Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

O objetivo deste protocolo é usar quimioluminescência para quantificar o óxido nítrico em amostras biológicas, quantificando os níveis de nitrito e nitrato, usando soluções redutoras de triiodeto e cloreto de vanádio. Este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para rastrear o metabolismo e a sinalização do óxido nítrico, tanto regional quanto longitudinalmente a partir de uma variedade de amostras biológicas. A principal vantagem desta técnica é sua simplicidade e alta sensibilidade.

Demonstrando este procedimento estará Katelyn Cassel, nossa bolsista IRTA. Ela nos mostrará como medir o nitrito por quimioluminescência acoplada à solução de triiodeto. Para começar, faça uma solução de preservação de nitrito.

Preparar uma solução contendo um NEM 118 milimolar e um ferrocianeto de potássio 890 milimolar em água destilada. Dissolva os sólidos até que a solução fique amarela clara, sem cristais. Em seguida, adicionar esta solução à NP 40 numa relação volume a volume de 9 para 1.

Misture a solução delicadamente para evitar a formação de espuma. Nunca vórtice esta mistura. A solução de preservação de nitrito pode ser usada por cerca de uma semana se armazenada a 4 graus Celsius.

O protocolo pode ser usado em muitas amostras biológicas recém-obtidas. Neste caso, o sangue recém-coletado foi centrifugado para obter uma amostra de plasma para teste. É muito importante processar sangue ou quaisquer amostras biológicas contendo uma grande quantidade de proteínas heme, como hemoglobina ou mioglobina, o mais rápido possível, porque as proteínas heme reagirão com o nitrito e destruirão o nitrito.

Agora, para preservar a maior parte do nitrito sanguíneo endógeno, misture imediatamente o plasma com uma solução de preservação de nitrito em uma proporção de 1 a 4 volume por volume. Durante qualquer etapa desta preparação, a amostra pode ser congelada em gelo seco. Para desproteinar a amostra, misture-a com uma parte igual de metanol frio.

Em seguida, centrifugue a amostra a 13000 G por 15 minutos a 4 graus Celsius para precipitar proteínas. Pegue o sobrenadante e use-o para medição de nitrito. Para uma medida sensível de nitrito, uma solução redutora de triiodeto é considerada mais eficaz.

Ao prepará-lo, certifique-se de que todos os cristais se dissolvam. Mantenha a solução em um frasco escuro e use-a dentro de uma semana após o preparo. Uma solução redutora de cloreto de vanádio oferece a maior precisão para medir nitrato.

Uma solução 1 micromolar de nitrito é usada para determinar a curva padrão para nitrito, bem como nitrato. Configure o analisador de óxido nítrico de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro, abra o tanque de oxigênio, ligue o instrumento e conecte-o a uma armadilha de ácido, que contém um molar de hidróxido de sódio.

Em seguida, abra o tanque de hélio e conecte a câmara de reação de vidro ao tanque de hélio. Agora, carregue a câmara de reação com solução de triiodeto para medição de nitrito. Adicione agente antiespumante.

Ajuste a taxa de fluxo de gás para diminuir o borbulhamento. Em seguida, conecte a armadilha de ácido à câmara de reação. Usando tentativa e erro, ajuste o fluxo de hélio corretamente, para corresponder à sucção do instrumento.

Agora, inicie o software líquido baseado em programação visual. Primeiro, habilite a comunicação entre o instrumento e o software de aquisição no menu Dados e, em seguida, no menu principal do painel frontal, inicie a análise. Aguarde até que o resfriador do fotomultiplicador esfrie abaixo de 12 graus Celsius negativos e que o fotomultiplicador se estabilize.

Após cerca de 30 minutos, a linha de base terá se estabilizado em 1 ou 2 milivolts. A estabilidade do valor é crítica, não o valor em si. Depois que o analisador estiver estabilizado, use uma seringa Hamilton bem lavada para injetar soluções.

Primeiro, injete pelo menos três volumes diferentes do padrão de nitrito 1 micromolar. Injete as soluções na solução redutora através do septo. Injete cada padrão ou amostra duas vezes.

Se forem previstos altos níveis de nitrito e amostras, considere injetar um grande quarto volume de solução de nitrito padrão para melhor determinação da inclinação da curva padrão. Sempre observe a saída e aguarde até que o analisador se estabilize novamente na linha de base antes de injetar a próxima amostra. Isso leva pelo menos um minuto.

Use volumes de amostra com pico abaixo de 700 milivolts para obter resultados precisos. Entre as corridas, lave bem a seringa com água deionizada. É muito importante lavar bem a seringa.

Depois que todas as medições forem feitas, pressione a opção de parada no software. Os dados serão salvos automaticamente. Pressionar abortar encerrará a medição sem salvar os dados.

Feche a torneira de parada na parte superior do vaso de reação e desconecte a tubulação que conecta o coletor de ácido e o vaso de reação. Após o experimento, coloque o analisador em espera. Pressione a análise no painel principal e confirme se ela entra no modo de espera.

Em seguida, desligue o suprimento de oxigênio. Desconecte a tubulação do tanque de O2 ao coletor de ácido. Em seguida, lave a solução de triiodeto com hélio.

Em seguida, feche e desconecte o tanque de hélio do recipiente de reação de vidro. Por fim, limpe o recipiente com etanol e água, conforme necessário. Os padrões de teste junto com amostras de plasma mostram que imediatamente após a injeção, a tensão do fotomultiplicador aumenta e retorna à linha de base assim que todo o nitrito for reduzido, o que pode levar até um minuto.

Para quantificar o sinal, uma curva padrão foi construída a partir dos padrões, usando a área sob o pico de salto de tensão. Usando a curva padrão, a quantificação das amostras foi muito reprodutível entre suas injeções duplicadas. A quimioluminescência é considerada o padrão-ouro para determinar as concentrações de nitrito.

Uma vez dominado, o limite de sensibilidade para nitrito é tão baixo quanto vinte milimolares. A coisa mais importante para trabalhar com quimioluminescência é a precisão. Devido à alta sensibilidade do método, cada erro afetará o resultado final.

Portanto, não tenha pressa e não se apresse. Depois que essa técnica foi desenvolvida no início dos anos 2000, ela abriu caminho para os pesquisadores explorarem as vias metabólicas do óxido nítrico e aprenderem que a deficiência de óxido nítrico está causando muitas doenças, especialmente doenças cardiovasculares.