Griess. Neste protocolo, criamos um ensaio de Griess modificado utilizando tecido cerebral vivo de Drosophila para detectar a secreção de NO em um método simples, quantificável e altamente repetível.

Novo ensaio quantitativo de tecido total dos níveis de óxido nítrico na resposta neuroinflamatória de Drosophila

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil adaptados usando o corante de fluorescência diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) para en face detecção simultânea e visualização de óxido nítrico intracelular (NO) e ânion superóxido (O 2 .- ), respectivamente, em aortas isoladas de fresco intactas de um modelo de rato de obesidade.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Trabalhos anteriores sugerem que a composição isotópica de nitrogênio dos óxidos de nitrogênio atmosféricos pode distinguir a influência de diferentes fontes no ambiente. Relatamos um método automatizado, móvel e baseado em campo para a alta eficiência de coleta de NOx atmosférico para análise isotópica de N em uma resolução de tempo horário.

Automatizado, de alta resolução Sistema de Coleta Móvel para a análise de azoto isotópica de NO<sub&gt; x</sub

Este paper descreve os protocolos de fumigação de óxido nítrico (NO) para controle de pragas pós-colheita. Câmaras de fumigação são liberadas com nitrogênio (N2) para estabelecer as condições de oxigênio ultralow antes não é injetado. No final, câmaras são liberadas com N2 para diluir n antes de expor produtos para ar ambiente, para evitar a exposição ao n. º2.

Procedimentos de laboratório de fumigação para controle de pragas com gás de óxido nítrico

Α-hidroxilação de nitrosaminas cancerígenas pelo citocromo P450s é a aceita via metabólica que produz o DNA de danos intermediários, que causam mutações. No entanto, novos dados indicam mais pode ocorrer oxidação para nitrosamides. Descrevemos um general método para a detecção de nitrosamides produzidos a partir de em vitro citocromo P450-catalisada metabolismo de nitrosaminas.

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Uma série de métodos para determinar a taxa potencial de DNRA com base em 14NH4+/15NH4+ análises é fornecida em detalhes. NH4+ é convertido em N2O através de várias etapas e analisado usando cromatografia de gás quadrupole-espectrometria de massa.

Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em 14NH4+/15NH4+ Análises via Conversão Sequencial para N2O

Apresentamos protocolos para três métodos diferentes para a homogeneização de quatro diferentes grupos musculares de tecido muscular esquelético de ratos para medir e comparar os níveis de nitrato e nitrito. Além disso, comparamos diferentes pesos amostrais para investigar se o tamanho da amostra tecidual afeta os resultados da homogeneização.

Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Este protocolo descreve um método para quantificar a produção de óxido nítrico (NO) em culturas epiteliais das vias aéreas diferenciadas na interface ar-líquido (ALI), medindo nitrito em secreções apicais usando um ensaio de quimioluminescência baseado em triiodeto.

Medição da produção de óxido nítrico em culturas celulares epiteliais traqueais de camundongos diferenciadas na interface ar-líquido

Aprenda a quantificar óxido nítrico em amostras biológicas por quimioluminescência, medindo níveis de nitrito e nitrato com soluções redutoras de triiodeto e cloreto de vanádio. Este método sensível permite rastrear o metabolismo do NO.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência (Vídeo) | JoVE Journal

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

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