Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

O objetivo geral deste procedimento é montar um vaso de cultura contínua, no qual a resposta à iluminação de micróbios optogenéticos possa ser medida com um microscópio automaticamente em tempo real e ao longo de vários dias. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular e engenharia metabólica, como a forma como a expressão gênica dinâmica pode provocar respostas que diferem da expressão gênica estática. A principal vantagem deste método é que a cultura contínua permite que as medições sejam coletadas por vários dias.

Para começar, solde a linha de aterramento, a linha de dados e a linha de tensão positiva do termômetro digital à placa de circuito impresso. Corte um pino de um cabeçalho de três pinos fêmea e apare os dois pinos restantes. Solde-o no par de orifícios rotulados como R2 e conecte os dois pinos soldados inserindo um resistor de 4.7 quilo ohm no cabeçalho do pino.

Em seguida, conecte os componentes restantes à placa de circuito. Sobreponha a placa de circuito ao microcontrolador. Configure o gabinete à prova de luz e instale todo o software conforme descrito no protocolo de texto que o acompanha.

Primeiro, coloque a extremidade longa da porta de alumínio através da junta no recipiente de cultura e aperte a tampa. Cubra uma saída curta de alumínio com tubos de silicone de diâmetro médio. Conecte a extremidade da destilação inserindo uma trava luer fêmea e, em seguida, conectando um plugue luer lock macho.

Esta tomada é suplementar e não será usada. Conecte dois segmentos curtos de tubos de silicone de diâmetro médio com travas luer macho e fêmea. Em seguida, conecte uma extremidade a uma saída curta de alumínio e conecte a extremidade destilada.

O vaso será inoculado através deste tubo. Em seguida, conecte dois tubos médios às extremidades do tubo peristáltico de diâmetro médio e conectores. Conecte uma extremidade a uma porta curta de alumínio e conecte a outra.

Mais tarde, este será conectado ao frasco de mídia. Conecte um tubo de silicone de diâmetro médio à porta de alumínio mais longa. O tubo deve ser suficientemente longo para alcançar o balão de suporte.

Conecte outro segmento curto com alguns centímetros de comprimento até o final e insira-o na rolha de borracha no frasco de mídia. Clamp o tubo. Quando posteriormente destravada, essa conexão permite que a cultura seja misturada, arejada e mantida a uma pressão positiva pelas bolhas de entrada.

Inserir um tubo de diâmetro médio, suficientemente longo para atingir o fundo do balão, na rolha através da qual o meio será transferido. Conecte outro tubo de diâmetro médio a este e, em seguida, um tubo de diâmetro largo na extremidade. Conecte a extremidade da destilação.

Preencha o terceiro orifício na rolha com um pequeno segmento de tubo de diâmetro médio, conectado a dois outros segmentos de tubo de diâmetro médio e tampado na extremidade destilada. Isso será conectado a uma bomba de vácuo e, posteriormente, a uma bomba de aquário. Insira uma trava luer macho em um segmento de tubo de silicone de diâmetro estreito e, em seguida, insira firmemente o tubo de PTFE.

Em seguida, prenda uma trava luer fêmea a um tubo de diâmetro médio. Rosqueie a trava fêmea ao longo do tubo de PTFE para conectar as travas e a outra a uma porta curta de alumínio. Certifique-se de que o tubo de PTFE dentro do recipiente de cultura fique pendurado abaixo do segundo tubo de alumínio mais longo e acima do fundo.

Apare conforme necessário. A mídia será amostrada daqui para o canal de imagem, e o tubo estreito minimiza o volume intermediário. Em seguida, conecte o tubo de silicone estreito exposto ao tubo peristáltico estreito e aos conectores.

Para isso, conecte três segmentos de tubulação de diâmetro estreito e dois segmentos de tubulação de PTFE, alternando-os. Conecte-o ao frasco de efluente, por meio de tubos de diâmetro médio. Em seguida, conecte uma extremidade de um tubo de silicone de diâmetro médio ao segundo tubo mais longo da porta de alumínio na outra extremidade do frasco de efluente.

Este tubo de alumínio define o volume de cultura e o excesso de cultura transborda para o recipiente de efluentes. Enrole as tampas do frasco com papel alumínio e, em seguida, autoclave o conjunto por 30 minutos a 121 graus Celsius e 15 PSI. Conecte o filtro de vácuo a uma garrafa de 100 mililitros.

Remova a tampa do mamilo e, em seguida, remova o plugue branco do bico do filtro de vácuo com uma pinça estéril. Conecte o tubo largo de silicone ao mamilo, o outro tubo livre do frasco de mídia a uma bomba de vácuo e certifique-se de que o terceiro tubo que conecta o frasco de mídia ao recipiente de cultura esteja fechado. Encha o filtro com mídia, ligue a bomba de vácuo e filtre o restante da mídia.

Prenda o tubo de silicone médio conectado ao aspirador e desligue a bomba de vácuo. Remova os luers do segmento intermediário do tubo de silicone médio conectado à bomba de vácuo e insira a extremidade azul de um filtro de ar de seringa estéril neste tubo. Em seguida, prenda o tubo largo de silicone e desconecte o luer macho dele.

Desconecte o plugue do luer fêmea do tubo de entrada de mídia do vaso de cultura. Conecte esses luers para permitir que o meio seja bombeado para o recipiente de cultura. Em seguida, remova o filtro da garrafa de 100 mililitros e coloque a tampa da garrafa.

Use essa mídia para preparar uma cultura inicial. Coloque o conjunto de cultura contínua perto de um microscópio com o frasco de mídia mais alto do que o recipiente de cultura e o frasco do efluente mais baixo do que o recipiente de cultura para evitar o refluxo. Prenda com fita adesiva as rolhas de borracha nos frascos de mídia e efluentes.

Em seguida, desconecte as extremidades do tubo de PTFE do tubo estreito de silicone que as conecta e conecte essas extremidades na entrada e saída de um dispositivo microfluídico preparado. Em seguida, empurre o meio para dentro do recipiente de cultura, conectando a extremidade branca do filtro de ar da seringa à bomba do aquário. Quando o meio atingir o nível da porta do efluente, enrole a tubulação de entrada de meio médio e os conectores ao redor da bomba peristáltica lenta e a tubulação estreita de saída de amostra e os conectores ao redor da bomba peristáltica rápida.

Areje o meio desapertando o tubo de ar entre o frasco do meio e o recipiente de cultura. Em seguida, cole a almofada de aquecimento e o termômetro no recipiente de cultura para que a temperatura possa ser controlada. Enrole a tubulação do meio ao redor do recipiente de cultura, de modo que o meio de entrada esteja na mesma temperatura que o recipiente.

Em seguida, insira o recipiente de cultura no invólucro de espuma preta sobre a matriz de LED e certifique-se de que os tubos não fiquem comprimidos. Use o plug-in do controlador do biorreator para ativar a bomba de mídia lenta por um décimo a cada intervalo de 30 segundos. A taxa de fluxo será muito baixa, mas maior que a taxa de evaporação.

Clamp o tubo de ar de entrada entre o frasco de mídia e o recipiente de cultura. Use uma pipeta para inocular o recipiente de cultura com um mililitro de uma cultura inicial. Em seguida, prenda a extremidade destilada deste tubo e solte o tubo de ar.

Deixe a cultura crescer da noite para o dia. Cubra o gabinete para que nenhuma luz entre. No dia seguinte, use o plug-in do controlador do biorreator para configurar as bombas peristálticas para girar por uma proporção maior de tempo, correspondendo ao meio desejado e às taxas de fluxo de amostragem.

Deixe a densidade da cultura se equilibrar durante a noite. No dia seguinte, preencha a lista de posições do estágio e o micro gerente com um conjunto de posições não sobrepostas, onde as células bombeadas para o canal microfluídico estarão no plano focal. Em seguida, abra o plug-in do controlador do biorreator.

Selecione o curso de tempo da matriz de LED desejado, os canais de imagem e outras configurações experimentais nos prompts e comece a coletar dados. Este aparelho foi usado para estimular uma cultura de saccharomyces cerevisiae, expressando proteína fluorescente amarela em resposta à luz azul por meio de um sistema de transcrição optogenética induzível. Foram adquiridas imagens de contraste de base e fluorescentes do canal microfluídico.

Os contornos celulares foram identificados a partir das imagens de contraste de fase, mapeados para as imagens fluorescentes, e as imagens fluorescentes foram registradas em tempo real. O mapa de calor aqui mostra a distribuição de fluorescência de uma cultura devido à produção de proteína fluorescente amarela após a ativação do sistema optogenético. A fluorescência de aproximadamente 170.000 células foi analisada a partir de mais de 30.000 imagens, adquiridas de 28 posições de estágio ao longo de 70 horas.

Durante este estudo, a cultura foi exposta a intensidades variadas de luz azul por intervalos de seis horas, seguidas por seis horas de escuridão total. As células foram expostas à luz antes da primeira medição, razão pela qual sua intensidade de fluorescência está diminuindo durante o primeiro período escuro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em oito horas, ao longo de três dias, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é muito importante usar a técnica estéril. Após este procedimento, outros métodos, como o controle de feedback em tempo real, podem ser usados para controlar a concentração de proteínas. Essa técnica permitirá que organismos com construções optogenéticas sejam estudados dinamicamente, por períodos de tempo mais longos, mais do que o possível usando placas ou cultura em lote.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como integrar um aparelho de cultura contínua, uma luz e um microscópio para estimular e estudar micróbios optogenéticos.