Análise cinemática da Divisão Celular e Expansão: Quantificar a base celular de crescimento e de amostragem de desenvolvimento zonas em Zea mays Folhas

Os objetivos gerais desta análise são determinar a base celular do crescimento foliar do milho e usar esses dados para investigar os mecanismos regulatórios do crescimento molecular, realizando estratégias de amostragem específicas para o desenvolvimento. Este método pode ajudar a abordar uma questão-chave na biologia do desenvolvimento vegetal. Como a divisão celular e a expansão celular contribuem para as diferenças no crescimento de órgãos inteiros?

Esta abordagem permite a investigação e mapeamento espacial de processos bioquímicos, moleculares e fisiológicos, subjacentes ao crescimento de todo o órgão vegetal. Embora este sistema possa fornecer informações sobre o crescimento das folhas do milho, a técnica pode ser usada para outros sistemas. Incluindo outras espécies de gramíneas e órgãos.

A demonstração visual desses métodos é crítica. Na colheita, a biblação da amostra e as etapas de medição são difíceis de realizar sem essa demonstração. Demonstrando o procedimento, estarão Katrien Sprangers e Viktoriya Avramova.

Dois alunos de doutorado do meu laboratório. Para realizar uma análise quenemática completa do crescimento foliar em monocotiledôneas, cultive pelo menos 15 plantas para cada tratamento e genótipo, sob condições controladas em uma sala de crescimento. Quando uma folha de interesse aparecer, use uma régua para medir o comprimento da folha, ou seja, o comprimento do solo até a ponta da folha, diariamente até que a folha esteja totalmente expandida.

No estágio de desenvolvimento de interesse, corte a parte acima do solo da planta de pelo menos cinco plantas representativas o mais próximo possível das raízes, para manter a região meristemática intacta. Em seguida, começando pelas folhas externas, desenrole suavemente todas as folhas até a folha de interesse, uma a uma. Removendo alguns milímetros extras da base para destacar as folhas conforme necessário.

Em seguida, remova o ápice e as pequenas folhas delimitadas pela folha de interesse e corte um segmento de três centímetros da folha, começando pela base de um lado da nervura média. É crucial cortar a folha exatamente onde ela está conectada ao caule. Como cortar para alto, levaria a uma subestimação do tamanho do meristema.

Armazene o segmento em um tubo de ensaio de 1,5 mililitro, preenchido com três dois um volume por volume solução absoluta de ácido acético etanol, a quatro graus Celsius por 24 horas até vários meses. Do outro lado da veia, corte um segmento de 11 centímetros da base e armazene esse segmento em um tubo de 15 mililitros cheio de etanol absoluto, a quatro graus Celsius, por pelo menos seis horas para remover os pigmentos. Após uma segunda rodada de 24 horas em etanol absoluto a quatro graus Celsius, substitua o etanol por ácido lático puro e armazene o segmento a quatro graus Celsius por mais 24 horas ou até uma análise posterior.

Para medir o meristema, primeiro transfira o segmento de folha de três centímetros para um tampão de enxágue recém-preparado por 20 minutos. No final da incubação, transfira o segmento para um recipiente de solução de coloração Dapi, por dois a cinco minutos em gelo no escuro. Em seguida, monte rapidamente o tecido em uma lâmina de microscópio de vidro e cubra o segmento com uma lamínula.

Confirme as fluorescências das células epidérmicas ao microscópio, usando fluorescência UV. Em seguida, monte a amostra em uma gota de tampão de enxágue em uma nova lâmina de microscópio com uma nova tampa de vidro. Usando uma ampliação de 20 vezes, retorne o segmento ao microscópio e percorra a amostra para localizar figuras mitóticas proliferativas.

Evite qualquer divisão celular formativa dos estâmatos em desenvolvimento e, em seguida, defina onde a figura mitótica mais distal está localizada. Usando um programa de software de análise de imagem, meça o comprimento total do quadro da imagem. Neste exemplo, 645 micrômetros.

Em seguida, conte o número de quadros que cobrem o comprimento total do meristema da figura mitótica mais distal até a base da folha e multiplique esse número pelo comprimento de um quadro para obter o comprimento total do meristema. Para obter um perfil de comprimento de célula, transfira o segmento de 11 centímetros do ácido lático para a bancada e use um bisturi para cortar o tecido em 10 segmentos de um centímetro. Monte os segmentos de folhas resultantes em uma única lâmina de microscópio e uma pequena gota de ácido lático.

Colocando todas as peças com o mesmo lado para cima. Em seguida, transfira a lâmina para um microscópio equipado com óptica de contraste de interferência diferencial. Começando com o segmento mais próximo da base da folha, use um programa de software de análise de imagem apropriado para medir o comprimento de pelo menos 20 células epidérmicas replicadas e limas diretamente adjacentes às limas estamáticas, para garantir a seleção consistente do mesmo tipo de célula em posições igualmente espaçadas ao longo de cada um dos segmentos.

Take are para descer a posição correspondente para cada medida ao longo da folha. Em seguida, determine o comprimento médio da célula em cada milímetro ao longo do eixo da folha usando um procedimento de suavização polinomial local implementado no script R que está disponível como arquivo suplementar um. Tenha cuidado para não suavizar demais.

A suavização deve remover o ruído nos dados do teto, mas não afetar a forma geral da curva. Aqui, é mostrada uma comparação entre plantas bem regadas e plantas submetidas a condições de estresse hídrico em termos de crescimento foliar. O comprimento final das folhas das plantas controle foi 40% menor do que o das plantas estressadas pela seca, devido a uma menor taxa de alongamento das folhas.

A taxa de alongamento foliar das plantas estressadas pela seca é 73% menor do que a dos controles bem regados, devido a uma produção celular reduzida. O que, em andorinha-do-mar, é causado principalmente por uma taxa de divisão celular reduzida. A análise cinemática fornece um mapa da localização da zona de crescimento foliar, permitindo a amostragem com resolução subzonal para análise molecular e bioquímica.

Por exemplo, a quantificação do MDA ao longo da zona de crescimento da folha do milho em plantas submetidas a condições de controle e seca bem regadas, demonstra um aumento significativo neste produto de degradação lipídica em toda a zona de crescimento em resposta às condições de retenção de água. Devido ao encurtamento foliar em resposta à seca, as zonas de desenvolvimento não corresponderam no controle e nas plantas estressadas neste experimento. Usando o perfil de comprimento da célula, no entanto, o comprimento das zonas de desenvolvimento pode ser determinado, permitindo que os níveis de MDA nas zonas individuais sejam comparados.

Uma vez dominada, uma única amostra pode ser processada em quatro horas, se a técnica for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o meristema intacto durante a colheita. Após esse procedimento, outras técnicas podem ser aplicadas, como a determinação de parâmetros moleculares e bioquímicos, para estudar seu envolvimento na regulação do crescimento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a divisão celular e a expansão celular na folha de milho em crescimento, determinar o tamanho das diferentes zonas de crescimento e interpretar os dados moleculares e bioquímicos de acordo. Não se esqueça de que trabalhar com ácidos lático e acético e EDTA pode ser perigoso. Portanto, precauções como usar luvas e limpar o microscópio a cada estágio após o uso devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.