Name: Combinando Wet and Dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a combinar métodos experimentais e computacionais para identificar limites de domínios em proteínas de grande enrolamento helicoidal. Esta abordagem integrada melhora significativamente as taxas de sucesso na cristalização de proteínas desafiadoras.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa NIH R01 GM097204 (APV e JDH). O financiamento para o JHM foi fornecido por uma bolsa de verão de pesquisa de graduação do HHMI.

NOTA: Um diagrama da estrutura conceitual ou fluxo de trabalho é descrito na figura 1 para referência. O protocolo pode ser dividido em quatro fases: previsões com base computacional ou de sequências, expressão e purificação de proteínas, a caracterização bioquímica, e cristalização. Os exemplos mostrados analisar domínios Shroom SD2 e / ou complexos de Shroom-rocha, mas pode ser utilizada com qualquer proteína. 1. Use Estabelecida ferramentas baseadas na Web para gerar previsões computacionais de limites de domínio coiled-coil <ol><li> Recolha um conjunto evolutivamente diverso de Homólogos sequência. <ol><li> Ir para www.uniprot.org e digite Shroom na barra de pesquisa superior. </li><li> Seleccione sequências para download, marcando a caixa ao lado de seu número de acesso. Sequências com uma estrela indicam sequências revisados ​​por UniProt e são geralmente mais confiável. Tome cuidado para garantir que todas as sequências são completas e precisas. </li><li> Salvar os s selecionadosequences clicando no botão Download. </li><li> Alinhe o conjunto de sequências de Shroom utilizando Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Clique no botão &quot;Browse&quot; para selecionar o arquivo com as sequências Shroom e empurre Enviar. </li><li> Após o alinhamento estiver completo, clique no botão &quot;Download Alinhamento File&quot;. </li><li> Abra o alinhamento múltiplo de sequências geradas em 1.1.5 usando Jalview (File | Alinhamento Entrada | Do arquivo). Dentro da nova janela de alinhamento, cor de identidade (Color | percentagem de identidade). </li></ol></li><li> Calcular as previsões de estrutura secundária, previsões da sequência flexível ou desordenado, e previu regiões de espiral enrolada dentro da proteína (s) de interesse. <ol><li> Ir para http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular as previsões em espiral enrolada. Copie e cole a seqüência na Caixa de Sequência e clique em Enviar. NOTA: Esta análise pode levar um par de horas para complete. Uma vez que sequências Shroom são bastante grandes, as sequências podem ter de ser dividida em blocos de menos do que 1,000 aminoácidos para caber dentro da limitação de tamanho do servidor da web. Ao analisar Shrm2, recomenda-se que os aminoácidos C-terminais 1000 são usados ​​como esta secção contém o domínio SHRM SD2 que é conhecido por conter regiões de espiral enrolada. Ao repetir esta análise com outras proteínas, recomenda-se utilizar as sequências de proteínas de comprimento total, quando possível. Se isso não é uma opção, utilizar o maior possível ou fragmento dissecar a sequência com base em dados bioquímicos ou funcionais conhecidos. </li><li> Ir para http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, para calcular as previsões em espiral enrolada. Copie e cole a seqüência na Caixa de Sequência e clique em Enviar. </li></ol></li><li> Combinar os resultados de passos 1.1 a 1.2.2 em uma única anotação abrangente da sequência de Shroom. NOTA: É altamente incentivados a também incluem toda e qualquer i relevantenformação que pode ser adquirida a partir da literatura ou de outras fontes sobre a função da proteína ou purificação nesta fase. </li><li> Utilizando esta sequência anotada abrangente, prever limites do domínio (ou uma série de possíveis limites) para a proteína, tentando maximizar a conservação e previu características estruturais, minimizando a quantidade de sequência desordenada ou flexível. Se for conhecida, a proteína resultante deve manter as propriedades funcionais de interesse. </li></ol> 2. expresso e purificar proteínas com os limites de domínio identificada na secção 1 NOTA: O objetivo desta seção é a utilização de uma série de ensaios rápidos e facilmente quantificáveis ​​para a tela de limites de domínio hipotéticas geradas na Seção 1. <ol><li> Utilizando técnicas padrão de biologia molecular, gerar um plasmídeo de expressão com a sequência de codificação desejada na moldura 10 dentro do seu -mRuby2-XH2 plasmídeo (veja a Figura 3 para o mapa de vector umnd detalhes adicionais). </li><li> Os níveis de expressão de teste para cada plasmídeo de expressão utilizando células BL21 (DE3) de E. coli ou outra estirpe de expressão adequado em meios de auto-indução 1 à temperatura ambiente durante 18-24 h. <ol><li> Transforme os plasmídeos de expressão, bem como um controlo de plasmídeo vazio em BL21 (DE3), seguindo as instruções que vieram com as células ou usando o protocolo de transformação robusta, como o aqui (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformação/). </li><li> A partir da placa recentemente transformados, escolher uma única colónia e crescer uma cultura de arranque de 5 ml a 37 ° C durante a noite em Lisogenia Broth (LB) com meios 34 ug / ml de canamicina. </li><li> No dia seguinte, sedimentar a cultura e lavar o pellet com LB. fresco </li><li> Adicionar a cultura de arranque, para 50 ml de meio de auto-indução com 34 ug / ml de canamicina. Permitir que a cultura a crescer até à saturação quer à temperatura ambiente ou a 37 ° C. Tipicamente, crescem durante ~ 18-24 h. </li><li> celular pellets e congelar os sedimentos de células resultantes a -80 ° C antes da purificação indefinidamente. </li><li> Comparar extractos de células completas de cada estirpe de expressão e o vector de controlo vazio por SDS-PAGE para determinar a estirpe que mais eficientemente produz a proteína de fusão desejada. Para His 10 proteínas de fusão -mRuby2 Cogumelo-SD2, correr 10% de gel SDS-PAGE a 180 V durante ~ 50 min ou até que a frente de corante atingir o fundo do gel de 22. </li><li> Gel mancha com Coomassie Blue para visualizar as proteínas celulares totais dentro de cada estirpe 23. </li></ol></li><li> Executar uma etapa inicial de cromatografia de afinidade em cada cepa que expressa com sucesso proteína mRuby2-fusion. Tipicamente, executar os passos de purificação 2.3.2-2.3.7 à temperatura ambiente, a menos que a proteína irá beneficiar de condições alteradas, tais como a purificação, a 4 ° C. <ol><li> pellets de células descongelamento do passo 2.2.5. </li><li> Ressuspender cada pelete de células em 1,5 ml de tampão de lise (10% de glicerol, 500 mM de NaCl, 40mM de imidazole, 20 mM de Tris pH 8,0, 1 mM de beta-mercaptoetanol). Complementar o tampão de lise com inibidores da protease, conforme apropriado. </li><li> Adicionar 30 ul de 10 mg / ml de lisozima e incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Sonicate seguindo as instruções para o instrumento a ser utilizado. </li><li> Transferir para um tubo de 1,5 ml e centrifugar numa centrífuga de bancada durante 30 min a 14000 xg para sedimentar o material insolúvel ou células não lisadas. Salvar tanto sobrenadante e pellet para posterior análise através de SDS-PAGE. </li><li> Realizar a purificação de afinidade de níquel, incubação da fracção solúvel com 100 ul de contas de Ni-NTA. Incubam-se as contas com lisado solúvel, durante 5-10 min, invertendo diversas vezes para misturar os grânulos. </li><li> Centrifugar a 800 xg durante 30 seg numa centrífuga de mesa para sedimentar as pérolas. Em seguida lavar o sedimento 3-5 vezes com tampão de lise para limpar os contaminantes não-específicos. </li><li> proteína de fusão Eluir Ruby a partir das pérolas com tampão de lise, suplementado com 1H imidazole. </li><li> Use SDS-PAGE para comparar o comportamento dos Seus-mRuby2-Shroom proteínas na purificação &quot;rápida e suja&quot; acima. </li></ol></li></ol> 3. Caracterizar proteína da amostra para identificar aqueles com propriedades vantajosas <ol><li> Usar um conjunto espectrofotómetro a 280 nm para medir a concentração da proteína de fusão Ruby, e depois avaliar a homogeneidade da amostra através do carregamento de 1-5 ug de proteína de fusão num gel PAGE nativo 24. Submeter o gel PAGE nativo a 10% a 4 ° C durante 140 min a 175 V. <ol><li> Imagem a PAGE nativa utilizando um gerador de imagens equipado para visualizar fluorescência, observando-se que a fusão mRuby-tagged migra neste ensaio. NOTA: Tenha cuidado para observar proteína de fusão que está preso na bem como esta proteína é provável agregados. Se um gerador de imagens de fluorescência não está disponível, pode-se muitas vezes visualizar e imagem concentrada amostras de rubi com etiquetas proteína sob uma luz negra ou com uma caixa de luz UV. </li></ol></li><li> Realizar a proteólise limitada para identificar domínios dobrados de forma estável. Incubar 95 ul de Rubi-SHRM SD2 fusão em ~ 1 mg / ml com 5 ul de 0,025% Subtilisina A. <ol><li> Amostra a reacção em pontos de tempo de 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, e 120 minutos, removendo 10 ul da reacção para cada ponto de tempo e a visualização do progresso da reacção por meio de SDS-PAGE utilizando um gel de acrilamida a 15% . </li><li> Coram com azul de Coomassie tal como no passo 2.2.7 e avaliar se uma espécie resistente protease podem ser identificadas. </li></ol></li><li> Integrar dados da eficiência da purificação, o comportamento em PAGE nativa e proteólise limitada sobre as proteínas parcialmente purificadas de fusão mRuby2-Shroom em uma avaliação abrangente do comportamento global destas proteínas em solução. <ol><li> (Opcional) Se um ensaio funcional adequado estiver disponível, verifique se há atividade neste momento. </li></ol></li></ol> 4. Produção de cristais de alta qualidade de o Coiled-coil SD2Domínio de Shroom NOTA: Todos os passos na secção 4.1 são realizadas à temperatura ambiente a menos que a proteína se beneficiaria de purificação a uma temperatura diferente, geralmente de 4 ° C. <ol><li> Usando as 50 ml crescimentos como uma estimativa aproximada de expressão e potencialidades de purificação, execute expressões de grande escala de mRuby2-Shroom SD2 com o objetivo de alcançar a 5-20 mg de amostra completamente purificados. Tipicamente de 2 L de cultura fornece material de partida adequado. Após o crescimento as células por centrifugação a 8000 xg durante 10 min. <ol><li> Ressuspender o sedimento do crescimento de 2 L de tampão de lise, como antes, utilizando-se ~ 2 ml de lise por grama de sedimento celular congelado se utilizando lisozima para a lise. Alternativamente, ressuspender em ~ 8 ml / g de sedimento se estiver usando um homogeneizador ou imprensa francesa. Sedimentar os restos celulares através de centrifugação a 30000 xg durante 30 min. </li><li> Lote ligar a fracção solúvel a partir de 4.1.1 utilizando 10 ml de resina Ni-NTA. Despeje em coluna de gravidade apropriadoe permitir que as proteínas não ligadas para drenar. </li><li> Lavar 3-5 vezes da resina com 40 ml de tampão de lise, seguindo-se uma lavagem com tampão de lise suplementado com NaCl 1 M. </li><li> Lavar a resina com 40 ml de tampão de lise suplementado com imidazole 80 mM. </li><li> Elui-se a proteína de fusão-rubi Shroom com 40 ml de tampão de lise suplementado com 1 M de imidazol. fracionar manualmente a proteína eluída em 4-10 ml frações. </li><li> Confirmar fracções contendo proteína de fusão Rubi-Shroom utilizando 10% de SDS-PAGE. </li><li> Dialisar fracções apropriadas (tipicamente frações 2-4) em 8% de glicerol, NaCl 250 mM, imidazole 15 mM, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-Me, utilizando tubagem de diálise de 6-8 kDa MWCO. Adicionar 1 mg de protease de TEV por cada 25-50 mg de proteína de fusão. Dialisar durante a noite à temperatura ambiente com agitação lenta. </li><li> purificação de níquel afinidade Repita os passos 4.1.2. a 4.1.6. O domínio Shroom SD2 agora deve permanecer na fracção livre enquanto o seu 10 -mRuby2 continuam vinculados aose a resina vai ser encontrada nas fracções de eluição. Confirmar esta usando 12% da coloração SDS-PAGE com azul de Coomassie. </li><li> Dialisar fracções contendo domínio Shroom SD2 em 8% de glicerol, 100 mM de NaCl, Tris 20 mM, pH 8,0, tampão mM de beta-mercaptoetanol a 5 durante a noite. </li><li> Realizar cromatografia de permuta aniónica utilizando um 25 FPLC, e eluindo com um gradiente de NaCl 0,1-1,0 M de NaCl. Analise fracções, utilizando 12% de SDS-PAGE. </li><li> Usando um concentrador de rotação (MWCO de 10 kDa ou superior, dependendo da proteína a ser estudada), concentrar as fracções do pico a ~ 0 mg / ml, e, em seguida, realizar cromatografia de exclusão de tamanho 26, a análise através de fracções de pico de 12% de SDS-PAGE. </li><li> Piscina fracções de pico e diálise em Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, 2% de glicerol, 1 mM β-Me, e concentra-se para 10 mg / ml antes da cristalização. Opcional: Durante esta etapa, remover amostras de 5 uL em concentrações de 1, 2, 5, e 10 mg / ml durante o curso de se concentrar a amostra.Execute um nativo de carregamento da página 2-5 mL de cada amostra de olhar para o comportamento da amostra durante esta etapa. </li></ol></li><li> Tela de um pequeno conjunto de 12 condições para identificar uma concentração de proteína ideal para ensaios de cristalização. A composição destas condições é descrita na Figura 7. <ol><li> Usando 24 poços sentam-se tabuleiros de cristalização gota, realizar ensaios de cristalização utilizando o método de difusão de vapor, de pipetagem de 500 ul de cada uma das 12 condições em poços separados seguidos por gotas que inicialmente contêm 1 ml de solução bem e 1 ul de amostra de proteína em as lamelas . Consulte 27 para obter informações adicionais sobre esta técnica. </li><li> Rapidamente selar a bandeja com fita adesiva transparente e mover a bandeja para um ambiente controlado temperatura adequada que é vibração livre. A temperatura utilizada pode variar, mas 4 ° C, 16 ° C, e 20 ° C são bastante comuns. </li><li> Examine as gotas nas bandejas durante a próxima 3 days usando um microscópio de até 100X. No final do período de 3 dias, marcar cada gota como contendo nenhuma precipitação (clara), precipitação de luz, precipitação pesada (castanho), ou cristais. Uma concentração adequada de proteínas deve conter não mais do que 6 precipitações pesados. </li><li> Usando a concentração de proteína identificada em 4.2, o despiste de uma larga gama de telas de cristalização disponíveis comercialmente. O uso de um tratamento de cristalização ou robô líquido aumenta grandemente o presente processo e ao mesmo tempo a redução do erro nas gotas. Isto requer muito menos proteína, bem como, permitir que o utilizador para rastrear mais condições com uma única amostra. </li><li> Melhorar as condições iniciais identificados a partir de telas de amplos variando sistematicamente cada uma das variáveis ​​dentro da gota de cristalização, usando 24-de rastreio bem como as bandejas antes. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui descrito é projetado para ajudar o usuário a identificar limites de domínio dentro de proteínas em espiral enrolada grandes para facilitar a sua cristalização. O protocolo baseia-se em uma incorporação integral de uma variedade de dados de previsões computacionais e outras fontes para gerar uma série de potenciais limites do domínio. Estes são seguidos por um conjunto de experiências bioquímicas que são rápidos e baratos, e são utilizados para refinar ainda mais estas hipóteses iniciais. Usando essa abo...

determinação da estrutura através de cristalografia de raios-X fez contribuições fundamentais para todos os campos da biologia moderna; proporcionando uma visão atômica das macromoléculas que suportam a vida e como eles interagem uns com os outros em uma variedade de contextos; o que nos permite compreender os mecanismos que causam a doença e fornecendo oportunidades para racionalmente projetar medicamentos para tratar a doença. Cristalografia tem sido a técnica experimental dominante para a determinação da estrutura de macromoléculas, e atualmente responde por 89,3% da base de dados estrutural (www.rcsb.org). Esta técnica tem muitas vantagens, incluindo a possibilidade de muito alta resolução, a capacidade de visualizar macromoléculas com uma ampla gama de tamanhos, a recolha de dados relativamente fácil, e a oportunidade de visualizar como a macromolécula interage com solvente, bem como ligantes. Apesar das inúmeras melhorias tecnológicas na expressão da proteína recombinante 1,2, purificação 3, e biologia molecular utilizados para gerar estes sistemas 4, o maior obstáculo no processo cristalográfica permanece a capacidade de crescer cristais de qualidade de difracção. Isto tem sido especialmente verdadeiro para as proteínas que contêm os domínios grandes em espiral enrolada. Estimou-se que, tanto quanto 5% de todos os aminoácidos são encontrados dentro de bobinas enroladas-5,6, tornando esta uma característica estrutural muito comum 7, mas estas proteínas são muitas vezes mais difícil de purificar e cristalizar do que as proteínas globulares 8-10 . Isto é ainda mais agravado pelo facto de que os domínios em espiral espiralada são encontrados frequentemente no contexto de uma proteína maior, portanto, prever correctamente as fronteiras destes domínios é crítico para evitar a inclusão de sequência não estruturado ou flexível que é muitas vezes prejudicial para a cristalização. Aqui nós apresentamos uma estrutura conceitual combinando web-based computacional analisa com a Experimental Dados do banco, para ajudar a guiar os usuários através dos estágios iniciais do processo de cristalografia, incluindo: como selecionar fragmento (s) de proteína para estudos estruturais e como preparar e caracterizar amostras de proteínas antes de quaisquer tentativas de cristalização. Nós nos concentramos nossa análise em duas proteínas contendo domínios grandes em espiral enrolada, Shroom (SHRM) e Rho-quinase (Rock). Estas proteínas foram escolhidos uma vez que ambos contêm domínios em espiral espiralada e são conhecidas para formar um complexo biologicamente relevante 11-16. Shroom e Rho-cinase (rocha) são previstos para conter ~ 200 e 680 resíduos de espiral enrolada, respectivamente, muitas porções da qual têm sido caracterizados estruturalmente 17-20. O método descrito aqui fornece um fluxo de trabalho simplificado para identificar rapidamente contendo fragmentos de proteína de filamento helicoidal que serão tratáveis ​​através de cristalização, no entanto, as técnicas descritas podem ser facilmente adaptadas para a maioria de proteínas ou complexos de proteína ou modificada para incorporar high-throughput approaChes como disponíveis. Por último, estes métodos geralmente são baratos e podem ser realizadas pelos usuários em quase todos os níveis de experiência.

<table><tbody><tr><td>BL21 (DE3) Rosetta</td><td>Emd Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Codon Plus</td><td>Agilent Technologies</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resina</td><td>Life Technologies</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>SubtilisinA</td> Placa Cryschem de 24 poços <td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &nbsp; 96:</td> <td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Autoindução Overnight Express 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Lisogenia em pó</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando wet and dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

A obtenção de cristais para determinação da estrutura pode ser uma proposta difícil e demorada para qualquer proteína. Proteínas e domínios de bobina enrolada são encontrados em toda a natureza, no entanto, devido às suas propriedades físicas e tendência a agregar, são tradicionalmente vistos como especialmente difíceis de cristalizar. Aqui, utilizamos uma variedade de técnicas rápidas e simples projetadas para identificar uma série de possíveis limites de domínio para uma determinada proteína de bobina enrolada e, em seguida, caracterizar rapidamente o comportamento dessas proteínas em solução. Com a adição de uma etiqueta fortemente fluorescente (mRuby2), a caracterização da proteína é simples e direta. A proteína-alvo pode ser facilmente visualizada sob iluminação normal e pode ser quantificada com o uso de um gerador de imagens apropriado. O objetivo é identificar rapidamente os candidatos que podem ser removidos do pipeline de cristalização porque é improvável que tenham sucesso, proporcionando mais tempo para os melhores candidatos e menos fundos gastos em proteínas que não produzem cristais. Esse processo pode ser iterado para incorporar informações obtidas com os esforços iniciais de triagem, pode ser adaptado para procedimentos de expressão e purificação de alto rendimento e é aumentado pela triagem robótica para cristalização.

Um diagrama que descreve o fluxo de trabalho utilizado neste sistema é mostrado na Figura 1 e inclui três etapas principais. A análise computacional da sequência é utilizada para desenvolver hipóteses acerca dos limites do domínio da proteína de filamento helicoidal de interesse. Um exemplo de uma análise anotada do domínio Shrm2 SD2 é mostrado na Figura 2. Neste diagrama, o objetivo foi identificar os possíveis limites de domínio para um domínio conserv...

Descrevemos uma estrutura que incorpora análise bioquímica e computacional direta para orientar a caracterização e cristalização de grandes domínios de bobina enrolada. Essa estrutura pode ser adaptada para proteínas globulares ou estendida para incorporar uma variedade de técnicas de alto rendimento.

Combinando Wet and Dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar e testar rapidamente possíveis limites de domínio dentro de grandes proteínas de bobina enrolada para melhorar a probabilidade de encontrar um fragmento intrínseco que se cristalizará. Este método pode ajudar os pesquisadores a otimizar o processo de cristalização de grandes proteínas de bobina enrolada, que podem ser notoriamente difíceis de cristalizar. A vantagem dessa técnica é que ela integra métodos experimentais e computacionais para identificar e selecionar rapidamente prováveis candidatos à cristalização, melhorando assim suas chances de sucesso.Demonstrando essa técnica estarão Jenna Zalewski, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório, e Keith O'Conor, um pesquisador de graduação em meu laboratório. Para começar, combine a saída de ferramentas baseadas na web estabelecidas para gerar previsões de possíveis limites de domínio de bobina enrolada, conforme descrito no protocolo de texto. Depois de gerar plasmídeos de expressão e testar seus níveis de expressão conforme detalhado no texto, comece a purificação de cada cepa que expressou com sucesso a proteína marcada com rubi.Para lisar as células, primeiro ressuspenda cada pellet celular descongelado em 1,5 mililitros de tampão de lise que foi suplementado com inibidores de protease. Adicione 30 microlitros de lisozima a uma concentração de 10 miligramas por mililitro e incube em temperatura ambiente por 20 minutos, depois sonicate, seguindo as instruções do instrumento que está sendo usado. Centrifugue a amostra em uma centrífuga de mesa por 30 minutos a 14.000 vezes G para granular material insolúvel ou células não lisadas.Guarde o sobrenadante e o pellet para análise subsequente via SDS-PAGE. Para realizar a purificação por afinidade de níquel, primeiro incube 100 microlitros dos grânulos NTA de níquel, pré-lavados em tampão de lise com o lisado solúvel por cinco a 10 minutos. Inverta a suspensão várias vezes para misturar as contas.Centrifugue a amostra a 800 vezes G por 30 segundos em uma centrífuga de mesa para peletar as contas. Em seguida, lave o pellet três a cinco vezes com tampão de lise para limpar contaminantes não específicos. Finalmente, eluir a proteína de fusão Ruby dos grânulos com tampão de lise, suplementado com um imidazol molar.Use um espectrofotômetro ajustado em 280 nanômetros para medir a concentração da proteína de fusão Ruby e, em seguida, avalie a homogeneidade da amostra carregando de um a cinco microgramas de proteína de fusão em um gel PAGE nativo. Execute o gel PAGE nativo de 10% a quatro graus Celsius por 140 minutos a 175 volts. Visualize a PÁGINA nativa usando um gerador de imagens equipado para visualizar a fluorescência, observando para onde a fusão marcada com Ruby migra neste ensaio.Realize proteólise limitada para identificar domínios dobrados de forma estável, incubando primeiro 95 microlitros de fusão Ruby-Shroom SD2 com cinco microlitros de 0,025 Subtilisina A. Amostre a reação em pontos de tempo de zero, 0,5, dois, cinco, 15, 60 e 120 minutos, removendo 10 microlitros da reação para cada ponto de tempo e visualizando o progresso da reação via SDS-PAGE usando um gel de acrilamida a 15%. Pinte o gel com azul de Coomassie para avaliar se uma espécie resistente à protease pode ser identificada. Integre os dados da eficiência de purificação, comportamento em PAGE nativo e proteólise limitada nas proteínas de fusão mRuby2-Shroom parcialmente purificadas em uma avaliação abrangente do comportamento geral dessas proteínas em solução.Realize expressões em larga escala com culturas de dois litros de mRuby2-Shroom SD2 com o objetivo de atingir de cinco a 20 miligramas de amostra completamente purificada. Após o crescimento celular, pulverizar as células por centrifugação a 8.000 vezes G por 10 minutos. O pellet celular resultante pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius até que seja necessário.Em seguida, ressuspenda o pellet em aproximadamente oito mililitros de tampão de lise por grama de pellet de célula congelada. Lisar as células ressuspensas usando um homogeneizador. Após a lise celular, esfolar os detritos celulares por centrifugação a 30.000 vezes G por 30 minutos.Em seguida, ligue em lote a fração solúvel usando 10 mililitros de resina NTA de níquel pré-lavada. Despeje a suspensão do grânulo em uma coluna de gravidade apropriada e deixe as proteínas não ligadas escorrerem, depois lave a resina três a cinco vezes com 40 mililitros de tampão de lise, seguido de uma lavagem com tampão de lise suplementado com cloreto de sódio molar. Realizar uma lavagem final da resina com 40 mililitros de tampão de lise suplementado com imidazol 80 milimolar.Eluir a proteína de fusão Ruby-Shroom com 40 mililitros de tampão de lise contendo um imidazol molar. Fracione manualmente a proteína eluída em frações de quatro a 10 mililitros. Confirme as frações contendo a proteína de fusão Ruby-Shroom usando um gel 10%SDS-PAGE.Adicione um miligrama de protease TEV para cada 25 a 50 miligramas de proteína de fusão para remover a etiqueta Ruby. Em seguida, dialise as frações apropriadas no tampão de clivagem TEV usando um tubo de diálise de corte de peso molecular de seis a oito quilodaltons. Dialise a proteína durante a noite em temperatura ambiente com agitação lenta.Após a diálise, repita as etapas de purificação por afinidade de níquel. O domínio Shroom-SD2 deve fluir para a fração não ligada enquanto a etiqueta Ruby permanece ligada à resina. Usando um concentrador de rotação, concentre as frações de pico em aproximadamente 10 miligramas por mililitro e, em seguida, execute a cromatografia de exclusão de tamanho analisando as frações de pico por meio de um gel 12%SDS-PAGE.Depois de agrupar as frações de pico, dialisar a solução em tampão de cristalização e, em seguida, concentrar a proteína dialisada a 10 miligramas por mililitro antes da cristalização. Analise uma pequena variedade de 12 condições para identificar uma concentração ideal de proteína para testes de cristalização usando 24 bandejas de cristalização de gotas bem assentadas. Realize testes de cristalização usando o método de difusão de vapor.Primeiro, pipete 500 microlitros de cada uma das 12 condições em poços separados. Em cada pedestal, faça gotas que contenham um microlitro de solução de poço e um microlitro de amostra de proteína. Sele rapidamente a bandeja com fita adesiva transparente e, em seguida, mova-a para um ambiente adequado com temperatura controlada e livre de vibrações.Examine as gotas nas bandejas nos próximos três dias usando um microscópio com ampliação de até 100X. No final do período de três dias, marque cada gota como não contendo precipitação, precipitação leve, precipitação pesada ou cristais. Uma concentração de proteína adequada não deve conter mais de seis precipitações pesadas.Usando a concentração de proteína determinada, peneire uma ampla gama de telas de cristalização disponíveis comercialmente. O uso de um robô de manuseio de líquidos ou cristalização acelera muito esse processo, ao mesmo tempo em que minimiza o erro nas gotas. Requer muito menos proteína, permitindo que o usuário rastreie mais condições com uma única amostra.Melhore as condições iniciais identificadas a partir de telas largas, variando sistematicamente cada uma das variáveis dentro da gota de cristalização usando bandejas de tela de 24 poços, como antes. A proteólise limitada é usada para identificar regiões da proteína que podem ser flexíveis ou mais acessíveis à protease. Aqui é mostrado um padrão de degradação para um domínio SD2 que é proteoliticamente sensível e outro que é bastante estável.A proteólise limitada foi realizada no contexto das proteínas de fusão Ruby. Nesse caso, a sequência de ligação entre Ruby e o domínio SD2 foi rapidamente clivada, como esperado, mas os fragmentos Ruby e SD2 resultantes permaneceram praticamente estáveis. A análise por PAGE nativo pode revelar rapidamente bons candidatos para cristalização.Quatro complexos Shroom-Rock com diferentes baterias de proteínas foram executados em géis PAGE nativos. O complexo contendo as rochas 834 a 913 teve o melhor comportamento e cristalizou prontamente, enquanto os outros cristalizaram apenas na degradação ou não cristalizaram completamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um conjunto de limites de domínio potenciais para sua proteína de bobina grande e como usar o sistema Ruby para identificar rápida e rapidamente os melhores candidatos para cristalização.Embora a cristalografia continue sendo um esforço demorado, o uso dessa técnica concentrará sua busca por proteínas que se cristalizarão usando ensaios diretos para remover candidatos ruins, permitindo que você gaste mais tempo com os candidatos com melhores perspectivas de sucesso. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir o máximo de informações possível ao selecionar seus possíveis limites de domínio. As informações que você escolhe selecionar ao utilizar este procedimento variam para cada proteína.Se possível, outros métodos, como ensaios baseados em células ou bioquímicos, devem ser realizados para garantir que os fragmentos de proteína em questão ainda contenham a função de interesse biológico. Embora este método seja focado em proteínas de bobina enrolada, a estrutura geral pode ser facilmente adaptada para quase qualquer proteína. Não se esqueça de que trabalhar com certos instrumentos e reagentes biológicos pode ser perigoso, e precauções, como usar luvas ou óculos de proteção, devem sempre ser seguidas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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