Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia ⁺ Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

O objetivo geral deste ensaio é enumerar e caracterizar populações de células T CD8 positivas específicas para o vírus da imunodeficiência símia geradas por vacinação ou infecção primária. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia de células T, como qual é a frequência de células T CD8 específicas do antígeno induzidas por vacinação ou infecção. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode quantificar células T CD8 específicas do antígeno em amostras biológicas obtidas diretamente ex vivo, sem a necessidade de reestimulação in vitro.

As implicações dessa técnica se estendem para a avaliação de células T CD8 específicas da incisão no macaco rhesus e para estudar as respostas das células T CDB em vários cenários de doenças. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao conhecimento incompleto disponível para a genética do MHC do macaco rhesus e porque a coloração por citometria de fluxo requer a aplicação precisa de anticorpos. Comece por ressuspender o rhesus PBMC em meio R10.

Adicione 1,6 vezes 10 à sétima concentração de células por mililitro. Alíquota de 50 microlitros de células para o número apropriado de tubos de citometria de fluxo e adicione 50 microlitros de inibidor de proteína quinase a cada tubo. Vortex cada tubo e incube as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos.

A quantidade correta de tetrâmero MHC do peptídeo titulado deve ser diluída em mistura mestre suficiente para corar todos os tubos experimentais. Portanto, é importante preparar um excesso de 15% do master mix, para levar em conta os erros de pipetagem. Enquanto as células estão incubando, coloque os agregados de proteínas na solução de tetrâmero por centrifugação, para minimizar a coloração de fundo.

Em seguida, dilua os tetrâmeros em tampão de coloração suficiente, de modo que 25 microlitros da mistura mestre do tetrâmero possam ser adicionados a cada tubo de citometria de fluxo. Em seguida, vórtice os tubos de amostra e incubar as soluções de tetrâmero PBMC no escuro, à temperatura ambiente por 45 minutos. No final da incubação, adicione 50 microlitros de mistura mestra de coloração aos tubos de amostra apropriados.

E misture os tubos para vórtice. Após 25 minutos no escuro à temperatura ambiente, lavar as células com tampão de lavagem, granular as células por centrifugação e decantar cuidadosamente os sobrenadantes sem perturbar os pellets. Vortex as células no tampão restante em cada tubo e fixe as amostras com 250 microlitros de 2% de paraformaldeído por tubo.

Imediatamente vórtice e incubar os tubos no escuro, a 4 graus Celsius. Após 20 minutos, lave as células em tampão de lavagem fresco. Pulverizar as células por centrifugação e decantar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.

Ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de permeabilização, vórtice e incube em temperatura ambiente por 10 minutos no escuro. Em seguida, lave e peletize as células. Em seguida, transvasar os sobrenadantes como descrito anteriormente.

Prossiga para adicionar 50 microlitros de mistura mestre de coloração intracelular aos tubos apropriados. Vortex cada amostra e incube em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Após a incubação, lave e peletize as células.

As amostras estão agora prontas para serem adquiridas em um citômetro de fluxo. Os tetrâmeros Mamu-B017.01 normalmente produzem uma coloração fraca, que pode ser substancialmente melhorada pelo pré-tratamento das células, com um inibidor de proteína quinase. Para evitar a coloração de fundo, as células compatíveis de MHC classe um que contêm ou não a população de células T CD8 positivas específicas do antígeno de interesse devem ser marcadas com o tetrâmero relevante e diluições múltiplas, para determinar a quantidade ideal que resulta na melhor separação entre células T CD8 positivas e negativas de tetrâmero.

Nesses gráficos, é mostrada a estratégia de gating usada para analisar a magnitude e o fenótipo de memória das respostas de células T CD8 positivas específicas para Gag CM9 induzidas pela vacina em um macaco rhesus positivo para Mamu-A 01. Observe que a população de células T CD8 positivas para tetrâmero é bem separada com coloração de fundo mínima. E com os subconjuntos de memória claramente delineados por sua expressão de CD28, CCR7 e Granzyme B dentro da porta do tetrâmero.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de três horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar os reagentes corretos a cada mistura principal de anticorpos ou tetrâmero e trabalhar com os tubos experimentais todas as vezes, conforme demonstrado. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem a especificidade e o fenótipo das células T CD8 específicas do antígeno.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar uma coloração de tetrâmero MHC classe um no ensaio do modelo de macaco rhesus de pesquisa humana de HIV-1 AIDS. Não se esqueça de que trabalhar com espécimes biológicos de macacos rhesus requer precauções especiais, como usar o equipamento de proteção individual apropriado durante o processamento da amostra.