Name: Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia + Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprenda a enumerar e caracterizar células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia em macacos rhesus usando tetrameros de MHC-I e citometria de fluxo. Este método quantifica células T ex vivo sem reestimulação in vitro.

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Nós gostaríamos de agradecer a David Watkins para apoiar os experimentos que permitiram a otimização da presente metodologia. Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiado em parte por uma concessão piloto fornecido pelo Centro de Miami para Pesquisa da AIDS dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio P30AI073961. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

As amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) utilizados neste manuscrito foram obtidos a partir de macacos rhesus Indiana alojados no Wisconsin National Primate Research Center. Estes animais foram tratados de acordo com o Relatório de Weatherall sob um protocolo aprovado pela Universidade de Wisconsin Animal Care Graduate School e Use Committee 33. Todos os procedimentos com animais foram realizados sob anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar o potencial sofrimento. 1. Tratamento de PKI NOTA: Este é opcional, mas recomendado para Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Ver Resultados e Discussão. <ol><li> Ressuspender de PBMC em meio de R10 a uma concentração de 1,6 x 10 7 células / ml. </li><li> Adicionar 50 ul desta suspensão de células para o fluxo de citometria de tubos correspondente. Adicionar 50 ul de uma solução 100 nM de PKI para cada tubo. </li><li> Vortex cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 30 min. No final destapasso, cada tubo deve ter 100 ul de uma suspensão de células contendo 8,0 x 10 5 PBMC e 50 nM de PKI. </li><li> Prossiga para a etapa de coloração tetrâmero pMHC-I. </li></ol> 2. A coloração com fluorocromo rotulados pMHC-I tetrâmeros <ol><li> Antes de preparar a pMHC-I tetrâmero mistura principal, centrifugar os tubos pMHC-I tetrâmero a 20000 xg durante pelo menos 15 min a 4 ° C. O objectivo deste passo é para sedimentar agregados de proteína na solução de tetrâmero pMHC-I, que pode aumentar a coloração de fundo. Uma vez que o passo de centrifugação é feito, evitar pipetagem a partir do fundo do tubo, onde os agregados de proteína terá acumulado. </li><li> Prepare o suficiente pMHC-I master mix tetrâmero para manchar todos os tubos experimentais. Preparar um excesso de 15% do volume total da mistura principal para esta conta para a pipetagem de erro. </li><li> Diluir tetrâmeros pMHC-I em tampão de coloração (por exemplo, tampão de coloração brilhante), de modo que 25 ul da pMHC-I tetrâmero de mistura principal são added para cada teste. <ol><li> Etiqueta de PBMC com dois tetrâmeros pMHC-I por teste; um conjugado com aloficocianina (APC) e o outro para violeta brilhante (BV) 421. </li></ol></li><li> Adicionar 8,0 x 10 5 PBMC para o fluxo correspondente citometria de tubos em um volume final de 100 ul. Se as células foram submetidas ao tratamento acima descrito de PKI, eles já devem ser ressuspensas em 100 ul neste passo. </li><li> Adicionar 25 ul de I-pMHC tetrâmero mistura principal para o fluxo de citometria de tubos correspondente. No final desta etapa, o volume final em cada tubo deve ser de 125 uL. </li><li> Vortex cada tubo, a fim de homogeneizar a suspensão de células. </li><li> Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 45 min. Prepara-se o cocktail mAb de coloração da superfície durante este 45 minutos de incubação. </li></ol> Coloração 3. Superfície <ol><li> Prepare o suficiente master mix mAb para corar todos os tubos experimentais. Preparar um excesso de 15% do volume total da mistura principal para esta contapara a pipetagem de erro. </li><li> Ajustar o volume da mistura principal com tampão de coloração de modo que 50 ul são adicionados por teste. </li><li> Para exclusão adequado de células T CD8 + não-e delineação de subconjuntos de memória, usar quantidades de mAbs dirigidos contra as seguintes moléculas na mistura principal a coloração da superfície titulado. NOTA: Os conjugados com fluorocromos cada mAbs são fornecidas como referência: CD14 BV 510, 510 BV CD16, CD20 BV 510, 785 CD8a BV, CD28 PE Cy7, e CCR7 com FITC. Note-se que os mAbs contra CD14, CD16, CD20 e são conjugados com o mesmo fluorocromo (isto é, BV 510), uma vez que irá ser incluído na porta &quot;dump&quot;. </li><li> Incluir um corante solucionáveis para discriminar células mortas na mistura principal manchas na superfície [ie, amina corante reativo (ARD)]. Certifique-se de que o reagente de ARD é conjugado com um fluorocromo com um espectro de emissão semelhante como os usados ​​na porta &quot;dump&quot;. Neste caso, use ARD Aqua. </li><li> Adicionar 50 ul dea mistura principal de coloração descrito no 3,1-3,4 para o fluxo de citometria de tubos correspondente. No final desta etapa, o volume final em cada tubo deve ser de 175 uL. </li><li> Vortex cada tubo. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 25 min. </li><li> Lavar as células com tampão de lavagem (solução de PBS contendo 0,1% de albumina de soro de bovino e 0,45 g / L de NaN 3). CUIDADO: Sodium azide é uma substância tóxica. A exposição a quantidades até mesmo hora podem causar sintomas. Lidar com esta substância de acordo com as diretrizes especificadas pela Saúde Ambiental e Gabinete de Segurança (EHS) na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas. </li><li> tubos de centrífuga a 510 xg durante 5 min. Decantar cuidadosamente o sobrenadante para um recipiente de resíduos separado. Certifique-se para não perturbar o sedimento. CUIDADO: Não decantar lavagem sobrenadante em tampão de reservatórios que contêm lixívia, uma vez que pode reagir com a azida de sódio presente no tampão de lavagem e resultar na formação de um gás tóxico 34. CONTACTO o Escritório EHS na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas para obter orientações sobre como eliminar os azida de sódio. </li><li> Após decantação, vortex as células no líquido restante retido em cada tubo. </li></ol> Fixação 4. celular <ol><li> Adicionar 250 ul de uma solução a 2% de paraformaldeído (PFA) a todos os tubos para fixar as células. CUIDADO: PFA é uma substância tóxica. A exposição a quantidades até mesmo hora podem causar sintomas. Lidar com esta substância de acordo com as orientações especificadas pelo Escritório EHS na instituição em que essas experiências estão sendo realizadas. <ol><li> Uma vez que a solução de 2% de PFA deve ser isotónica com as células, utilizar PBS para preparar esta solução. Cem mililitros de uma solução 2% de PFA é suficiente para várias experiências. Agitar bem em vórtice todos os tubos imediatamente após a adição de 2% de PFA, a fim de evitar a formação de agregados de células. </li></ol></li><li> Incubar no escuro a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Wcélulas de cinzas por repetindo os passos 3,7-3,9. Uma vez que este passo está terminado, as células podem ser armazenadas no escuro a 4 ° C durante 24-48 hr. Antes de prosseguir para a fase de permeabilização, vortex cuidadosamente os tubos. </li></ol> 5. permeabilização de células <ol><li> Adicionar 500 ul de tampão de permeabilização. Vortex todos os tubos. </li><li> Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Lave as células, repetindo os passos 3,7-3,9. </li></ol> 6. intracelular Coloração <ol><li> Prepare o suficiente master mix mAb para corar todos os tubos experimentais. </li><li> Ajuste o volume com PBS ou tampão de coloração de modo que 50 ul da mistura principal intracelular mAb são adicionados por teste. </li><li> Preparar a mistura de mestre mAb descrito em 6.1 e 6.2 usando quantidades de mAbs dirigidos contra CD3 e GZM B. titulada NOTA: envolvimento do TCR pelo tetrâmeros pMHC-I pode resultar em CD3 internalização, o que pode interferir com a detecção do tetrâmero de CD8 + CD3 + +As células T, se o anti-CD3 mAb é adicionada à mistura principal de manchas na superfície. Para evitar isto, adicionar o anti-CD3 mAb, nesta fase, que é, depois as células são permeabilizadas. Os conjugados com fluorocromos cada mAb são listados como referência: CD3 PerCP Cy5.5 e GZM B PE. </li><li> Adicionar 50? L de mAb Cocktail aos tubos correspondentes. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lave as células, repetindo os passos 3,7-3,9. Os tubos estão prontos para ser adquirida em um citômetro de fluxo. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A poucos passos nesta discussão mérito procedimento como eles são cruciais para produzir resultados ideais. Em primeiro lugar, uma vez que a qualidade das amostras biológicas é um forte indicador de sucesso de qualquer ensaio de citometria de fluxo 38, devem ser tomados todos os cuidados para garantir que as células são viáveis e em suspensão durante o processo de coloração. Isto é particularmente relevante quando se trabalha com amostras criopreservadas, uma vez que são mais propensas a aglomeração e normalm...

As células T CD8 + compreendem um componente crucial do sistema imune adaptativo que eles participam no tumor vigilância imune e contribuir para a erradicação dos agentes patogénicos intracelulares 1. Em termos simples, as células T CD8 + expressam receptores de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o péptido-classe principal de histocompatibilidade complexo I (pMHC-I) moléculas presentes na membrana plasmática das células hospedeiras. Uma vez que estes péptidos são derivados a partir da proteólise de proteínas sintetizadas endogenamente, pMHC-I da superfície da célula complexos de fornecer uma janela para o meio intracelular. Após a infecção de vírus, por exemplo, as células infectadas irão exibir moléculas de CPH-I que contêm péptidos derivados de vírus que podem servir como ligandos para TCR expressas pelo que patrulha células T CD8 +. No caso de uma célula T CD8 + específicos do vírus encontra uma célula infectada que apresenta o seu ligando pMHC-I, o envolvimento do TCR irá resultar na activação de células T CD8 + e ultimadamente levar a célula alvo de lise. Dada a natureza crítica dessas interações TCR / pMHC-I, a determinação da magnitude, especificidade e fenótipo de responder as células T CD8 + podem muitas vezes revelar pistas importantes sobre doenças humanas. Até o início de 1990, a quantificação de células T Ag específicos de CD8 + invocado o ensaio tecnicamente exigente diluição limitante (LDA) 2,3. Não só a LDA requerem vários dias para ser concluído, ele também não conseguiu detectar células que não tinham potencial proliferativo. Como resultado, o LDA vastamente subestimado a frequência real do antigénio (Ag) + células-T CD8 especï¿½icos participantes em uma resposta imune. Embora o desenvolvimento de ELISPOT e ensaios de coloração de citocinas intracelulares melhorou grandemente a capacidade de medir a imunidade celular, estes métodos ainda necessário na estimulação in vitro para quantificar as células T específicas de Ag-4. Não foi até 1996 que Altman, Davis, e colleagues publicaram seu marco artigo relatando o desenvolvimento da tecnologia de tetrâmero pMHC-I 5. Crítica para o sucesso desta técnica foi a multimerização de moléculas pMHC-I, que se estendia a meia-vida de interacções TCR / pMHC-I, reduzindo deste modo a probabilidade de tetrâmeros pMHC-I que caem fora durante os passos de lavagem de ensaios de citometria de fluxo. A principal vantagem de tetrâmeros pMHC-I durante os ensaios acima mencionados é a capacidade de detectar com precisão as células T Ag-CD8 + específica directamente ex vivo, sem a necessidade de in vitro re-estimulação. Além disso, a combinação de pMHC-I tetrâmero coloração com multi-cor citometria de fluxo permitiu uma análise detalhada do andar de diferenciação, fenótipo de memória, e o estado de activação das células T CD8 + específicas de células Ag-2-4. À luz dos recentes avanços técnicos para a caracterização de repertórios de células T CD8 + por pMHC-I multimero coloração 6, a amplitude de aplicações for esta metodologia é provável que continue em expansão. Poucas áreas da pesquisa biomédica beneficiaram mais do pMHC-I tetrâmero coloração do que o campo da imunologia HIV 7. Embora as células T CD8 + foi temporariamente associado com o controle inicial de viremia HIV no momento da publicação por Altman, Davis, e seus colegas 8,9, o uso de tetrâmeros pMHC-I nos anos seguintes expandiu significativamente a nossa compreensão da o HIV-resposta específica das células T CD8 +. Por exemplo, pMHC-I tetrâmero coloração ajudou a confirmar o tamanho robusta de respostas de células T CD8 + específicas do vírus, na maioria dos indivíduos infectados com HIV 10-12. Esta metodologia também facilitou a caracterização de HIV e respostas de células T específicas de SIV CD8 + restringidos por moléculas de MHC-I associados com um controle espontâneo de replicação virai na ausência de terapia anti-retroviral, um fenómeno conhecido como &quot;controlo de elite&quot; <sup&gt; 13-15. Além disso, pMHC-I tetrâmeros foram instrumental no estabelecimento do eixo morte programada 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) como uma via reversível para o fenótipo disfuncional de HIV-específicas CD8 + células-T na infecção crônica não controlada 16,17. Coletivamente, esses estudos ressaltam a utilidade de tetrâmeros pMHC-I para monitorar as respostas de células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Infecção experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) continua a ser o melhor modelo animal para avaliação das intervenções imunes contra o HIV / AIDS 18,19. Nos últimos 25 anos, um progresso substancial tem sido feito na identificação e caracterização de células T CD8 específicas SIV-+ nesta espécies de macacos, incluindo a descoberta de alelos de MHC-I e a definição de ligação ao péptido motivos 13,20-27 . Como resultado, I-pMHC tetrâmeros ter sido desenvolvido para a análise de SIV-específica de células T CD8 +respostas neste modelo animal 28. A maioria destes reagentes são feitas dos produtos de gene de quatro macaco rhesus alelos do MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. De nota, macacos rhesus não expressam um locus MHC-C 29. A grande maioria dos tetrâmeros pMHC-I utilizados nas presentes experiências foram produzidas no Centro de NIH tetrâmero Núcleo da Universidade de Emory. No entanto, alguns destes reagentes, incluindo Mamu-A1 * 001 tetrâmeros ligados ao imunodominante epitopo Gag CM9, só pode ser obtido a partir de fontes comerciais devido a acordos de licenciamento. Usando tetrâmeros pMHC-I dos quatro alelos rhesus listados acima, temos enumerado com êxito as células T CD8 + contra um total de 21 epitopos SIV (Tabela 1), que foram induzidos por vacinação ou infecção pelo SIV primário 30,31 (Martins et al., observações não publicadas). O presente manuscrito fornece umaoptimizado pMHC-I protocolo de coloração do tetrero para a determinação do fenótipo de células T específicas SIV-CD8 + frequência e memória em macacos rhesus. O ensaio começa com um electiva 30 min de incubação com um inibidor de proteína cinase (PKI; aqui, dasatinib é utilizado), a fim de diminuir a internalização de TCR e, assim, melhorar a pMHC-I tetrâmero coloração 32. Como descrito abaixo, o tratamento é especialmente útil quando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Instruções sobre como rotular as células com tetrâmeros pMHC-I fluorocromo conjugado e anticorpos monoclonais (mAbs) também são fornecidos. Este protocolo inclui também um passo para a permeabilização celular para a detecção intracelular da molécula associada à citólise granzima B (GZM B). O anticorpo monoclonal contra CD3 é adicionado neste passo, assim como para melhorar a detecção desta molécula de sinalização de TCR. Como uma referência, todos os fluorocromos utilizados no presente painel de coloração são listados.

<table><tbody><tr><td>Dasatinib</td><td>Axon medchem</td><td>Axon&nbsp; 1392</td><td>Deve ser ressuspenso em DMSO e imediatamente armazenado a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>RPMI com Glutamax</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Deve ser armazenado a 4 &graus; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Calor Inativado FBS</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>Deve ser armazenado a 4 &graus; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Deve ser armazenada a 4 &graus; C&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de fundo redondo de 5 ml</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Tetrâmeros pMHC-I conjugados com fluorocromo</td><td>NIH Tetramer Core ou MBL, Inc.</td><td></td><td>Deve ser armazenado e mantido a 4 graus C. Centrifugue a 20.000 x g por 15 min antes de usar. Não congele.</td></tr><tr><td>mAbs conjugados com fluorocromo</td><td>Várias empresas</td><td></td><td>Devem ser armazenados e mantidos a 4 graus C. Não congele.</td></tr><tr><td>VIVO/MORTO&nbsp; Aqua Consertável&nbsp; Morto&nbsp; Kit de Mancha de Célula</td><td>Life Technologies</td><td>l34957</td><td>Deve ser armazenado a -20 &deg;C. Ressuspenda cada alíquota em 50 &mu; l de DMSO antes do uso.</td></tr><tr><td>Tampão de Mancha Brilhante</td><td>BD Biosciences</td><td>563794</td><td>Deve ser armazenado em&nbsp; 4 &nbsp; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td>Armazenar à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Albumina Bovina</td><td>VWR</td><td>700011-230</td><td>Deve ser armazenado a 4 &nbsp; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>Armazenar à temperatura ambiente. Substância tóxica. Não misture com água sanitária.</td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Produto químico corrosivo, não pode ser misturado com azida de sódio. Manuseie com cuidado</td></tr><tr><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>de Paraformaldeído</td><td>15714-S</td><td>Reagente inflamável, corrosivo e tóxico. Manuseie com cuidado</td></tr><tr><td>Polissorbato 20 (Tween-20)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L15029</td><td>Armazene à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Solução de Permeabilização 2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>340973</td><td>Reagente tóxico e corrosivo. Manuseie com cuidado</td></tr><tr><td>Tubos Sarsdet 1.5 ml com tampa de rosca</td><td>VWR</td><td>72.692.005</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml DNA/RNA Tubos de baixa ligação</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td>O uso de microtubos estéreis é preferido&nbsp;</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>A critério do cientista</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança&nbsp;</td><td>A critério do cientista</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli Q Intergral Sistema de purificação de água</td><td>EMD Millipore</td><td>ZRXQ010WW</td> água <td>de grau de biologia molecular de qualquer fornecedor pode ser usada</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>A critério do cientista</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>A critério do cientista</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C&nbsp; refrigerador</td><td>A critério do cientista</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>O citômetro de fluxo deve conter lasers e filtros compatíveis com o painel de coloração usado.</td></tr>Folha de alumínio de <tr><td>água</td><td></td><td></td><td></td>deionizada</tr><tr><td></td><td>VWR SCIENTIFIC INC.</td><td>89068-738</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td>Deve ser capaz de manter 37 &deg; C&nbsp; temperatura interna</td></tr><tr><td>Software FACS Diva</td> BD <td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Flowjo versão 9.6</td><td>Flowjo</td><td></td><td>Utilizado para analisar arquivos FCS gerados pelo software FACS Diva</td></tr><tr>Pontas <td></td><td></td><td></td><td>de micropippette</td></tr></tbody></table>

análise de células t cd8 específicas do vírus da imunodeficiência símia + células-t em rhesus macaques por peptide-mhc-i tetrâmero coloração

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Péptido-histocompatibilidade principal de classe complexo I (pMHC-I) tetrâmeros têm sido uma ferramenta de valor inestimável para estudar as respostas de células T CD8 +. Porque estes reagentes se ligam directamente aos receptores de células T na superfície das células CD8 + T-linfócitos, tetrâmeros marcado com fluorocromo pMHC-I permitir a detecção exacta do antigénio (Ag) especï¿½ico CD8 + células-T, sem a necessidade de re in vitro -estimulação. Além disso, quando combinado com multi-color citometria de fluxo, pMHC-I tetrâmero coloração pode revelar aspectos-chave de células T CD8 + Ag específicas, incluindo-estágio de diferenciação, fenótipo de memória e estado de activação. Estes tipos de análises têm sido especialmente úteis no campo da imunologia do HIV, onde células T CD8 + podem afectar a progressão para SIDA. infecção experimental de macacos rhesus com vírus da imunodeficiência símia (SIV) fornece uma ferramenta valiosa para estudar a imunidade celular contra o vírus da AIDS. Como resultado, progre considerávelSS foi feita para definir e caracterizar as respostas de células T neste modelo animal. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para enumerar as células T SIV específicas de CD8 + em macacos rhesus por pMHC-I tetrâmero coloração. Nosso ensaio permite a quantificação e memória fenotipagem simultânea de duas populações de células T pMHC-I tetrâmero + CD8 + por teste, que pode ser útil para rastrear respostas específicas-SIV de células T CD8 + geradas pela vacinação ou infecção pelo SIV. Considerando a relevância dos primatas não humanos na investigação biomédica, esta metodologia é aplicável para estudar as respostas das células T CD8 + em múltiplas configurações de doença.

O protocolo aqui descrito foi usado para determinar a magnitude e a memória de fenótipo, as respostas de células T induzidas por vacina Gag CM9-específicas de CD8 + em uma Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Para esta análise, um tetrâmero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugado foi usado em um painel de coloração de citometria de fluxo de 8 cores. Figura 1A - F mostra a estratégia gating usado para analisar os dados, que devem ser aplicadas...

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para enumerar e caracterizar macaco rhesus células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Este artigo é útil não só para o campo da imunologia do HIV, mas também a outras áreas de investigação biomédica, onde são conhecidas respostas de células T CD8 + de afectar a evolução da doença.

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia + Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

O objetivo geral deste ensaio é enumerar e caracterizar populações de células T CD8 positivas específicas para o vírus da imunodeficiência símia geradas por vacinação ou infecção primária. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia de células T, como qual é a frequência de células T CD8 específicas do antígeno induzidas por vacinação ou infecção. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode quantificar células T CD8 específicas do antígeno em amostras biológicas obtidas diretamente ex vivo, sem a necessidade de reestimulação in vitro.As implicações dessa técnica se estendem para a avaliação de células T CD8 específicas da incisão no macaco rhesus e para estudar as respostas das células T CDB em vários cenários de doenças. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao conhecimento incompleto disponível para a genética do MHC do macaco rhesus e porque a coloração por citometria de fluxo requer a aplicação precisa de anticorpos. Comece por ressuspender o rhesus PBMC em meio R10.Adicione 1,6 vezes 10 à sétima concentração de células por mililitro. Alíquota de 50 microlitros de células para o número apropriado de tubos de citometria de fluxo e adicione 50 microlitros de inibidor de proteína quinase a cada tubo. Vortex cada tubo e incube as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos.A quantidade correta de tetrâmero MHC do peptídeo titulado deve ser diluída em mistura mestre suficiente para corar todos os tubos experimentais. Portanto, é importante preparar um excesso de 15% do master mix, para levar em conta os erros de pipetagem. Enquanto as células estão incubando, coloque os agregados de proteínas na solução de tetrâmero por centrifugação, para minimizar a coloração de fundo.Em seguida, dilua os tetrâmeros em tampão de coloração suficiente, de modo que 25 microlitros da mistura mestre do tetrâmero possam ser adicionados a cada tubo de citometria de fluxo. Em seguida, vórtice os tubos de amostra e incubar as soluções de tetrâmero PBMC no escuro, à temperatura ambiente por 45 minutos. No final da incubação, adicione 50 microlitros de mistura mestra de coloração aos tubos de amostra apropriados.E misture os tubos para vórtice. Após 25 minutos no escuro à temperatura ambiente, lavar as células com tampão de lavagem, granular as células por centrifugação e decantar cuidadosamente os sobrenadantes sem perturbar os pellets. Vortex as células no tampão restante em cada tubo e fixe as amostras com 250 microlitros de 2% de paraformaldeído por tubo.Imediatamente vórtice e incubar os tubos no escuro, a 4 graus Celsius. Após 20 minutos, lave as células em tampão de lavagem fresco. Pulverizar as células por centrifugação e decantar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.Ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de permeabilização, vórtice e incube em temperatura ambiente por 10 minutos no escuro. Em seguida, lave e peletize as células. Em seguida, transvasar os sobrenadantes como descrito anteriormente.Prossiga para adicionar 50 microlitros de mistura mestre de coloração intracelular aos tubos apropriados. Vortex cada amostra e incube em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Após a incubação, lave e peletize as células.As amostras estão agora prontas para serem adquiridas em um citômetro de fluxo. Os tetrâmeros Mamu-B017.01 normalmente produzem uma coloração fraca, que pode ser substancialmente melhorada pelo pré-tratamento das células, com um inibidor de proteína quinase. Para evitar a coloração de fundo, as células compatíveis de MHC classe um que contêm ou não a população de células T CD8 positivas específicas do antígeno de interesse devem ser marcadas com o tetrâmero relevante e diluições múltiplas, para determinar a quantidade ideal que resulta na melhor separação entre células T CD8 positivas e negativas de tetrâmero.Nesses gráficos, é mostrada a estratégia de gating usada para analisar a magnitude e o fenótipo de memória das respostas de células T CD8 positivas específicas para Gag CM9 induzidas pela vacina em um macaco rhesus positivo para Mamu-A 01. Observe que a população de células T CD8 positivas para tetrâmero é bem separada com coloração de fundo mínima. E com os subconjuntos de memória claramente delineados por sua expressão de CD28, CCR7 e Granzyme B dentro da porta do tetrâmero.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de três horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar os reagentes corretos a cada mistura principal de anticorpos ou tetrâmero e trabalhar com os tubos experimentais todas as vezes, conforme demonstrado. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem a especificidade e o fenótipo das células T CD8 específicas do antígeno.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar uma coloração de tetrâmero MHC classe um no ensaio do modelo de macaco rhesus de pesquisa humana de HIV-1 AIDS. Não se esqueça de que trabalhar com espécimes biológicos de macacos rhesus requer precauções especiais, como usar o equipamento de proteção individual apropriado durante o processamento da amostra.

analysis-simian-immunodeficiency-virus-specific-cd8-t-cells-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse...

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

Este vídeo demonstra um método para caracterizar células T de memória CD8+ específicas para o vírus da imunodeficiência símia (SIV) usando tetrâmeros de classe I do complexo de histocompatibilidade principal peptídico (pMHC-I). Um tetrâmero pMHC-I é um complexo de quatro moléculas de MHC-I ligadas a peptídeos específicos do SIV e conjugadas a um fluoróforo. Esses tetrâmeros se ligam seletivamente aos receptores de células T (TCRs) em células T CD8+ específicas para SIV, facilitando a...

Uma técnica de coloração de tetrâmero Peptide-MHC-I para analisar células T de memória CD8+ específicas para SIV

Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV+ T células isoladas de macacos rhesus.

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Aqui, apresentamos um protocolo para o ex vivo deteção qualitativa do antígeno-específicos CD8+ T células. Análise é possível com suspensões celulares único de órgãos ou de pequenas quantidades de sangue. Uma ampla gama de estudos requer a análise das respostas de célula de T citotóxicas (vacinação e estudos de imunoterapia do câncer).

Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

O ensaio de libertação de crómio, um ensaio comum para a detecção da actividade de células T citotóxicas, tem várias limitações. Usando células T CD8 específicos de antígenos ea linha de tumor de câncer de mama humano, SKBR3, no presente artigo, uma abordagem baseada em impedância foi examinado para a capacidade de detecção de morte celular.

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

Aprenda a enumerar e caracterizar células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia em macacos rhesus usando tetrameros de MHC-I e citometria de fluxo. Este método quantifica células T ex vivo sem reestimulação in vitro.

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia + Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração (Vídeo) | JoVE Journal

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia⁺ Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

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