Name: Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados para neuroquímicos Markers (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a recuperar a morfologia neuronal usando enchimento com biocitina e imunocoramento sequencial. Este método permite identificar marcadores neuroquímicos em neurônios registrados por patch clamp, reduzindo a perda de dados em estudos eletrofisiológicos.

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Os autores gostariam de agradecer o apoio do NIH / NINDS R01 NS069861 e NJCBIR CBIR14IRG024 para VS.

1. biocitina enchimento durante Eletrofisiologia NOTA: Os leitores podem se referir a fontes alternativas de técnicas básicas de patch-clamp gravação e instrumentação 19-22, que não são elaborados em cima aqui. As etapas detalhadas aqui supor que o equipamento e os procedimentos para as gravações de patch-clamp já estão estabelecidos, e a descrição será restrito aos detalhes relacionados com biocitina-enchimento e imunocoloração post-hoc. Todas as experiências descritas neste manuscrito foram realizadas em ratazanas. <ol><li> Usando um vibratome, preparar secções de cérebro vivo da região desejada, com uma espessura de 300-350 uM 23. </li><li> Prepara-se uma solução contendo 0,2% interna biocitina por adição de 2 mg de biocitina a 1 ml de solução interna 6. Para melhores resultados, sonicar a solução interno de 10 - 15 minutos até que a biocitina dissolve-se completamente. Em seguida, carregar a solução interna numa seringa de 1 ml, equipado com um 0,2 &amp;# 160; de poro ponta de filtro de tamanho de polipropileno ligado a um microloader. Manter esta seringa de carga em uma mala de frio para manter a estabilidade do Mg-ATP e GTP-Na na solução interna. NOTA: Uma gluconato de potássio solução interna contendo (mM de K-gluconato 126, KCl 4 mM, HEPES 10 mM, 4 mM de Mg-ATP, 0,3 mM de Na-GTP, e fosfocreatina 10 mM) é óptima para a recuperação de certos marcadores neuroquímicos, incluindo parvalbumina, durante imunomarcação. Na nossa experiência, utilizando cesium- e soluções internas à base de cloreto reduz a capacidade de recuperar a imunocoloração para determinados marcadores neuroquímicos. Neurobiotin ou um, fixável, traçador polar célula-impermeabilizante combinando um fluoróforo com Alexa biocitina pode ser usado como uma alternativa para biocitina. </li><li> De acordo com contraste de interferência diferencial de infravermelhos, visualizar a célula apropriado para gravação. Para minimizar qualquer interrupção do axônio, a abordagem do corpo celular, diminuindo a pipeta ao longo de seu eixo, utilizando o "approach" função disponível na maioria dos micromanipuladores. Estabelecer gravações de célula inteira sob contraste de interferência diferencial de infravermelho usando protocolos fisiologia de patch-clamp 19-22. NOTA: Evitar a aproximar-se da célula a partir da direcção do axónio putativo, uma vez que irá cortar o axónio, visualizado como uma vesícula na extremidade de corte (seta verde na Figura 1). Além disso, evitar a aplicação de alta pressão positiva para a pipeta de gravação, enquanto que se aproxima da célula para minimizar o derrame de biocitina, o que resultará na coloração de fundo elevado. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig1.jpg"> Figura 1. Sugestão de avião para se aproximar de células para biocitina preenchimentos. A imagem ilustra um celular Granule (GC) encher com biocitina durante a gravação que foi processada para revelar biocitina (em vermelho usando estreptavidina 594 conjugado). O GC tem suas dendrites orientadas no plano XY. Observe a célula granular cortadaaxônio (seta verde) devido ao movimento da pipeta ao longo do plano XY. Note que é ideal para abordar este neurônio ao longo do plano XZ. Barra de escala: 50 ^ m. <ol start="4"><li> Na configuração de fixação de voltagem, determinar a capacitância de células inteiras e resistência em série, em resposta a pequenas (5 mV), breves (30 ms) tensão etapas usando o teste usando a função da membrana no modo de banho em uma aquisição de dados e software de análise de electrofisiologia. Isto irá assegurar o estabelecimento de condições de gravação de célula inteira para permitir biocitina-enchimento. </li><li> Realizar gravações fisiológicas no modo quer observação de correntes ou de tensão-clamp, conforme necessário. Um mínimo de tempo de gravação de&gt; 10 min a 34 ° C é ideal. NOTA: Longer tempos de gravação podem ser necessários para os exames realizados à temperatura ambiente. </li><li> Após a conclusão das gravações fisiológicas, re-estabelecer a configuração de patch-clamp, movendo-se lentamente a pipeta de gravação em pequenas etapas, alternadas para cima (ao longo do eixo Z) epara fora (ao longo do eixo X) no modo de voltagem-grampo. </li><li> Simultaneamente monitorar a capacitância e entrada de resistência utilizando a função "membrana teste" para visualizar a perda de transientes capacitivo eo colapso das respostas atuais para uma linha reta, indicando a re-vedação da célula e o estabelecimento de um fora-out- remendar na ponta da pipeta. Segurando o celular em um potencial despolarizado (-40 mV) facilitará o processo de vedação re-. NOTA: Este procedimento para a remoção de uma célula normalmente garante a recuperação completa do soma e dendritos. Não aplicar pressão positiva para a pipeta de gravação durante este processo ou durante a separar a célula a partir da pipeta. Visualização da soma da célula registrado na fatia indica desligamento bem sucedido. A presença de fragmentos celulares ou um remendo de membrana na extremidade da ponta individual geralmente indica o deslocamento do soma e não irá produzir a morfologia celular completa. </li><li> à réer separar da pipeta a partir da célula, reter a fatia na câmara de gravação para 3-5 min para garantir o transporte do corante para dendrítica distal e processos axonais. </li><li> Transferir as fatias para uma placa de 24 poços contendo PFA a 4% para a fixação. CUIDADO: PFA é cancerígeno, e equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas e uma máscara facial, deve ser usado para evitar a irritação da pele e inalação. PFA é inflamável e devem ser mantidos fora do alcance de fogo. PFA nunca é descartado no ralo e deve ser coletado como lixo químico. PFA fixação deve ser isolado a partir de superfícies utilizadas para a preparação fatia vivo para evitar a contaminação da instalação fisiologia, incluindo pipetas de transferência. </li><li> 24 - 48 h após a fixação PFA, transferir as fatias de 0,1 M de fosfato salino tamponado (PBS) para armazenamento antes da imunocoloração. NOTA: Idealmente, biocitina recuperação e imunocoloração são melhores quando realizada logo após a fixação, embora por coloração formado dentro de 7 d de rendimentos de fixação bons resultados. As fatias podem ser mantidas em PBS com 0,02-0,05% de azida de sódio para a coloração e realizada até mais de 90 dias após a fixação. Embora a fixação durante a noite em PFA funciona bem para a maior parte dos anticorpos, é possível que alguns anticorpos funcionam melhor quando a duração da incubação no fixador é diminuído. Fixação em PFA durante mais 48 h reduz a disponibilidade de antigénios e diminui a probabilidade de sucesso para a imunocoloração secundário marcadores neuroquímicos. CUIDADO: A azida de sódio é extremamente perigoso e irritante em contacto com a pele ou com os olhos ou a ingestão ou inalação. Grave excesso de exposição pode resultar em morte. A carcinogenicidade e mutagenicidade do composto não são conhecidos. Use equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas, óculos contra respingos, um jaleco e um respirador de poeira. A azida de sódio nunca é descartado no ralo e deve ser coletado como lixo químico. </li></ol>e_title "&gt; 2. A coloração do primeiro anticorpo primário e biocitina (Dia 1) NOTA: O seguinte procedimento é imunocoloração para secções de flutuação livre e requer agitação continua a uma velocidade baixa (2 revoluções / min, rpm) num agitador durante todas as etapas de incubação. <ol><li> Lavar o tecido 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4). NOTA: PBS 0,1 M podem ser comercialmente adquiridas ou feitas em laboratório, como se segue (faz 1 L): 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,24 g de KH 2 PO 4 em 1 L de dH 2 0. NOTA: Se o marcador neuroquímica desejado é conhecido, a coloração por uma proteína / péptido pode ser realizada simultaneamente com coloração de biocitina (passos 2,2-2,4). Se coloração para biocitina somente, vá para o passo 2.5. </li><li> OPCIONAL: Bloco com 10% de soro de bloqueio (BS; soro normal de cabra (NGS) diluído em 0,3% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à TA). NOTA: Cada poço devereceber o mesmo volume da solução; o volume recomendado é de entre 250-500 mL / poço. A selecção do soro de bloqueio baseia-se nas espécies em que os anticorpos secundários são levantadas (por exemplo, NGS é usado para anti-cabra conjugado com corante (respectivas espécies de anticorpo primário)). Se surgir a necessidade de utilizar anticorpos secundários criados em diferentes espécies de imunocoloração secções, incluem 10% de cada soro normal no bloqueio de fase (2) e 3% de cada soro normal para os passos de incubação do anticorpo primário e secundário. </li><li> (OPCIONAL) Incubar as secções em anticorpo primário, CB 1 R (policlonal, cobaia) com 0,3% de Triton X-100, e 3% de BS em PBS a 0,1 M, à TA S / N. CB R 1 é utilizado para identificar o tipo de receptor canabinóide uma expressão. NOTA: Este passo é opcional e não é necessário para revelar o recheio biocitina. A Figura 2 ilustra uma secção marcada por biocitina e CB 1 R durante o primeiro processo de coloração. O / N incubation à TA é suficiente para a maioria dos anticorpos primários; no entanto, certos anticorpos primários, incluindo CB 1 R, requerem 3-5 d de incubação. Se a incubação precisa ser mais longo do que 1 d, recomenda-se a incubar a 4 ° C por causa de Triton X-100 pode permeabilizar fatias e pode conduzir à desintegração do tecido durante a incubação prolongada à temperatura ambiente. Incluir um controlo negativo a que falta o anticorpo primário em, pelo menos, uma secção para cada série de experiências como controlo para a especificidade do anticorpo secundário. Para controlos negativos, o anticorpo primário é omitido, mas a 0,3% de Triton X-100 em PBS a 0,1 M e são adicionados BS. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig2.jpg"> Figura 2. sucedida CCK Coloração 1 semana após a recuperação de biocitina Coloração e C annabinoid Receptor tipo 1 (CB1 R) - &lt;strong&gt; rotulagem. (A - C) As imagens confocais a 60X mostrando o neurónio encheu-biocitina (A) e CB 1 R imunorreactividade (B), indicado pela seta. A mesma secção foi processada para a imunocoloração CCK após 1 semana (C). A sobreposição de imagens é mostrado na D. CCK imunorreatividade foi revelado usando far-vermelho e foi pseudo-colorido em ciano. (E) a reconstrução morfológica da célula-cheia biocitina em A. Observe que a biocitina e CB 1 R coloração são evidentes mesmo após a segunda imunocoloração CCK. Observe também a distribuição esperada de CB 1 R e padrões de positividade CCK. (F - H) imagem ampliada do axônio da célula, como em A, show de perto co-localização de biocitina e CB 1 R nos axônios (cabeças de seta). Barra de escala: 50 um (A - D), 100 um (E), e 10 uM ( et al. 2015 9. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> (Dia 2) <ol start="4"><li> Lava-se a secções do cérebro 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4). </li><li> Incubam-se as secções em estreptavidina conjugado de corante vermelho (concentração: 1: 1000; excitação: 594 nm com emissão no espectro vermelho visível) com 0,3% de Triton X-100 e 3% de BS em PBS a 0,1 M a 4 ° CO / N na escuro (embrulhados em papel alumínio) para revelar o biocitina. Opcional: inclua um anticorpo secundário, cabra porco anti-guiné (concentração: 1: 500; excitação: 488 nm e emissão em verde), com a incubação acima, se após a primeira incubação opcional na etapa 2.3. NOTA: anticorpo secundário será apenas necessário se a coloração de anticorpo primário opcional (passo 2.3) é executada. Para visualizar biocitina, um streconjugado ptavidin-fluoróforo com um espectro de emissão em vermelho é recomendado, uma vez que ajuda a visualizar os axônios mais finas em detalhe e com melhor contraste (Figuras 1 - 3). Durante a imunocoloração dupla ou tripla, a fim de evitar a reactividade cruzada de anticorpos secundários uns com os outros, anticorpos secundários adicionar uma após a outra em série (2 h de intervalo entre adições de série dos anticorpos é suficiente). A Figura 3A ilustra uma célula cheia de biocitina processadas sem o anticorpo primário coloração opcional e fotografada antes da ressecção. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig3.jpg"> Figura 3. sucesso Segundo imunocoloração após a recuperação de biocitina Morfologia e ressecção. (A1) confocal imagem de uma fatia de 300 mm que mostra a recuperação da morfologia dendrítica de uma célula cheia de biocitina. (&lt;strong&gt; A2) traços de tensão membrana do neurônio em resposta a +500 e -100 pA injeções atuais. (B) A recuperação da soma cheio de biocitina em uma seção 50 mm obtido após ressecção da secção 300 mm (na A1) após a montagem e imagem. (B2) imunocoloração subsequente da seção fina revelou co-localização da soma cheio de biocitina (painel à direita) com CCK (painel do meio). A imagem mesclada é ilustrado no painel da direita. Barra de escala: 50 ^ m. Painel A2 é reproduzido com permissão de Yu et al. , No prelo 25. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> (Dia 3) <ol start="6"><li> secções cerebrais Lavar 3x durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4). </li><li> Para proteger a fluorescência e para facilitar a re-coloração no futuro, montar o segções em um meio de montagem de base aquosa e selar as bordas da lamela com unhas polonês claro. NOTA: É melhor restain seções o mais cedo possível para evitar dificuldades na remoção da unha polonês a partir do slide, infestação de fungos, e desidratação do tecido devido à fuga do meio de montagem da lâmina de vidro. A contaminação microbiana pode ser prevenida utilizando 0,02% de azida de sódio em PBS. CUIDADO: A azida de sódio é altamente tóxico e inflamável quando está em contacto com a água. Por favor, consulte os procedimentos operacionais padrão para o manuseio e descarte de produtos químicos perigosos. (Dias 4 - 7) </li><li> Realizar imagem confocal com excitação a 594 e 488 nm e com uma ampliação de 20X ou 40X para revelar neurônios cheio de biocitina em marcadores vermelhos e neuroquímicas (CB 1 R) em verde. Avaliar colabeling (Figura 2). </li><li> Definir a exposição da câmera para menos de 100 ms para evitar a fotodegradação e obtaem pilhas de imagens confocal dos mandris axonais e dendríticas de todo o neurônio. Use pilhas de imagens confocal e pacotes de software de rastreamento de neurônios para reconstruir a morfologia neuronal. </li></ol> 3. Coloração de o segundo anticorpo primário Nota: Embora o segundo passo pode ser realizado imunocoloração 90 d após a primeira coloração, coloração óptima é conseguida, se a segunda coloração de anticorpo primário é realizada dentro de 7-10 d. (Depois de 7-90 d) <ol><li> Aplicar acetona para um cotonete e tira a unha polonês fora da lâmina de vidro. </li><li> Retirar as lamelas com cuidado usando uma pinça de ponta fina e coloque algumas gotas de 0,1 M PBS nas seções. </li><li> Remova cuidadosamente as seções do slide usando um pincel fino e lavá-los em 0,1 M PBS durante 24 - 48 h num agitador coberto de folha de alumínio com pouca luz a 4 o C. NOTA: É crucial para cobrir seções com umfolha luminum para evitar a fotodegradação. </li><li> Para assegurar a remoção completa do meio de montagem, lavar as secções 1 - 2x no dia seguinte em PBS a 0,1 M durante 10 min cada. </li><li> Prosseguir com incubação no segundo anticorpo primário (por exemplo, a colecistocinina, um neuropeptídeo encontrado em certos interneurónios sensíveis a GABA (CCK; concentração: 1: 1000; anticorpo monoclonal de ratinho)) para um d (Figura 2). NOTA: Este procedimento é semelhante para a etapa 2.3, mas utiliza um anticorpo diferente. Além disso, o passo de bloqueio for omitido durante a re-coloração. </li><li> Lavam-se as secções de cérebro três vezes durante 10 minutos cada em PBS 0,1 M (pH = 7,4). </li><li> Mancha com o secundário anticorpo de cabra anti-ratinho fluoróforo-conjugado (concentração: 1: 500; de excitação comprimento de onda: 647 nm), certificando-se que os espectros de excitação das emissões do anticorpo secundário não se sobrepõem com estreptavidina (concentração: 1: 1000; comprimento de onda de excitação: 594 nm) e imunofluorescência préviamanchas. </li><li> Montar as seções no meio de montagem aquoso e selar as bordas da lamínula com unhas polonês claro. Nota: Armazenar as secções a 4 ° C numa caixa de armazenamento de opaco para proteger a fluorescência. </li></ol>

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<li>Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizure-induced+alterations+in+fast-spiking+basket+cell+GABA+currents+modulate+frequency+and+coherence+of+gamma+oscillation+in+network+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Chaos%22%5BJournal%5D)">Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations.</a> Chaos. 23 (4), 046109(2013).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Passos críticos dentro do Protocolo Encher a célula remendado com biocitina é o passo mais crucial para garantir a recuperação completa da morfologia. Para a completa recuperação da célula, é essencial para seleccionar uma orientação fatia ideal para minimizar o rompimento de processos durante o corte. Esta orientação pode variar de acordo com o tipo de circuito e celular em exame. Em seguida, é essencial para que haja tempo suficiente para o biocitina para difundir os dendr...

O cérebro é conhecido pela diversidade das características estruturais e funcionais dos seus elementos neuronais individuais. Compreender os papéis de tipos neuronais distintas na função cerebral e patologia exige caracterização e identificação inequívoca dos neurônios. Estruturalmente, as características morfológicas definidos pela localização somato-dendrítica determinar as potenciais entradas que um determinado neurônio recebe, enquanto o padrão de arborização axonal identifica alvos potenciais pós-sinápticos. A diversidade estrutural dos neurônios tem sido apreciado desde os dias de estudos histológicos seminais do Ramón y Cajal 1. O advento das técnicas de gravação de uma única célula revelou que os neurônios estruturalmente distintos também mostram diferenças nos padrões de disparo e características sinápticas. A diversidade na estrutura e fisiologia é particularmente evidente em GABAérgicos neurónios inibitórios 2,3. Além disso, tornou-se cada vez mais evidente que structurallneurônios semelhantes y podem expressar diferentes marcadores neuroquímicos e mostrar correspondentes diferenças funcionais 4. Da mesma forma, os neurónios com os mesmos marcadores neuroquímicos podem ter estruturas e funções distintas 5-10. Assim, na prática, a análise das características funcionais de neurónios e o seu papel na rede requer a definição ambas as identidades morfológicas e neuroquímicas. Mesmo com o advento de linhas de ratinhos repórter segmentação marcadores neuroquímicos específicos, muitas vezes é necessário para determinar a morfologia e a identidade subtipo baseado em 11 imunohistologia. O método padrão utilizado para caracterizar células registrados em fatias cerebrais agudas é para os encher biocitina ou neurobiotin durante a gravação, corrigir as seções de paraformaldeído (PFA), seguindo as gravações, e usar a imunohistoquímica para revelar a morfologia e neuroquímica. Uma vez que a espessura das secções para a fisiologia fatia são tipicamente 300 mmou mais, e porque a maioria dos anticorpos não conseguem penetrar todo o caminho através do que a profundidade, as fatias devem ser re-seccionados a 60 um ou menos, para permitir a imunocoloração simultânea para biocitina e marcadores neuroquímicos 12-14. Infelizmente, é trabalhoso ressecção; corre o risco de perda de tecido durante o corte; e pode conduzir a diferenças de encolhimento do tecido, o que complica reconstruções morfológicas. Além disso, o conhecimento prévio da morfologia poderia ajudar a diminuir os marcadores candidatos que são susceptíveis de ser expressa pelas células. Temos modificado os protocolos imunohistologia biocitina padrão para permitir o processamento em série de secções em primeiro lugar para a recuperação de morfologia e, em seguida, para a identificação de potenciais marcadores neuroquímicos. A imuno-histoquímica é o estudo de distribuição de antigénio em células ou tecidos e pode ser visualizada utilizando uma enzima, marcadores fluorescentes, elementos radioactivos, ou partículas coloidais de ouro 15. O procedimento involves usando anticorpos primários para marcar especificamente e amplificar um ou mais antigénios específicos, seguido pela utilização de anticorpos secundários fluorescentes segmentação do anticorpo primário para visualização. Devido à necessidade de diferenciar os espectros de fluorescência de cada anticorpo secundário sem sobreposição, apenas um número limitado de antigénios podem ser examinados simultaneamente. Assim, o conhecimento prévio da morfologia poderiam ser úteis para seleccionar os marcadores neuroquímicos candidatos para a classificação de células. Conceptualmente, a razão de processamento em série de secções coradas já baseia-se na premissa de que imunomarcação para uma proteína ou péptido não deve interferir com a antigenicidade e imunomarcação subsequente para um péptido estruturalmente independente 16. Esta falta de interferência é devido à ligação dos anticorpos para um epítopo da proteína específica num antigénio e, portanto, permite a coloração simultânea de múltiplos antigénios no mesmo tecido. O número de antigénios revealed por imunocoloração é limitada pela necessidade de espectros de não sobreposição dos anticorpos secundários fluorescentes e pela necessidade de direccionar antigénios individuais com anticorpos criados em diferentes espécies de modo a eliminar a reactividade cruzada 17,18. Enquanto este é o raciocínio por trás de rotulagem de série em vez de em simultâneo com dois anticorpos diferentes que podem interagir, a nosso conhecimento, imunocoloração para um segundo antigénio não foi relatado após a conclusão da imunomarcação para um ou mais antígenos em seções montadas. Aqui, descrevemos um método para imuno série de secções previamente coradas e montadas. Embora pormenor este processo para um processo de imunomarcação de série para a recuperação da morfologia seguido por coloração para marcadores de proteína / péptido em secções espessas, os mesmos procedimentos podem ser usados ​​no padrão, secções histológicas finas bem. Além disso, descreve-se uma abordagem prática para encher neurónios gravados com biocitina e o processo para desalojar oeléctrodo da célula após a conclusão de gravações para optimizar o enchimento do axonal e mandris dendríticas de neurónios, tal como apresentado na nossa recente 6,8 trabalho. A vantagem mais importante do processo aqui descrito é que a morfologia da célula gravado pode ser totalmente recuperado e fotografada antes de tentar a ressecção ou imunocoloração das fatias. Embora os problemas com a penetração de determinados anticorpos podem tornar necessária a fatias de ressecção para imunocoloração secundário, os procedimentos detalhados aqui iria eliminar a necessidade de reconstruir neurónios complexos de múltiplas secções e evitar problemas devido à perda de tecido e o encolhimento diferencial, o que pode comprometer a reconstrução seguinte ressecção. Uma vantagem adicional é que o processo irá reduzir custos, tempo, esforço e anticorpos caros, limitando imunocoloração e re-corte às fatias em que os neurônios-cheia biocitina são recuperados. O aspecto mais prático é o anúncioimunocoloração nal que pode ser realizada em secções coradas meses antes de usar a técnica acima mencionada. Em particular, a recuperação da morfologia reduziria consideravelmente o potencial que os dados fisiológicos das células é rejeitado devido a uma incapacidade para obter uma caracterização morfológica básica do tipo de célula.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fluka</td><td>60129</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>229806</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>para porquinho da Índia anti CB1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Af530-1</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Mouse anti CCK</td><td>CURE, UCLA</td><td>cortesia de G. Ohning</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Rabbit anti Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>PV27</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor conjugado</td><td>Sondas moleculares</td><td>S11227</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS)</td> <td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Vectashield&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td>Secundários Invitogen Sondas</td><td>moleculares Alexa Corantes conjugados com flúor</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>Labnet orbit agitador de baixa velocidade</td><td>Bioexpress</td><td>S-2030-LS</td><td>Pinça de imunocoloração</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>11231-30</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>Pastas de lâminas</td><td>EMS</td><td>71520</td><td>Imunocoloração</td></tr><tr><td>Vibratome VT 1200 S</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B amplificador</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Software</td><td>Molecular devices</td><td>pCLAMP 10&nbsp;</td><td>Eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440 digitizer</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Filter tips</td><td>Nalgene</td><td>171-0020</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-335-100</td> Microloaders <td>de Eletrofisiologia</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td>Eletrofisiologia</td></tr></tbody></table>

imunocoramento secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos markers

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

registos electrofisiolicos de células utilizando a técnica de fixação de membranas permitiram a identificação de diferentes tipos neuronais com base em padrões de disparo. A inclusão de biocitina / neurobiotin no eletrodo de gravação permite a recuperação post-hoc de detalhes morfológicos, que são necessários para determinar a arborização dendrítica e as regiões abrangidas pelos axônios dos neurônios registrados. No entanto, dada a presença de neurônios morfologicamente semelhantes com identidades distintas neuroquímicos e funções, coloração imuno-histoquímica de proteínas específicas de células-type-é essencial para identificar definitivamente neurônios. Para manter a conectividade de rede, secções do cérebro para gravações fisiológicas são preparadas com uma espessura de 300 nm ou mais. No entanto, esta espessura muitas vezes dificulta pós-processamento imuno devido a problemas com a penetração de anticorpos, sendo necessária a ressecção do tecido. Ressecção de fatias é uma arte difícil, muitas vezes ResulTing na perda de tecido e morfologia das células a partir do qual foi obtido dados electrofisiológico, tornando os dados inutilizável. Uma vez que a recuperação da morfologia iria limitar a perda de dados e guia na selecção de marcadores neuronais, adoptámos uma estratégia de recuperar a morfologia celular em primeiro lugar, seguido de imunocoloração secundário. Nós introduzimos uma abordagem prática para biocitina enchimento durante as gravações fisiológicas e subsequente imunocoloração de série para a recuperação da morfologia, seguido pelo restaining de secções para determinar a identidade neuroquímica. Relatamos que as secções que foram preenchidos com biocitina, fixadas com paraformaldeído (PFA), coradas, e lamínulas pode ser removida e corada novamente com um segundo anticorpo primário dias posteriores. Este restaining envolve a remoção da lamela, a lavagem das secções em uma solução tampão, e a incubação de anticorpos primários e secundários para revelar a identidade neuroquímica. O método é vantajoso para eliminar DATuma perda devido a uma incapacidade de recuperar morfologia e para estreitar os marcadores neuroquímicos a ser testados com base na morfologia.

Após a conclusão, as secções mantêm o preenchimento biocitina e a imunomarcação realizado no Passo 2 e pode ser fotografada usando confocal ou microscopia de epifluorescência. Além disso, as secções processadas também vai mostrar a imunocoloração para o antigénio marcado durante o processamento subsequente na etapa 3. Na secção ilustrada na Figura 2, a morfologia de um neurónio encheu-biocitina numa secção grossa (300 um) foi revelada utilizando estreptavidina visualizad...

Este protocolo apresenta um método para a recuperação morfológica dos neurónios durante patched registos electrofisiolicos utilizando biocitina de enchimento e de pós-processamento subsequente imuno-histoquímica. Mostramos que as seções encheu-biocitina grossas que estavam manchados e lamínulas pode ser restained com um segundo dia de anticorpos primários ou meses mais tarde.

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

O objetivo deste protocolo é apresentar um método eficiente para identificar neurônios corrigidos durante registros eletrofisiológicos usando biocitina e imunocoloração para recuperação da morfologia antes da recoloração com anticorpos específicos para determinar a identidade neuroquímica. Portanto, este método descreve um passo importante necessário para estudar a diversidade na estrutura e função neuronal. Isso é essencial para entender seu papel nas redes cerebrais.A principal vantagem de usar técnicas de processamento sequencial é que ela elimina a perda de dados devido à incapacidade de recuperar a morfologia. Portanto, isso também ajuda a orientar os marcadores neuroquímicos a serem testados nessas células. Embora este método seja descrito para recuperação morfológica de células em seções espessas, ele também pode ser aplicado a seções finas e em amostras previamente coradas e montadas.Geralmente, os neutros novos neste método podem ter dificuldade em selar novamente o soma enquanto se desprendem da célula e podem não permitir tempo adequado para preenchimentos bem-sucedidos. A demonstração visual deste método é crítica, pois são necessárias técnicas específicas para o preenc

immunostaining-biocytin-filled-processed-sections-for-neurochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Grande escala imunodetecção de proteínas-alvo em todo o cérebro dos primatas é possível através do emprego de tecido romance incorporação e secção métodos combinados com o uso de aparelhos criativas para a coloração de vários lotes de livre flutuação seções em um determinado momento.

A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro

A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir células-tronco neurais recém-proliferadas em seções de tecido cerebral usando incorporação de EdU, seguida de imunofluorescência para visualizar proteínas específicas, melhorando a compreensão da dinâmica e proliferação celular.

Coloração por imunofluorescência para visualização de células-tronco neurais proliferadas em seções cerebrais de camundongos

Este vídeo demonstra o processo de visualização de um interneurônio preenchido com biocitina em uma seção do hipocampo de ratos, destacando sua identidade neuroquímica por meio do uso de anticorpos específicos e microscopia de fluorescência.

Imunomarcação de interneurônios em uma secção hipocampal de rato

Este vídeo demonstra a coloração imuno-histoquímica de fibras colinérgicas no núcleo basal da região de Meynert de seções cerebrais de camundongos. As seções são bloqueadas e tratadas com anticorpos primários contra colina acetiltransferase, seguidos por anticorpos secundários biotinilados. São adicionados complexos avidina-biotina-peroxidase, que se ligam a anticorpos secundários, seguidos pelo substrato cromogênico. As seções são então desidratadas e montadas antes de serem visualizadas ao...

Coloração imuno-histoquímica de fibras nervosas no núcleo basal de Meyner do cérebro de camundongo

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir fatias fixas de cérebro de rato contendo interneurônios cheios de biocitina. O protocolo inclui incubação com complexo avidina-biotina (ABC), coloração com HRP e substrato cromogênico, preservação de estruturas com tetróxido de ósmio e incorporação do tecido em resina para imagem.

Marcação de interneurônios preenchidos com biocitina em fatias de hipocampo de rato para visualização

Fonte: Núñez, F. J., et al. Avaliação de biomarcadores em glioma por imuno-histoquímica em culturas de neuroesferas de glioma 3D embebidas em parafina. J. Vis. Exp. (2019). Este vídeo demonstra uma técnica imuno-histoquímica para rotular biomarcadores tumorais em neuroesferas tumorais cerebrais embebidas em parafina. As seções da neuroesfera são submetidas à remoção e reidratação da parafina, seguida de tratamento para expor os locais dos biomarcadores. Anticorpos primários e secundários são...

Coloração imuno-histoquímica de biomarcadores em seções de neuroesferas de tumores cerebrais

Para entender a estrutura das redes neuronais, caracterização funcional e morfológica de neurônios individuais é uma necessidade. Aqui, nós demonstramos rotulagem juxtasomal biocitina, que permite que registros eletrofisiológicos na configuração extracelular, mas mantendo a capacidade de rotular intracelular do neurônio para a reconstrução post hoc de dendrítica e arquitetura axonal.

Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais

Este protocolo de nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para completar a coloração imuno-histoquímica de cérebros de roedores, usando marcadores para microglia e elementos neuronais como exemplo.

Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

O protocolo descrito aqui descreve a análise de imunofluorescência, recuperação de biocytin e reconstruções de alta qualidade de hippocampal CA2 interneurônios seguindo o intracelulares gravações eletrofisiológicas in vitro, permitindo neuronal caracterização e anatomia neuronal, finalmente, bem a ser estudado.

Recuperação de Biocytin e reconstruções 3D de CA2 Hippocampal enchido interneurônios

Aprenda a recuperar a morfologia neuronal usando enchimento com biocitina e imunocoramento sequencial. Este método permite identificar marcadores neuroquímicos em neurônios registrados por patch clamp, reduzindo a perda de dados em estudos eletrofisiológicos.

Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

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