Name: Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a montar um sistema de cultivo contínuo automatizado para estudos de optogenética microbiana em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite medir respostas dinâmicas à iluminação em tempo real por vários dias.

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Gostaríamos de reconhecer Molly Lazar e Verónica Delgado de assistência em testar o protocolo, Kieran Sweeney para discussões úteis e edição e Taylor Scott, My An-adirekkun, e Stephanie Geller para a leitura crítica do manuscrito. Megan Nicole McClean, Ph.D. detém um Prémio Carreira na Interface Científica do Fundo Burroughs Wellcome.

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).</li>
<li>Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+An+experimental+organism+for+21st+century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: An experimental organism for 21st century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
<li>van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fermentation+of+carbon+sources+in+biomass+hydrolysates+by+Saccharomyces+cerevisiae%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1438429/">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+homeostasis+in+batch+and+steady-state+culture+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Tai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisaie+to+preferred+and+nonpreferred+nitrogen+sources+in+glucose-limited+chemostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures.</a> FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).</li>
<li>Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+genotype+and+nutrition+on+survival+and+metabolism+of+starving+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li>
<li>Liu, H., Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+CRY2+interacts+with+CIB1+to+regulate+transcription+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis.</a> Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).</li>
<li>McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).</li>
<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).</li>
<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós projetamos este aparelho com flexibilidade em mente. Todo o código usado é gratuito e de código aberto. O processo de análise de imagem padrão para as células do segmento é simples e funciona rapidamente. análise personalizada pode ser implementado através da gravação de entrada do usuário ao analisar uma imagem representativa com a interface gráfica de usuário FIJI, convertendo a entrada para um script beanshell, e então configurar o plugin para chamar o script. Quando é chamado, esse script será enviado um array d...

Optogenetic sistemas utilizam a luz para controlar uma lista cada vez maior de processos celulares, incluindo a expressão do gene, 1, 2, 3, 4, 5 localização de proteínas, actividade de proteína de 6, 6, 7, 8, proteína de ligação, 8, 9, 10 e a degradação da proteína. 11 Um método para a cultura de células em um ambiente controlado com estimulação óptico programado e para medir a sua resposta em escalas de tempo biologicamente relevantes é necessário explorar o potencial dessas ferramentas para a investigação em biologia celular e biotecnologia. O nosso método aproveita chemostasis para manter uma taxa de crescimento constante de célula em um bem misturado, AEclassificado, e vaso de cultura de vidro com temperatura controlada 12, 13 que está exposta a iluminação programada. Nós imagem células individuais na cultura efluente com um microscópio invertido para medir a resposta da cultura de iluminação programado. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizada de modo que a intensidade da fluorescência e morfologia celular da cultura de células do efluente pode ser medido ao longo de vários dias, sem intervenção do utilizador. Este protocolo pode ser implementada na maioria dos laboratórios familiarizados com a cultura celular em crescimento e microscopia, e o aparelho utilizado é barato e feito de componentes prontamente disponíveis. Um vaso de cultura transparente é colocada acima de uma matriz de diodos emissores de luz (LEDs), capazes de emitir um mW / cm 2 -10 mW / cm2 de luz. Os micróbios são cultivados em vaso de cultura continuamente; uma bomba peristáltica é utilizada para adicionar mídia aotaxa de diluição, uma outra é utilizada para retirar a cultura a uma velocidade menor ao microscópio, e a diferença escapa através de um orifício de descarga. A almofada de aquecimento mantém a temperatura. O ar é continuamente bombeada para dentro do vaso de cultura para manter uma pressão positiva, bem como para misturar e arejar a cultura. Excepto para a bomba de ar, a potência para esses dispositivos é regulada por um microcontrolador que também recebe a entrada a partir de um termómetro e de um computador de secretária ligado. A cultura de células efluente é bombeado para um dispositivo de microfluidos com a fase de um microscópio invertido. Não fluorescente e imagens fluorescentes são adquiridos automaticamente. As células nas imagens são caracterizados por um algoritmo que localiza cada célula como uma região de interesse (ROI) e mede as propriedades de cada ROI. Para demonstrar uma aplicação deste protocolo, medimos a resposta a diferentes intensidades de luz de células de Saccharomyces cerevisiae por engenharia com uma responsa de luz azulve optogenetic sistema que controla a transcrição de proteína fluorescente. S. cerevisiae, comumente conhecido como fermento de padeiro, foi selecionado porque vários sistemas optogenética para controlar a expressão de genes neste sistema já existem 14, 15, 16. Além disso, este organismo modelo é comumente usado para estudos em biologia de sistemas 17 e como um chassis para aplicações biotecnológicas 18, 19, 20. Os resultados representativos demonstram que este protocolo pode ser utilizado para controlar a transcrição de uma cultura durante vários dias, variando as intensidades de luz de entrada e medir a produção de um repórter fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Extenso manual de laboratório</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Um extenso manual de laboratório atualizado regularmente está disponível no " Arquivos de Quimiostato Optogenético" Repositório GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Isso também inclui uma descrição do molde microfluídico usado para gerar os resultados representativos.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>O software gratuito e de código aberto para visualizar e editar os designs de placas de circuito do tipo .fzz está disponível em "http://fritzing.org/download/"</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - montado)</td><td>Microcontrolador Adafruit</td><td>50</td><td>. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Kit de Cabeçalho Empilhável Arduino</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>Cabeçalhos de pinos fêmeas para conectar PCB ao microcontrolador. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Ferro de solda ajustável 30W 110V - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>Para fazer conexões elétricas ao PCB. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Suporte de ferro de solda</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>Para fazer conexões elétricas ao PCB. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Mini Carretel de solda - 60/40 de solda de núcleo de resina de chumbo 0,031" de diâmetro - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>Para fazer conexões elétricas ao PCB. 1 necessário.</td></tr><tr><td>0,1 &mu; Capacitor F</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>Estabiliza a tensão na placa de circuito impresso. 1 necessário.</td></tr><tr><td>10 &mu; Capacitor F</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>Estabiliza a tensão na placa de circuito impresso. 1 necessário.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG Driver de Matriz de LED/Exibição de Dígitos - MAX7219</td><td>driver de LED Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Soquete IC de 8 pinos</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16 necessário. Eles serão empilhados uns sobre os outros para apoiar o vaso de cultura acima da matriz de LED.</td></tr><tr><td>Soquete IC de 24 pinos</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>Opcional. Use isso para conectar reversivelmente o driver MAXIM 7219CNG ao PCB.</td></tr><tr><td>Multímetro digital</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>Para solução de problemas eletrônicos. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Cabeçotes de Separação - 40-pin Macho (Long Centered, PTH, 0.1")</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Cabeçalhos de pinos macho para matriz LED conectada à placa de circuito impresso. As extremidades podem ser aparadas com alicates. 1 conjunto necessário.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cortadores de fio diagonais nivelados</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>Para aparar cabeçotes de pinos longos e cortar cabos de alimentação. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Fios de Jumper Fêmea/Fêmea Premium - 40 x 12" (300mm)</td><td>Adafruit</td><td>793</td><td>Fita de fio para conectar a placa de ensaio à matriz de LED. Pode ser conectado de ponta a ponta com cabeçalhos macho para ser mais longo. 1 obrigatório.</td></tr><tr><td>Placa de ensaio de meio tamanho</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>A matriz de LED se conectará a ela e o recipiente de cultura ficará acima dela.</td></tr><tr><td>Miniatura 8x8 Azul LED Matrix</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>Fonte de luz. O comprimento de onda dominante é de 470 nm (azul). 1 obrigatório. Matrizes de LED em miniatura alternativas do mesmo fornecedor estão disponíveis com comprimentos de onda dominantes: 624 nm (vermelho), 588 nm (amarelo), 525 nm (verde), 572 nm (amarelo-verde) e branco.</td></tr><tr><td>Cabeçalho empilhável-3 pinos</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8 necessário.</td></tr><tr><td>Kit de Resistor - 1/4W (500 total)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>Para eletrônicos. 1 necessário.</td></tr><tr><td>&nbsp; IRL520N</td><td>Retificador Internacional</td> MOSFET <td>IRL520N</td><td>Interruptor regulador de tensão para controlar a corrente CC. 4 necessário.</td></tr><tr><td>Fio de Conexão - Sortimento (Núcleo Sólido, 22 AWG)</td> <td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Fio para eletrônicos. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação comutada 5V 2A (2000mA) - Listado pela UL</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>Fonte de alimentação para a almofada de aquecimento e Arduino. 2 necessário.</td></tr><tr><td>Adaptador de energia de comutação regulada de 12 VDC 1000mA - listado pela UL</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>Para bombas peristálticas. 2 necessário.</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento elétrica - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>Para aquecer o biorreator. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica de fluxo variável de baixo fluxo</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>Para meios de bombeamento. 1 necessária</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica de fluxo variável de fluxo médio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Para cultura de bombeamento. 1 necessária.</td></tr><tr><td>Adaptador de energia de comutação regulada de 9 VDC 1000mA - listado pela UL</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>Para fonte de alimentação do microcontrolador. Ordem 1.</td></tr><tr><td>Sensor de temperatura digital DS18B20 à prova d'água de alta temperatura + extras</td><td>Termômetro Adafruit</td><td>642</td><td>para o biorreator. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td><td>O software de controle de microscópio gratuito e de código aberto está disponível em "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td>O software de análise de imagem gratuito e de código aberto está disponível em "http://fiji.sc/"</td></tr><tr><td>Ambiente de Desenvolvimento Integrado do Arduino Arduino</td><td></td><td>NA</td><td>O IDE gratuito e de código aberto está disponível em "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"</td></tr><tr><td>Código personalizado</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>O código do microcontrolador personalizado e o plug-in "Bioreactor Controller" estão disponíveis no " Arquivos de Quimiostato Optogenético" Repositório GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Cabo USB A para B - 6 Pés</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Usado para baixar dados para o microcontrolador. 1 necessário.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>A vantagem de carregar valores de matriz de LED de um arquivo CSV é que um programa pode ser chamado pelo plug-in para atualizar esses valores com base nos resultados da análise de imagem, e esses valores podem ser recarregados no microcontrolador, permitindo o controle de feed-back. Está disponível no " Arquivos de Quimiostato Optogenético" Repositório GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Géis Tota-frost (papel de difusão)</td><td>B& H</td><td>B & H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>Para matriz de LED. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Folha de Kitting Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>Espuma preta para invólucro de vaso de cultura. 4 necessários.</td></tr><tr><td>Sensor de Potência de Fotodiodo Padrão, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Para medir a intensidade da luz. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Fita de rotulagem</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>Para etiquetar e fixar componentes soltos. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Console compacto do medidor do poder e da energia, 4" LCD digital</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Para medir a intensidade clara. 1 exigido.</td></tr><tr><td>Garrafa de vidro de hibridização GL45 de 100mL</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Vaso do biorreator. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Conjunto de seis portas</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td>Para o vaso do biorreator. Especificações da tubulação: .125" OD x .055"ID. Porta A: 1.0" de comprimento acima da lesma da tampa e na parte inferior do tubo. Portas B, C, E, F: 1,0 "de comprimento acima da lesma da tampa, 33 mm de comprimento abaixo. Porta D: 1,0" de comprimento acima do slug da tampa, 65 mm&nbsp; muito abaixo. 1 obrigatório. Inclui tampa de rosca de polipropileno de 45 mm de diâmetro e uma junta de silicone branca para garantir uma vedação apertada entre a tampa e o recipiente.</td></tr><tr><td>Fita Adesiva Adesiva 3105, 3/4 x 300 Polegadas, Pacote de 3</td><td>Fita Adesiva Transparente Amazon</td><td>B0009F3P3U</td><td>. Isso está disponível em muitos outros fornecedores. É usado para cobrir marcações no vaso de cultura e para prender a lamínula com o canal PDMS à estrutura de suporte de alumínio.</td></tr><tr><td>Tubulação de Silicone Sanitária Tygon de 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Parede</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57288</td><td>Tubulação. ~25' exigido.</td></tr><tr><td>Tampa de borracha branca Cole-Parmer Twistit, tamanho 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>Tampa de garrafa de mídia e tampa de garrafa de efluente. 2 necessários.</td></tr><tr><td>Balão de Laboratório 2L</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>Balão de mídia e balão de efluentes. 2 necessário.</td></tr><tr><td>Pinchcock diurno</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>Para apertar tubos fechados. 3 necessário.</td></tr><tr><td>Conjunto de tubulação de substituição 1/16" ID</td><td>Rastreaable Products</td><td>3372</td><td>As bombas peristálticas vêm com um conjunto de tubos, mas se desgastam após semanas de uso.</td></tr><tr><td>Conjunto de tubulação de substituição 1/50" ID</td><td>Traceable Products</td><td>3371</td><td>As bombas peristálticas vêm com um conjunto de tubos, mas se desgastam após semanas de uso.</td></tr><tr><td>Luer macho com anel de trava x 1/16" mangueira barb, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>Conectores. ~10 luers são necessários.</td></tr><tr><td>Luer macho com anel de trava x 1/8" mangueira barb, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>Conectores. 5 necessários, um para cada furo de borracha para preencher com tubos.</td></tr><tr><td>Adaptador de mangueira luer x 1/16" fêmea, Nylon, 25/pk</td><td>Conectores Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>. ~10 luers necessários.</td></tr><tr><td>Adaptador de mangueira luer x 3/16" fêmea</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>Conectores. ~10 luers necessários.</td></tr><tr><td>Acessório Luer Cole-Parmer, Tampa Luer Feminina, Nylon, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Accessory, Plugue Luer Lock Macho, Nylon, 25/Pk</td> Tubo PTFE Microbore <td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr>, <tr><td>0.022"ID x 0.042"OD, 100 pés/rolo</td><td>Tubo Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>. 1 rolo necessário.</td></tr><tr><td>Tubo de silicone curado com platina Masterflex, L/S 13, 25 pés</td><td>Tubo Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>. ~25' necessário.</td></tr><tr><td>Tubulação de Silicone Sanitária Tygon de 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Parede</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57293</td><td>Tubulação. ~1' necessário.</td></tr><tr><td>Filtro a vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>974107</td><td>Filtro a vácuo Nalgene para meios filtrantes estéreis.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>Bomba de ar de fluxo ajustável de diafragma duplo para aeração e mistura de meios. 1 necessário.</td></tr><tr><td>0,2 &mu; filtro de seringa de poros m</td><td>Corning International</td><td>431229</td><td>Isso garante que o ar da bomba do aquário não contamine o aparelho. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Kit de Elastômero de Silicone Slygard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>Para dispositivo microfluídico. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear científicas de borda única GEM American Safety Razor</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>Para cortar tubos e PDMS. 1 lâmina necessária.</td></tr><tr><td>Perfurador de furo Harris Uni-Core 1.2mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>Para perfurar entrada/saída em dispositivo microfluídico. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Para dispositivo microfluídico. 1 necessário.</td></tr><tr><td>Moldura retangular de alumínio com janela quadrada</td><td>Custom</td><td></td><td>Custom Para suportar o canal microfluídico. Dimensões externas: 3 polegadas x 1,25 polegadas. Dimensões internas (parte cortada): 7/8 polegadas x 7/8 polegadas Espessura: ~1/32 polegadas</td></tr></tbody></table>

design e implementação de um automated illuminating, a cultura e sistema de amostragem para aplicações microbial optogenética

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

sistemas optogenética utilizar proteínas geneticamente codificados que mudam de conformação em resposta a determinados comprimentos de onda de luz para alterar os processos celulares. Existe uma necessidade para a cultura e os sistemas de medida que incorporam programados iluminação e estimulação dos sistemas optogenetic. Apresenta-se um protocolo para a construção e utilização de um aparelho de cultura contínua para iluminar as células microbianas com doses programadas de luz, e automaticamente aquisição e análise de imagens de células no efluente. A operação deste aparelho como um quimiostato permite que a taxa de crescimento e o ambiente celular a ser rigorosamente controlado. O efluente da cultura de células contínua é regularmente amostrado e as células são fotografadas por microscopia multi-canal. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados de modo que as respostas dinâmicas na intensidade de fluorescência celular e morfologia das células da amostra do efluente de cultura são medidos ao longo de vários diassem entrada do usuário. Nós demonstrar a utilidade do aparelho de cultura de indução dinamicamente a produção de proteína numa estirpe de Saccharomyces cerevisiae com um sistema de engenharia optogenetic que activa a transcrição.

Este aparelho foi utilizado para estimular uma cultura de S. cerevisiae que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP), em resposta à luz azul por meio de um sistema de transcrição indutível optogenetic com base no par de proteínas Cry2 / CIB1 30. As células foram cultivadas chemostatically em meios com limitação de fosfato com uma taxa média de diluição de 0,2 ± 0,008. Fosfato limitação é comumente utilizado em S. cerevisiae quimiostato exp...

Concebemos um aparelho de cultura contínua para uso com sistemas de optogenetic para iluminar culturas de micróbios e regularmente células de imagem no efluente com um microscópio invertido. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados para que as respostas dinâmicas a iluminação pode ser medida ao longo de vários dias.

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

O objetivo geral deste procedimento é montar um vaso de cultura contínua, no qual a resposta à iluminação de micróbios optogenéticos possa ser medida com um microscópio automaticamente em tempo real e ao longo de vários dias. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular e engenharia metabólica, como a forma como a expressão gênica dinâmica pode provocar respostas que diferem da expressão gênica estática. A principal vantagem deste método é que a cultura contínua permite que as medições sejam coletadas por vários dias.Para começar, solde a linha de aterramento, a linha de dados e a linha de tensão positiva do termômetro digital à placa de circuito impresso. Corte um pino de um cabeçalho de três pinos fêmea e apare os dois pinos restantes. Solde-o no par de orifícios rotulados como R2 e conecte os dois pinos soldados inserindo um resistor de 4.7 quilo ohm no cabeçalho do pino.Em seguida, conecte os componentes restantes à placa de circuito. Sobreponha a placa de circuito ao microcontrolador. Configure o gabinete à prova de luz e instale todo o software conforme descrito no protocolo de texto que o acompanha.Primeiro, coloque a extremidade longa da porta de

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Research

JoVE Journal

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