Combinando Wet and Dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas

O objetivo geral deste procedimento é identificar e testar rapidamente possíveis limites de domínio dentro de grandes proteínas de bobina enrolada para melhorar a probabilidade de encontrar um fragmento intrínseco que se cristalizará. Este método pode ajudar os pesquisadores a otimizar o processo de cristalização de grandes proteínas de bobina enrolada, que podem ser notoriamente difíceis de cristalizar. A vantagem dessa técnica é que ela integra métodos experimentais e computacionais para identificar e selecionar rapidamente prováveis candidatos à cristalização, melhorando assim suas chances de sucesso.

Demonstrando essa técnica estarão Jenna Zalewski, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório, e Keith O'Conor, um pesquisador de graduação em meu laboratório. Para começar, combine a saída de ferramentas baseadas na web estabelecidas para gerar previsões de possíveis limites de domínio de bobina enrolada, conforme descrito no protocolo de texto. Depois de gerar plasmídeos de expressão e testar seus níveis de expressão conforme detalhado no texto, comece a purificação de cada cepa que expressou com sucesso a proteína marcada com rubi.

Para lisar as células, primeiro ressuspenda cada pellet celular descongelado em 1,5 mililitros de tampão de lise que foi suplementado com inibidores de protease. Adicione 30 microlitros de lisozima a uma concentração de 10 miligramas por mililitro e incube em temperatura ambiente por 20 minutos, depois sonicate, seguindo as instruções do instrumento que está sendo usado. Centrifugue a amostra em uma centrífuga de mesa por 30 minutos a 14.000 vezes G para granular material insolúvel ou células não lisadas.

Guarde o sobrenadante e o pellet para análise subsequente via SDS-PAGE. Para realizar a purificação por afinidade de níquel, primeiro incube 100 microlitros dos grânulos NTA de níquel, pré-lavados em tampão de lise com o lisado solúvel por cinco a 10 minutos. Inverta a suspensão várias vezes para misturar as contas.

Centrifugue a amostra a 800 vezes G por 30 segundos em uma centrífuga de mesa para peletar as contas. Em seguida, lave o pellet três a cinco vezes com tampão de lise para limpar contaminantes não específicos. Finalmente, eluir a proteína de fusão Ruby dos grânulos com tampão de lise, suplementado com um imidazol molar.

Use um espectrofotômetro ajustado em 280 nanômetros para medir a concentração da proteína de fusão Ruby e, em seguida, avalie a homogeneidade da amostra carregando de um a cinco microgramas de proteína de fusão em um gel PAGE nativo. Execute o gel PAGE nativo de 10% a quatro graus Celsius por 140 minutos a 175 volts. Visualize a PÁGINA nativa usando um gerador de imagens equipado para visualizar a fluorescência, observando para onde a fusão marcada com Ruby migra neste ensaio.

Realize proteólise limitada para identificar domínios dobrados de forma estável, incubando primeiro 95 microlitros de fusão Ruby-Shroom SD2 com cinco microlitros de 0,025 Subtilisina A. Amostre a reação em pontos de tempo de zero, 0,5, dois, cinco, 15, 60 e 120 minutos, removendo 10 microlitros da reação para cada ponto de tempo e visualizando o progresso da reação via SDS-PAGE usando um gel de acrilamida a 15%. Pinte o gel com azul de Coomassie para avaliar se uma espécie resistente à protease pode ser identificada. Integre os dados da eficiência de purificação, comportamento em PAGE nativo e proteólise limitada nas proteínas de fusão mRuby2-Shroom parcialmente purificadas em uma avaliação abrangente do comportamento geral dessas proteínas em solução.

Realize expressões em larga escala com culturas de dois litros de mRuby2-Shroom SD2 com o objetivo de atingir de cinco a 20 miligramas de amostra completamente purificada. Após o crescimento celular, pulverizar as células por centrifugação a 8.000 vezes G por 10 minutos. O pellet celular resultante pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius até que seja necessário.

Em seguida, ressuspenda o pellet em aproximadamente oito mililitros de tampão de lise por grama de pellet de célula congelada. Lisar as células ressuspensas usando um homogeneizador. Após a lise celular, esfolar os detritos celulares por centrifugação a 30.000 vezes G por 30 minutos.

Em seguida, ligue em lote a fração solúvel usando 10 mililitros de resina NTA de níquel pré-lavada. Despeje a suspensão do grânulo em uma coluna de gravidade apropriada e deixe as proteínas não ligadas escorrerem, depois lave a resina três a cinco vezes com 40 mililitros de tampão de lise, seguido de uma lavagem com tampão de lise suplementado com cloreto de sódio molar. Realizar uma lavagem final da resina com 40 mililitros de tampão de lise suplementado com imidazol 80 milimolar.

Eluir a proteína de fusão Ruby-Shroom com 40 mililitros de tampão de lise contendo um imidazol molar. Fracione manualmente a proteína eluída em frações de quatro a 10 mililitros. Confirme as frações contendo a proteína de fusão Ruby-Shroom usando um gel 10%SDS-PAGE.

Adicione um miligrama de protease TEV para cada 25 a 50 miligramas de proteína de fusão para remover a etiqueta Ruby. Em seguida, dialise as frações apropriadas no tampão de clivagem TEV usando um tubo de diálise de corte de peso molecular de seis a oito quilodaltons. Dialise a proteína durante a noite em temperatura ambiente com agitação lenta.

Após a diálise, repita as etapas de purificação por afinidade de níquel. O domínio Shroom-SD2 deve fluir para a fração não ligada enquanto a etiqueta Ruby permanece ligada à resina. Usando um concentrador de rotação, concentre as frações de pico em aproximadamente 10 miligramas por mililitro e, em seguida, execute a cromatografia de exclusão de tamanho analisando as frações de pico por meio de um gel 12%SDS-PAGE.

Depois de agrupar as frações de pico, dialisar a solução em tampão de cristalização e, em seguida, concentrar a proteína dialisada a 10 miligramas por mililitro antes da cristalização. Analise uma pequena variedade de 12 condições para identificar uma concentração ideal de proteína para testes de cristalização usando 24 bandejas de cristalização de gotas bem assentadas. Realize testes de cristalização usando o método de difusão de vapor.

Primeiro, pipete 500 microlitros de cada uma das 12 condições em poços separados. Em cada pedestal, faça gotas que contenham um microlitro de solução de poço e um microlitro de amostra de proteína. Sele rapidamente a bandeja com fita adesiva transparente e, em seguida, mova-a para um ambiente adequado com temperatura controlada e livre de vibrações.

Examine as gotas nas bandejas nos próximos três dias usando um microscópio com ampliação de até 100X. No final do período de três dias, marque cada gota como não contendo precipitação, precipitação leve, precipitação pesada ou cristais. Uma concentração de proteína adequada não deve conter mais de seis precipitações pesadas.

Usando a concentração de proteína determinada, peneire uma ampla gama de telas de cristalização disponíveis comercialmente. O uso de um robô de manuseio de líquidos ou cristalização acelera muito esse processo, ao mesmo tempo em que minimiza o erro nas gotas. Requer muito menos proteína, permitindo que o usuário rastreie mais condições com uma única amostra.

Melhore as condições iniciais identificadas a partir de telas largas, variando sistematicamente cada uma das variáveis dentro da gota de cristalização usando bandejas de tela de 24 poços, como antes. A proteólise limitada é usada para identificar regiões da proteína que podem ser flexíveis ou mais acessíveis à protease. Aqui é mostrado um padrão de degradação para um domínio SD2 que é proteoliticamente sensível e outro que é bastante estável.

A proteólise limitada foi realizada no contexto das proteínas de fusão Ruby. Nesse caso, a sequência de ligação entre Ruby e o domínio SD2 foi rapidamente clivada, como esperado, mas os fragmentos Ruby e SD2 resultantes permaneceram praticamente estáveis. A análise por PAGE nativo pode revelar rapidamente bons candidatos para cristalização.

Quatro complexos Shroom-Rock com diferentes baterias de proteínas foram executados em géis PAGE nativos. O complexo contendo as rochas 834 a 913 teve o melhor comportamento e cristalizou prontamente, enquanto os outros cristalizaram apenas na degradação ou não cristalizaram completamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um conjunto de limites de domínio potenciais para sua proteína de bobina grande e como usar o sistema Ruby para identificar rápida e rapidamente os melhores candidatos para cristalização.

Embora a cristalografia continue sendo um esforço demorado, o uso dessa técnica concentrará sua busca por proteínas que se cristalizarão usando ensaios diretos para remover candidatos ruins, permitindo que você gaste mais tempo com os candidatos com melhores perspectivas de sucesso. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir o máximo de informações possível ao selecionar seus possíveis limites de domínio. As informações que você escolhe selecionar ao utilizar este procedimento variam para cada proteína.

Se possível, outros métodos, como ensaios baseados em células ou bioquímicos, devem ser realizados para garantir que os fragmentos de proteína em questão ainda contenham a função de interesse biológico. Embora este método seja focado em proteínas de bobina enrolada, a estrutura geral pode ser facilmente adaptada para quase qualquer proteína. Não se esqueça de que trabalhar com certos instrumentos e reagentes biológicos pode ser perigoso, e precauções, como usar luvas ou óculos de proteção, devem sempre ser seguidas ao realizar este procedimento.