Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

O objetivo deste protocolo é apresentar um método eficiente para identificar neurônios corrigidos durante registros eletrofisiológicos usando biocitina e imunocoloração para recuperação da morfologia antes da recoloração com anticorpos específicos para determinar a identidade neuroquímica. Portanto, este método descreve um passo importante necessário para estudar a diversidade na estrutura e função neuronal. Isso é essencial para entender seu papel nas redes cerebrais.

A principal vantagem de usar técnicas de processamento sequencial é que ela elimina a perda de dados devido à incapacidade de recuperar a morfologia. Portanto, isso também ajuda a orientar os marcadores neuroquímicos a serem testados nessas células. Embora este método seja descrito para recuperação morfológica de células em seções espessas, ele também pode ser aplicado a seções finas e em amostras previamente coradas e montadas.

Geralmente, os neutros novos neste método podem ter dificuldade em selar novamente o soma enquanto se desprendem da célula e podem não permitir tempo adequado para preenchimentos bem-sucedidos. A demonstração visual deste método é crítica, pois são necessárias técnicas específicas para o preenchimento eficaz de biocitina das células, a fim de recuperar a morfologia completa. Para iniciar este procedimento, na configuração do grampo de tensão, aplique pequenos passos breves de tensão usando a função de teste de membrana no modo banho enquanto se aproxima da célula.

Aplique na célula aplicando sucção. Em seguida, segure a célula em 70 milivolts negativos. Observe o desenvolvimento de um selo de gigaohm.

Compense os transientes capacitivos e, em seguida, aplique a sucção controlada com uma seringa ou por via oral para obter a configuração de toda a célula. Estime a capacitância da célula inteira e a resistência em série e pare os pulsos de teste de membrana. A resistência em série inferior a 10 megaohm é ideal.

Isso garantirá o estabelecimento de condições de registro de células inteiras para permitir o preenchimento de biocitina. Após a conclusão dos registros fisiológicos, restabeleça a configuração do patch clamp movendo lentamente a pipeta de registro em pequenos passos, alternando para cima e para fora no voltage clamp modo. A etapa mais crítica na realização da recuperação morfológica das células é garantir o resselamento do soma neuronal enquanto separa a pipeta de registro da célula.

Usando a função de teste de membrana, visualize a perda de transientes capacitivos e o colapso das respostas de corrente a uma linha reta, o que indica a nova vedação da célula e o estabelecimento de um remendo de fora para fora na ponta da pipeta. Enquanto isso, manter a célula em um potencial despolarizado facilitará o processo de resselamento. Depois de separar a pipeta da célula, retenha a fatia na câmara de registro por três a cinco minutos para garantir o transporte do corante para os processos dendríticos e axonais distais.

Em seguida, transfira a fatia para uma placa de 24 poços contendo 4% de PFA para fixação. 24 a 48 horas após a fixação do PFA, transfira todas as fatias fixas para PBS molar de ponto zero para armazenamento antes da imunocoloração. Neste procedimento, lave os tecidos três vezes por 10 minutos cada em PBS molar de ponto zero.

Em seguida, bloqueie os tecidos com soro bloqueador a 10% por uma hora em temperatura ambiente. Posteriormente, incube as seções em anticorpos primários CB1R à temperatura ambiente durante a noite para identificar a expressão do receptor canabinóide tipo 1. Em seguida, lave as seções cerebrais três vezes por 10 minutos cada em PBS 0,1 molar.

A estreptavidina e o anticorpo secundário para o primeiro anticorpo primário são adicionados à placa do poço e mantidos durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, incube as seções no conjugado de corante vermelho de estreptavidina a quatro graus Celsius durante a noite no escuro para revelar a biocitina. Depois disso, lave as seções cerebrais três vezes por 10 minutos cada em PBS 0,1 molar.

Para proteger a florescência e facilitar a recoloração no futuro, monte as seções em um meio de montagem igualmente espaçado. Sele as bordas das lamínulas com esmalte transparente. Nesta etapa, retire o esmalte da lâmina de vidro com um cotonete de acetona.

Remova a lamínula com cuidado usando uma pinça de ponta fina e coloque algumas gotas de PBS de 0,1 molar nas seções. É fundamental não danificar o tecido do processo ao desmontar o tecido do meio de montagem aquoso. Remova cuidadosamente as seções da lâmina usando um pincel fino e lave-as em PBS 0,1 molar por 24 a 48 horas em uma coqueteleira e mantenha-as longe da luz em quatro graus Celsius.

Para garantir a remoção completa do meio de montagem, lave as seções uma a duas vezes no dia seguinte em PBS 0.1 molar por 10 minutos de cada vez. Em seguida, incube as seções com um segundo anticorpo primário colecistocinina por um dia. Lave as seções cerebrais três vezes por 10 minutos cada em PBS 0,1 molar.

Em seguida, core as seções com um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo anti-camundongo de cabra. Certificar-se de que os espectros de emissão de excitação do anticorpo secundário não se sobrepõem à estreptavidina e às colorações imunofluorescentes anteriores. Em seguida, monte as seções em meio de montagem aquoso.

Sele as bordas da lamínula com esmalte transparente. Após o preenchimento bem-sucedido da biocitina e o primeiro processo de imunocoloração, a estrutura neuronal pode ser visualizada e visualizada conforme mostrado na imagem confocal obtida com ampliação de 60x. A seção também foi imunomarcada para CB1R junto com biocitina, e a imunomarcação de CB1R no soma neuronal que expressa a biocitina é indicada pela ponta da seta.

A mesma seção foi processada para imunorreatividade CCK após uma semana, e a imagem mostra a recuperação bem-sucedida da imunomarcação CCK em vários neurônios indicados pelo asterisco. Observe que a célula marcada com biocitina indicada pela ponta da seta não expressou CCK. Uma imagem mesclada dos painéis A, B e C mostra que todos os três rótulos são visualizados de forma robusta, e a sobreposição entre a biocitina e o CB1R é evidente.

A imagem mostra que o segundo processo de imunomarcação não compromete o sinal do processo de coloração anterior. A morfologia da célula preenchida com biocitina foi obtida a partir das imagens confocais antes desta imunocoloração CCK. Crucialmente, além do soma e do dendrito, os axônios podem ser visualizados e a co-marcação de CB1R e processos axonais marcados com biocitina é observada.

Ao tentar este procedimento, é importante atingir as células saudáveis localizadas abaixo da superfície da fatia para evitar neurônios com processos cortados. E isso pode comprometer a recuperação da morfologia. Uma vez dominada, a recuperação morfológica das células preenchidas com biocitina pode ser obtida de forma confiável durante a gravação do patch clamp.

A implementação bem-sucedida da técnica de imunocoloração serial melhorará a eficiência da recuperação de dados e facilitará a caracterização neuronal durante as gravações padrão do patch clamp. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como usar efetivamente as células cheias de biocitina para recuperar a morfologia neuronal e determinar marcadores neuroquímicos.