Name: Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a diferenciação neural rápida de células-tronco pluripotentes induzidas humanas em redes neuronais funcionais usando arrays de micro-eletrodos. Este método controlado permite estudar mecanismos neurobiológicos e doenças neurológicas.

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Os autores agradecem a Jessica Classen por realizar os experimentos de patch-clamp de células inteiras. Os hiPSCs usados em nossos experimentos foram gentilmente fornecidos por Huiqing Zhou e Willem van den Akker da Universidade Radboud Nijmegen. Os vetores de transferência usados neste protocolo foram gentilmente fornecidos por Oliver Brüstle, Philipp Koch e Julia Ladewig do Centro Médico da Universidade de Bonn.

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<li>Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacing+3D+engineered+neuronal+cultures+to+micro-electrode+arrays%3A+an+innovative+in+vitro+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model.</a> J Vis Exp. (104), e53080(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui temos implementado um protocolo hiPSC diferenciação eficiente publicada por Zhang et al. (2013) 12 para medir a atividade de rede de redes neuronais hiPSC derivados na AAM. Nós adaptamos o protocolo original, criando uma linha hiPSC -positivo rtTA / NGN2 antes de induzir a diferenciação neuronal. Este passo adicional permite controlar a densidade de células neuronais no MEA. O controle sobre a densidade neuronal foi um importante pré-requisito para adaptar o protocolo a AAM e para garantir a coerência. Para medir a actividade das redes neuronais usando AAM, os neurônios precisam formar densas redes diretamente em cima dos eletrodos MEA 17,18. Isso requer, necessariamente, um controlo apertado sobre a densidade de revestimento dos neurônios. A linha de hiPSC -positivo rtTA / NGN2 permite o controle de neurônio densidade porque essa tática não depende de transduções lentivirais agudos de hiPSCs antes da diferenciação;a linha hiPSC -positivo rtTA / NGN2, portanto, quase elimina qualquer variação no rendimento final devido a, por exemplo, toxicidade lentiviral e eficiência de infecção variável. Outro passo importante do procedimento experimental é o número dos astrócitos de rato que são co-cultivadas com as hiPSCs diferenciadores. Astrócitos contribuir activamente para o refinamento de desenvolvimento de circuitos neurais, controlando a formação de sinapses, manutenção e eliminação, todos os quais são processos importantes para o funcionamento neuronal. O protocolo apresentado neste trabalho é altamente dependente astrócitos: a plena maturidade e formam sinapses funcionais, os neurônios exigem o apoio dos astrócitos. Nós experiente que o número de astrócitos deve ser aproximadamente igual ao número de neurónios hiPSC-derivadas para suportar a maturação dos neurónios e a formação de redes neuronais exibindo actividade espontânea. Desde que os nossos astrócitos protocolo rendimentos cul célula primáriaturas com um tempo de vida limitado, o isolamento de astrócitos de rato tem que ser executada regularmente. A nossa adaptação do protocolo de publicada por Zhang et ai. (2013) 12 para uso com a tecnologia MEA provavelmente vai melhorar significativamente a nossa capacidade de estudar a atividade de rede de redes hiPSC derivados. Anteriormente, os protocolos utilizados para o estudo de redes neuronais hiPSC derivados com AAM invocado procedimentos de diferenciação demoradas 13-16. O protocolo de Zhang et al. (2013) proporciona uma alternativa rápida, e a modificação elimina uma fonte de variabilidade, que torna-se agora mais viável a utilização de neurónios hiPSC derivados em combinação com a tecnologia de MEA, especialmente em high-throughput ou estudos farmacológicos. Além disso, porque o método de publicada por Zhang et ai. (2013) 12 produz uma população homogénea de camada superior neurônios corticais, o nosso protocolo adaptado possibilita estudos focados na rede umctivity deste subconjunto neuronal particular. No entanto, esta abordagem tem também várias limitações. Em primeiro lugar, a homogeneidade das culturas pode também ser considerada uma desvantagem, porque as culturas são menos propensos a se assemelhar em redes in vivo, em que diferentes classes de neurónios (isto é, neurónios inibitórios e excitatórios) constituem uma rede heterogénea. Para melhorar ainda mais a utilização dos neurónios hiPSC derivados com tecnologia MEA, será importante para desenvolver protocolos rápidos de diferenciação (à base de transgene) para outras populações de células neuronais. Se protocolos tornam-se disponíveis, as in vitro redes imitaria em redes in vivo mais de perto. Em segundo lugar, em astrócitos de rato presentes devem ser adicionados aos neurónios hiPSC-derivadas para suportar o crescimento, e, por conseguinte, a rede neuronal resultante não é uma neuronal sensu stricto rede humana. protocolos confiáveis ​​para diferenciar hiPSCs em astrócitos pode no futuro solve 26 este problema. Em terceiro lugar, as redes neuronais bidimensionais, conforme descrito aqui, são um modelo limitado para estudar complexos tridimensionais in vivo redes neuronais. Felizmente, descrevem protocolos culturas tridimensionais de neurónios primários de rato em combinação com a tecnologia de MEA já estão disponíveis 27,28. Prospectivamente, a combinação de protocolos rápidos para a obtenção de diferenciação de neurónios e astrócitos hiPSC derivados com técnicas de cultura tridimensionais e tecnologia MEA deve proporcionar novos visão sobre os mecanismos biológicos perturbações neurológicas subjacentes.

O desenvolvimento de humanos induzida pluripotentes células estaminais (hiPSCs) protocolos de diferenciação para gerar neurônios humanos in vitro tem proporcionado uma nova e poderosa ferramenta para o estudo de distúrbios neurológicos. Até recentemente, o estudo desses distúrbios foi gravemente prejudicado pela falta de sistemas modelo usando neurônios humanos. Apesar de roedores podem ser usadas para estudar doenças neurológicas, os resultados de tais estudos não pode ser facilmente traduzidos para os seres humanos 1. Dadas estas limitações, os neurónios hiPSC-derivados são uma alternativa promissora modelo que pode ser utilizado para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes e distúrbios neurológicos in vitro para rastreio de fármacos. Na última década, vários protocolos para converter hiPSCs em neurónios foram desenvolvidos 2-8. No entanto, estes protocolos são ainda limitados de muitas maneiras. Em primeiro lugar, os protocolos são muitas vezes demorado: geração de neurônios com a maturação adequada (ou seja synapformação se) e da atividade funcional requer meses de procedimentos de cultivo, o que torna os estudos de grande escala difíceis 9. Além disso, a eficiência de conversão hiPSC-a-neurónio é baixo. Protocolos frequentemente produzir uma população heterogénea de neurónios, e, portanto, não permitem estudos de subconjuntos específicos de células neuronais. Além disso, os protocolos não são reproduzíveis, produzindo resultados diferentes para diferentes linhas de IPSC 10,11. Por fim, a fase de maturação e propriedades funcionais dos neurónios resultantes são também variáveis 10. Para resolver esses problemas, Zhang et al. (2013) 12 desenvolvido um protocolo que rapidamente e reprodutivelmente gera neurónios humanos de hiPSCs por sobre-expressam o factor de transcrição neurogenin-2. Como reportado pelos autores, diferenciação ocorre de forma relativamente rápida (apenas 2-3 semanas após a indução da expressão de neurogenin-2), o protocolo é reprodutível (propriedades neuronais são independentes dos starting linha hiPSC), e a conversão hiPSC-a-neurónio é altamente eficiente (cerca de 100%). A população de neurónios gerados com o seu protocolo é homogénea (que se assemelha-camada superior neurónios corticais), que permite a investigação de contribuições específicas do tipo de célula para distúrbios neuronais. Além disso, seus neurônios hiPSC derivados exibiram propriedades maduros (por exemplo, a capacidade de formar sinapses e atividade funcional robusta) depois de apenas 20 d. Caracterização das propriedades eletrofisiológicas de neurônios hiPSC derivados no nível de rede é um requisito importante antes que a tecnologia hiPSC pode ser explorada para o estudo de doenças humanas. Por esta razão, muitos grupos de pesquisa começaram recentemente a investigar neurônios derivados de células-tronco em nível de rede utilizando rede de micro-eletrodo (MEA) dispositivos (sistemas multicanal, Reutlingen, Alemanha) 13-16. Os eléctrodos de um MEA são embutidos em um substrato sobre o qual as células neuronais podem ser cultivadas.MEAs podem ser utilizados para explorar as propriedades electrofisiológicas de redes neuronais e o desenvolvimento in vitro da sua actividade. Actualmente, os AMA são utilizados apenas em combinação com os protocolos de diferenciação que levar vários meses a produzir redes maduros. Assim, combinando AAM com um protocolo de diferenciação rápida deve facilitar o uso desta tecnologia em larga escala estudos de distúrbios neurológicos. Aqui, nós apresentamos uma modificação do Zhang et al. (2013) 12 de protocolo e adaptá-lo para uso em AAM. Em particular, em vez de confiar em um transdução lentiviral aguda, nós em vez disso criou linhas hiPSC expressam de forma estável rtTA / NGN2 antes de induzir a diferenciação. Fizemos isso principalmente para ter o controle reprodutível sobre a densidade celular neuronal, uma vez que a densidade celular neuronal é fundamental para a formação da rede neuronal, e por um bom contato entre os neurônios e os eléctrodos do MEA 17,18. although o Zhang et al. protocolo é muito eficiente no que diz respeito à conversão de hiPSCs transduzidas, é inerentemente variável no que diz respeito ao rendimento final de neurónios do número de hiPSCs chapeado inicialmente (ver Figura 2E em Zhang et ai.) 12. Com uma linha estável, eliminamos muitos problemas que causam variabilidade, tais como toxicidade lentiviral e eficiência de infecção. Em seguida, os parâmetros optimizados que produzem de forma fiável redes neuronais hiPSC-derivados de AAM, obtendo-se a maturação da rede (por exemplo, eventos síncronos que envolvem a maioria dos canais), por a terceira semana. Este protocolo rápido e de confiança deve permitir comparações directas entre os neurónios derivados de diferentes linhas hiPSC (isto é, específicos do paciente), bem como fornecer a consistência robusta para estudos farmacológicos.

<table><tbody><tr><td>Lebovitz's L-15 medium</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-free HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de alta glicose</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro de células m</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 vetor de embalagem lentiviral</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G vetor de embalagem lentiviral</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Solução de desprendimento celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 médio</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de ROCK</td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>Alternativamente, inibidores de ROCK como a tiazovivina podem ser usados.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6 poços MEAs</td><td>Multi Channel Systems</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de vidro</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, humano recombinante</td><td>Promokine</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, humano recombinante</td><td>Promokine</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Citosina &beta;-D-arabinofuranosídeo&nbsp;</td>Pinça reta de ponta fina <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>Tools 11251</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola de ponta fina&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

rápido neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na arrays micro-eletrodo

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) fornecer uma nova ferramenta promissora para o estudo de distúrbios neurológicos. Na última década, muitos protocolos de diferenciação em neurónios hiPSCs têm sido desenvolvidos. No entanto, estes protocolos são muitas vezes lento, com alta variabilidade, baixa reprodutibilidade e baixa eficiência. Além disso, os neurônios obtidos com estes protocolos são muitas vezes imaturo e falta de atividade funcional adequada, tanto a nível de uma única célula e de rede, a menos que os neurônios são cultivadas por vários meses. Parcialmente devido a estas limitações, as propriedades funcionais das redes neuronais hiPSC derivados não são ainda bem caracterizada. Aqui, nós adaptar um protocolo recentemente publicado que descreve a produção de neurónios humanos de hiPSCs por expressão forçada do factor de transcrição neurogenin-2 12. Este protocolo é rápida (produzindo neurônios maduros dentro de 3 semanas) e eficiente, com quase 100% de eficiência de conversão de transduced células (&gt; 95% de células são positivas DAPI-MAP2 positivo). Além disso, o protocolo produz uma população homogénea de neurónios excitatórios que permitiriam que a investigação das contribuições específicas do tipo de células para doenças neurológicas. Nós modificamos o protocolo original, gerando células hiPSC estavelmente transduzidas, dando-nos o controle explícito sobre o número total de neurônios. Estas células são então utilizados para gerar redes neuronais hiPSC-derivados de matrizes micro-eléctrodos. Desta forma, a actividade electrofisiológica espontânea de redes neuronais hiPSC-derivados pode ser medido e caracterizado, mantendo consistência interexperimental em termos de densidade celular. O protocolo apresentado é amplamente aplicável, especialmente para estudos sobre os mecanismos e farmacológicos em redes neuronais humanas.

Aqui temos modificada com êxito um protocolo em que hiPSCs são diferenciados directamente em neurónios corticais por sobre-expressar o factor de transcrição neurogenin-2 12 e que se adaptaram-lo para o uso de AAM. Esta abordagem é rápida e eficiente que nos permite obter neurônios funcionais e atividade de rede já durante a terceira semana após a indução de diferenciação. Durante o curso do protocolo de diferenciação, as células morfologicamente começou a assemelhar-se neurónios: processos pequenas foram formados e neurónios começou ligar uns aos outros (Figura 1A). Nós estabelecemos um perfil neuro-fisiológica dos neurônios derivados de uma linha hiPSC-controle saudável, medindo sua morfologia neuronal e propriedades sinápticas durante o desenvolvimento. hiPSC neurónios derivados foram coradas para MAP2 e sinapsina-1/2 em diferentes dias após o iníciode diferenciação (Figura 2A). Os neurónios derivados mostram morfologia neuronal maduro já 3 semanas após a indução de diferenciação. O número de sinapsina-1/2 pontos lacrimais (uma medida para o número de sinapses) foi quantificada com base na sinapsina-1/2 colorações imunocitoquímica. O número de pontos lacrimais sinapsina-1/2 aumentou com o tempo, sugerindo que o nível de conectividade neuronal está também a aumentar (Figura 2B). O número de sinapsina-1/2 pontos lacrimais 23 dias após a indução de diferenciação foi similar em duas linhas independentes de IPS (Figura 2C). Aos 23 DIV mais synapsin1 / 2 pontos lacrimais foram justapostos a PSD-95 pontos lacrimais, o que é indicativo de sinapses funcionais (Figura 2D). Consistente com os resultados descritos por Zhang et al., Foi gerada uma população de neurónios corticais da camada superior excitatórios, confirmada por m-cortical específica de subtipo e pan-neuronal arkers tais como BRN2 e SATB2 (camada II / III). Nós não observamos neurônios que eram positivos para os neurônios da camada profunda CTIP2 (camada V) ou FOXP2 (camada VI) (Figura 2E e F) Para caracterizar a atividade eletrofisiológica dos neurônios hiPSC derivados, utilizamos corrente de célula inteira e gravações braçadeira de tensão, ou seja, as propriedades intrínsecas e entrada excitatória sobre esses neurônios foram medidos durante o desenvolvimento. Os neurónios foram capazes de gerar potenciais de acção já uma semana após a da diferenciação e a percentagem de células que crava foi aumentando ao longo do tempo (Figura 2G e H). Além disso, os neurónios de entrada recebido sináptica excitatória já uma semana após a indução de diferenciação: tanto a frequência ea amplitude da entrada sináptica excitatória aumentada durante o desenvolvimento (Figura 2I - K). nt "fo: manter-together.within-page =" 1 "&gt; Para entender melhor como a atividade de uma única célula combina para formar funções de nível de rede, é essencial estudar como os neurônios trabalham em conjunto in vitro redes neuronais cultivadas em AAM. constituem um modelo experimental para o estudo da dinâmica neuronais. Foram registradas 20 min de atividade da rede eletrofisiológico dos neurônios derivados de uma linha hiPSC-controle saudáveis cultivados em 6 poços AAM (Figura 2 M). Poucas semanas após a indução de diferenciação, os neurônios derivado de hiPSCs-controlo saudável formado redes neuronais funcionalmente activas, mostrando eventos espontâneos (0,62 ± 0,05 pico / s; a Figura 2N). Nesta fase de desenvolvimento (isto é, 16 d após o início da diferenciação) há eventos síncronos envolvendo todos os canais . dos MEAs são detectados (Figura 2O) o nível de atividade da rede aumentaram durante o desenvolvimento: durante a quarta semana após t ele indução de diferenciação, as redes neuronais mostraram elevado nível de actividade espontânea (2,5 ± 0,1 pico / s; A Figura 2N) em todos os poços de o dispositivo. As redes também exibiu rajadas síncronos de rede (4,1 ± 0,1 explosão / min, Figura 2O) com longa duração (2.100 ± 500 ms). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg"> Figura 1: hiPSC diferenciação em neurônios. A. Três pontos de tempo de diferenciação hiPSCs em neurônios em lamelas. B. chapeamento de hiPSCs na AAM. C. Os astrócitos em 100% de confluência no frasco T75 (note que as células formam uma monocamada tessellated). Barras de escala: 150? m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> e_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg"> Figura 2. hiPSC derivado Caracterização Os neurónios. Neurónios A. hiPSC derivados foram coradas para MAP2 (verde) e sinapsina-1/2 (vermelho) em diferentes dias após o início da diferenciação. Barra de escala: 10 ^ m. B. Quantificação de pontos lacrimais sinapsina em duas experiências independentes. Em cada experiências foram analisadas pelo menos 10 células. C. Quantificação de puncta sinapsina em DIV23 em neurônios derivados de duas linhas IPS independentes. Neurónios D. hiPSC derivados foram coradas para PSD-95 (verde) e sinapsina-1/2 (vermelho) 23 dias após o início da diferenciação. pontos lacrimais sinapsina são justapostos ao PSD-95 pontos lacrimais. Neurónios E. hiPSC derivados foram coradas para MAP2 (verde) e BRN2 (vermelho) ou SATB2 (vermelho) 23 d após o início da diferenciação. F. percentagem de células positivas MAP2 queforam positivas para os marcadores indicados. G. representativos gravações braçadeira atual demonstra que os potenciais de ação podem ser gerados a partir de 7 d após o início da diferenciação. H. percentagem de células em diferentes dias após a indução de diferenciação que mostram uma ou mais potenciais de acção. I. traços representativos de correntes pós-sinápticos excitatórios (EPSCS) recebidos pelos neurônios hiPSC derivados em diferentes dias após a diferenciação. J. Frequência de correntes pós-sinápticos excitatórios durante o desenvolvimento. K. A amplitude das correntes excitatório pós-sináptico durante o desenvolvimento. L. Representante vestígios de gravações EPSC sem (controle) e com CNQX (CNQX). M. Os neurónios derivados de uma linha hiPSC foram cultivadas em um MEA de 6 poços e actividade de rede é mostrado para as redes neuronais hiPSC derivados 16 e 23 d após a indução de diferenciação. A actividade registada decada (taxa de amostragem de 10 kHz) está bem indicado com uma cor diferente (5 min a 20 min de de gravação são mostradas). N. taxa de disparo 16 e 23 d após a indução de diferenciação. O. taxa Estourando 16 e 23 d após a indução de diferenciação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Tendo em conta os resultados, a qualidade dos neurónios derivados de hiPSC resultantes pode ser avaliada fazendo um perfil neurofisiológicos das células. Isto é, três a quatro semanas após o início da diferenciação, a morfologia, sinapsina-1/2 e electrofisiologia expressão dos neurónios pode ser avaliada. Nesse ponto de tempo, espera-se que os neurónios hiPSC-derivadas para mostrar uma morfologia neuronal semelhante, para ser MAP2, sinapsina / PSD-95 imunocitoquímica positiva quando se realiza, e para exposiT espontânea actividade electrofisiológica (em ambas as de uma única célula e nível de rede).

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

O objetivo geral deste protocolo de diferenciação neuronal é gerar redes neuronais a partir das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que crescem em matrizes de microeletrodos de maneira rápida e controlada. Este método pode ser usado para abordar questões-chave nos campos da neurociência. Ele pode ser usado para estudar mecanismos biológicos subjacentes a distúrbios neurológicos, mas também pode ser usado para abordar questões neurobiológicas mais fundamentais.A principal vantagem dessa técnica é a rápida diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas em neurônios de maneira controlada. No primeiro dia, aqueça o meio DMEM/F12, CDS e E8 com 1% de penicilina estreptomicina à temperatura ambiente. Em seguida, adicione doxiciclina ao meio E8 para fazer uma concentração final de quatro microgramas por mililitro e, em seguida, adicione inibidor de rocha à mistura.Aspire o meio gasto dos hiPSCs RTTANGN2 positivos e adicione um mililitro de CDS às células. Em seguida, incube as células por três a cinco minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius. Sob o microscópio, verifique se as células estão se desprendendo umas das outras.Em seguida, adicione dois mililitros DMEM/F12 no poço. Suspenda suavemente as células com uma pipeta de 1.000 microlitros e transfira para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicione sete mililitros de DMEM / F12 à suspensão celular e gire as células a 200 x g por cinco minutos.Após cinco minutos, aspirar o sobrenadante e adicionar dois mililitros do meio E8 preparado. Dissocie os hiPSCs colocando a ponta de uma pipeta de 1.000 microlitros contra a lateral do tubo de 15 mililitros e ressuspendendo as células suavemente. Sob o microscópio, verifique se as células estão dissociadas.Em seguida, determine o número de células por mililitro usando um hemocitômetro. Para os seis MEAs de poço, dilua as células para obter uma suspensão celular de 7,5 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. Para as lamínulas, diluir as células para obter uma suspensão celular de quatro vezes 10 elevado a quarto de células por mililitro.Aspirar a laminina diluída das lamínulas e dos seis poços MEAs. Para os MEAs de seis poços, coloque as células em placas adicionando 100 microlitros de suspensão de células à área do eletrodo ativo em cada poço. Em seguida, coloque as células adicionando 500 microlitros de suspensão de células a cada poço da placa de 24 poços.Em seguida, coloque os MEAs de seis poços ou a placa de 24 poços em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius. Após duas horas, adicione cuidadosamente 500 microlitros do meio E8 preparado a cada poço dos seis poços MEAs. Posteriormente, coloque os seis MEAs de poço durante a noite em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius.No terceiro dia, aqueça 0,05% de tripsina-EDTA à temperatura ambiente. Aqueça DPBS e DMEM/F12 com 1% de penicilina estreptomicina a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire o meio gasto da cultura de astrócitos de ratos.Lave a cultura adicionando cinco mililitros de DPBS e agite-a suavemente. Em seguida, aspire a DPBS e adicione cinco mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA. Agite a tripsina-EDTA suavemente.Em seguida, incube as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Em seguida, verifique ao microscópio se as células estão separadas. Separe as últimas células batendo no frasco algumas vezes.Em seguida, adicionar cinco mililitros de DMEM/F12 ao balão. Tente classificar as células suavemente dentro do frasco com uma pipeta de 10 mililitros. Em seguida, colete a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros.Girar o tubo a 200 x g durante oito minutos. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em um mililitro de DMEM/F12. Determine o número de células por mililitro usando um hemocitômetro.Em seguida, adicione 7,5 vezes 10 aos quartos astrócitos a cada poço dos seis MEAs de poços. E adicione duas vezes 10 aos quartos astrócitos a cada poço da placa de 24 poços. Incube as células durante a noite em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius.Adquira os dados com amplificação de 1.200 vezes e faça uma amostra do sinal a 10 quilohertz usando o cartão de aquisição de dados MCS. Registre 20 minutos de atividade eletrofisiológica de neurônios derivados de hiPSC cultivados em MEAs. Durante a gravação, mantenha a temperatura em 37 graus Celsius e evite a evaporação do meio e as mudanças de pH, fornecendo um fluxo lento constante de gás umidificado nos MEAs.Depois disso, analise os dados usando um pacote de software personalizado. Esta figura mostra as alterações na expressão dos marcadores neuronais MAP2 na sinapsina durante o processo de diferenciação, o que indica a maturação neuronal. Este gráfico mostra que a expressão da sinapsina é medida para células individuais aumentadas durante o processo de diferenciação.A sinapsina que é expressa nas células após três semanas de diferenciação co-localizada com PSD-95, indicando a presença de sinapses funcionais. Aqui, o patch clamp de células inteiras foi realizado em diferentes momentos durante o processo de diferenciação para medir a atividade eletrofisiológica das células. As células foram capazes de gerar potenciais de ação nos diferentes momentos.E a porcentagem de células com pico aumentou ao longo do tempo mostra que a maioria das células é capaz de gerar potenciais de ação, mesmo no estágio inicial de diferenciação. O patch clamp também foi usado para medir as correntes pós-sinápticas excitatórias recebidas pelas células. O número de entradas que as células recebem aumentou durante o processo de diferenciação.Tanto a frequência quanto a amplitude das correntes pós-sinápticas excitatórias aumentaram durante o processo de diferenciação. A atividade eletrofisiológica das células diferenciadas em arranjos de microeletrodos foi medida durante o processo de diferenciação. Aqui, a atividade da rede neuronal aumentou durante o processo de diferenciação e mostrou eventos síncronos após 23 dias.Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas em redes neuronais funcionais dentro de três a quatro semanas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar estéril e tratar as células com cuidado. Após esse procedimento, outros métodos, como testes farmacológicos, podem ser usados para resgatar o fenótipo, observado nas linhagens celulares dos pacientes.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de neurociência estudarem oficialmente os defeitos de atividade da rede em distúrbios neurológicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciar, induzir células-tronco pluripotentes em neurônios de maneira rápida e controlada.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo (Vídeo) | JoVE Journal

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

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