Usando Canais Linear de agarose para o Estudo Drosophila Comportamento larval Crawling
26 de novembro de 2016
A larva Drosophila é um sistema poderoso modelo para estudar o controle neural do comportamento. Esta publicação descreve o uso de canais de agarose lineares para provocar surtos sustentados de rastreamento e métodos linear para quantificar a dinâmica das estruturas de larvas durante o comportamento rastejando repetitivo.
O objetivo geral deste procedimento é observar Drosophila em estágio larval rastejando em um canal linear de agarose para estudar o desenvolvimento de circuitos neurais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da neuroetologia e da biologia do desenvolvimento, como a compreensão dos códigos neurais que geram padrões motores e a identificação dos principais processos genéticos e celulares que abrangem os circuitos neuronais para o controle do movimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela restringe o repertório de comportamento larval para que os pesquisadores possam estudar um único padrão múltiplo em detalhes.
Demonstrando o procedimento estará Zarion Marshall, um técnico do meu laboratório. Primeiro, é importante avaliar a saúde da larva. Três a quatro dias antes da gravação, recoloque a placa coletora da gaiola para adultos.
Faça isso diariamente e na mesma hora do dia. Conte os ovos e as larvas recém-eclodidas no prato. O número esperado de ovos está entre 500 e 2.000.
Ajuste o número de adultos na gaiola conforme necessário. Examinamos a placa 24 horas depois para determinar se as larvas estão saudáveis. A maioria dos ovos deveria ter eclodido em larvas, e as larvas deveriam ter rastejado para dentro da pasta de fermento.
Os sinais de problemas de saúde incluem um grande número de ovos não eclodidos, corpos larvais mortos longe da pasta de levedura e larvas com manchas anormalmente escuras no abdômen, o que é um indicador de uma reação imunológica. Se as larvas parecerem insalubres, troque a gaiola usando placas recém-preparadas e verifique o genótipo dos adultos. Para o experimento, colete larvas de segundo ínstar recém-eclodidas de placas de um a dois dias de idade.
Todas essas etapas podem ser usadas na análise. Para este protocolo, tenha um molde de fundição PDMS de canal linear. Limpe o molde de fundição com álcool isopropílico.
Depois de seco, coloque o molde em uma tampa de dez centímetros ou recipiente semelhante. Em seguida, preencha o molde com três por cento de agarose resfriado a 55 graus Celsius. Despeje a agarose com cuidado para evitar prender bolhas de ar no molde.
O molde deve ser coberto apenas pela agarose. Depois de solidificado, remova os canais de agarose do molde. Apare as bordas dos canais em forma de disco e, em seguida, mergulhe os canais na água.
Eles podem ser armazenados em água a quatro graus Celsius por até sete dias. Antes de usar os canais, deixe-os aquecer até a temperatura ambiente. Selecione um canal que corresponda à largura da larva.
Os canais variam de 100 a 300 mícrons de largura e têm todos 150 mícrons de profundidade. Em seguida, use uma lâmina de barbear limpa para cortar um único canal do disco preparado. Com uma pinça, transfira o canal para uma lamínula de vidro de tamanho apropriado ou deslize com o lado ranhurado para cima.
Em seguida, use uma pinça fina para pegar suavemente uma larva sem apertá-la. Um pincel de ponta fina também funciona bem. Se espremido, os reflexos da dor, como rolar ou curvar-se, podem dominar o comportamento da larva no canal.
Agora lave a larva submergindo-a brevemente em água e, em seguida, coloque-a no canal cortado colocando-a suavemente na posição. Uma vez no canal, ajuste a orientação da larva para facilitar a imagem da estrutura de interesse. Em seguida, coloque uma ou duas gotas de água em cada extremidade do canal para encher o canal com água.
Se alguma bolha de ar ficar presa, levante suavemente as laterais do canal para removê-las. Para ajustar ainda mais a orientação da larva, empurre suavemente o canal para rolar a larva. A larva agora está pronta para ser fotografada.
As larvas em canais lineares realizam ataques sustentados de rastejamento rítmico. As sondas fluorescentes são facilmente examinadas. Por exemplo, larvas que expressam GFP em seus neurônios do driver GAL4 mostram mudanças dinâmicas nas intensidades fluorescentes que emanam do cordão nervoso durante o ciclo de rastreamento.
O SNC avança quase ao mesmo tempo que a cabeça e a cauda da larva, à medida que uma onda de contração muscular passa ao longo do eixo do corpo, o SNC se move para dentro e para fora do plano de foco, fazendo com que a fluorescência do cordão nervoso mude. As mudanças na fluorescência foram quantificadas a partir de três passos de rastejamento para três larvas. A dinâmica da fluorescência do cordão nervoso ao longo do ciclo da passada seguiu um padrão reproduzível que poderia ser usado para fenotipagem.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão de como coletar larvas para comportamento, preparar canais de agarose e carregar as larvas nos canais para visualizar o comportamento de rastreamento linear. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as larvas com cuidado.
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Visão Geral
Este estudo utiliza larvas de Drosophila como modelo para investigar o controle neural do comportamento por meio do rastejo linear em canais de agarose. A metodologia permite a observação detalhada do movimento larval e da dinâmica dos circuitos neurais envolvidos no controle motor.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neuroetologia
- Biologia do Desenvolvimento
- Neurociência
Contexto
- Larvas de Drosophila são modelos eficazes para o estudo do comportamento.
- Compreender os códigos neurais é fundamental para a geração de padrões motores.
- Identificar os processos genéticos e celulares auxilia no mapeamento de circuitos neuronais.
- Restringir o comportamento permite um estudo focado em padrões motores específicos.
Objetivo do Estudo
- Observar o comportamento de rastejamento larval em um ambiente controlado.
- Estudar o desenvolvimento de circuitos neurais envolvidos no movimento.
- Responder perguntas fundamentais em neuroetologia e biologia do desenvolvimento.
Métodos Utilizados
- Uso de canais lineares de agarose para observação da locomoção.
- Avaliação da saúde das larvas antes dos experimentos.
- Quantificação da dinâmica durante o comportamento repetitivo de rastejamento.
- Demonstração do procedimento por um técnico de laboratório.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de episódios sustentados de rastejamento em larvas.
- Observação detalhada da dinâmica da estrutura larval durante o movimento.
- Compreensão dos mecanismos neurais que controlam os padrões motores.
- Estabelecimento de um método confiável para o estudo do comportamento larval.
Conclusões
- O método fornece uma plataforma para estudar circuitos neurais em detalhes.
- Os achados contribuem para a compreensão do controle de movimento em Drosophila.
- As pesquisas futuras podem se basear nesta técnica para explorar questões adicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Ensaios com canais lineares de agarose para o rastejamento de larvas de Drosophila permitem a dissecção precisa da função de circuitos neurais subjacentes a comportamentos motores rítmicos. Essa abordagem favorece a validação confiável de alvos e a redução de riscos mecanicistas nos estágios iniciais da descoberta de fármacos orientada pela neurobiologia. A reprodutibilidade do método e suas saídas quantitativas o posicionam como uma plataforma reutilizável para triagem fenotípica e pesquisas translacionais em estudos de neurodesenvolvimento e controle motor.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação detalhada dos mecanismos de circuitos neurais que controlam padrões motores.
- Apóia a validação funcional de alvos ao associar perturbações genéticas a fenótipos comportamentais quantificáveis.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao isolar o rastejo rítmico de comportamentos interferentes.
- Oferece uma plataforma para a exploração orientada por hipóteses das vias do neurodesenvolvimento.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece ensaios comportamentais padronizados e reproduzíveis para triagem de compostos ou genética em etapas subsequentes.
- Gera leituras quantitativas, em nível de segmento e músculo, para fenotipagem robusta.
- Permite o preparo escalonável de sistemas relevantes para doenças, destinados à análise de alto conteúdo.
- Oferece suporte à prontidão dos ensaios para avaliação de moduladores neurais ou musculares.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir a imagem in vivo da atividade neural durante o comportamento.
- Oferece continuidade da descoberta genética à validação pré-clínica em um modelo acessível.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao vincular intervenções moleculares a desfechos funcionais.
- Facilita a desoneração preditiva de portfólios de compostos neuroativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica de alvos neurocomportamentais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função de circuitos neurais e o mapeamento de vias em um sistema geneticamente manipulável.
- Triagem: Fornece saídas comportamentais quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição da dinâmica de fluorescência e dos parâmetros do ciclo de passada para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas e trabalhos pré-clínicos ao permitir o monitoramento da atividade neural in vivo durante o comportamento.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma flexível e independente de genótipo, adaptável a diversas necessidades de pesquisa e triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurocomportamentais.
- Valor Operacional: Padroniza ensaios comportamentais para reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes de pesquisa.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao fornecer fenotipagem robusta e quantitativa.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e intervenções neuroativas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila, análise comportamental e imageamento por fluorescência.
- Necessita acesso a moldes de fundição, plataformas de imageamento e ferramentas de análise quantitativa.
- Exige padronização entre equipes quanto às dimensões dos canais e aos protocolos de imageamento.
- Adaptável a diversos genótipos e geometrias de canais projetadas pelo pesquisador.
- Limitações práticas incluem o manejo cuidadoso das larvas para evitar artefatos induzidos por estresse.
