Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo
8 de janeiro de 2017
Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.
O objetivo geral deste protocolo de diferenciação neuronal é gerar redes neuronais a partir das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que crescem em matrizes de microeletrodos de maneira rápida e controlada. Este método pode ser usado para abordar questões-chave nos campos da neurociência. Ele pode ser usado para estudar mecanismos biológicos subjacentes a distúrbios neurológicos, mas também pode ser usado para abordar questões neurobiológicas mais fundamentais.
A principal vantagem dessa técnica é a rápida diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas em neurônios de maneira controlada. No primeiro dia, aqueça o meio DMEM/F12, CDS e E8 com 1% de penicilina estreptomicina à temperatura ambiente. Em seguida, adicione doxiciclina ao meio E8 para fazer uma concentração final de quatro microgramas por mililitro e, em seguida, adicione inibidor de rocha à mistura.
Aspire o meio gasto dos hiPSCs RTTANGN2 positivos e adicione um mililitro de CDS às células. Em seguida, incube as células por três a cinco minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius. Sob o microscópio, verifique se as células estão se desprendendo umas das outras.
Em seguida, adicione dois mililitros DMEM/F12 no poço. Suspenda suavemente as células com uma pipeta de 1.000 microlitros e transfira para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicione sete mililitros de DMEM / F12 à suspensão celular e gire as células a 200 x g por cinco minutos.
Após cinco minutos, aspirar o sobrenadante e adicionar dois mililitros do meio E8 preparado. Dissocie os hiPSCs colocando a ponta de uma pipeta de 1.000 microlitros contra a lateral do tubo de 15 mililitros e ressuspendendo as células suavemente. Sob o microscópio, verifique se as células estão dissociadas.
Em seguida, determine o número de células por mililitro usando um hemocitômetro. Para os seis MEAs de poço, dilua as células para obter uma suspensão celular de 7,5 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. Para as lamínulas, diluir as células para obter uma suspensão celular de quatro vezes 10 elevado a quarto de células por mililitro.
Aspirar a laminina diluída das lamínulas e dos seis poços MEAs. Para os MEAs de seis poços, coloque as células em placas adicionando 100 microlitros de suspensão de células à área do eletrodo ativo em cada poço. Em seguida, coloque as células adicionando 500 microlitros de suspensão de células a cada poço da placa de 24 poços.
Em seguida, coloque os MEAs de seis poços ou a placa de 24 poços em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius. Após duas horas, adicione cuidadosamente 500 microlitros do meio E8 preparado a cada poço dos seis poços MEAs. Posteriormente, coloque os seis MEAs de poço durante a noite em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius.
No terceiro dia, aqueça 0,05% de tripsina-EDTA à temperatura ambiente. Aqueça DPBS e DMEM/F12 com 1% de penicilina estreptomicina a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire o meio gasto da cultura de astrócitos de ratos.
Lave a cultura adicionando cinco mililitros de DPBS e agite-a suavemente. Em seguida, aspire a DPBS e adicione cinco mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA. Agite a tripsina-EDTA suavemente.
Em seguida, incube as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Em seguida, verifique ao microscópio se as células estão separadas. Separe as últimas células batendo no frasco algumas vezes.
Em seguida, adicionar cinco mililitros de DMEM/F12 ao balão. Tente classificar as células suavemente dentro do frasco com uma pipeta de 10 mililitros. Em seguida, colete a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros.
Girar o tubo a 200 x g durante oito minutos. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em um mililitro de DMEM/F12. Determine o número de células por mililitro usando um hemocitômetro.
Em seguida, adicione 7,5 vezes 10 aos quartos astrócitos a cada poço dos seis MEAs de poços. E adicione duas vezes 10 aos quartos astrócitos a cada poço da placa de 24 poços. Incube as células durante a noite em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius.
Adquira os dados com amplificação de 1.200 vezes e faça uma amostra do sinal a 10 quilohertz usando o cartão de aquisição de dados MCS. Registre 20 minutos de atividade eletrofisiológica de neurônios derivados de hiPSC cultivados em MEAs. Durante a gravação, mantenha a temperatura em 37 graus Celsius e evite a evaporação do meio e as mudanças de pH, fornecendo um fluxo lento constante de gás umidificado nos MEAs.
Depois disso, analise os dados usando um pacote de software personalizado. Esta figura mostra as alterações na expressão dos marcadores neuronais MAP2 na sinapsina durante o processo de diferenciação, o que indica a maturação neuronal. Este gráfico mostra que a expressão da sinapsina é medida para células individuais aumentadas durante o processo de diferenciação.
A sinapsina que é expressa nas células após três semanas de diferenciação co-localizada com PSD-95, indicando a presença de sinapses funcionais. Aqui, o patch clamp de células inteiras foi realizado em diferentes momentos durante o processo de diferenciação para medir a atividade eletrofisiológica das células. As células foram capazes de gerar potenciais de ação nos diferentes momentos.
E a porcentagem de células com pico aumentou ao longo do tempo mostra que a maioria das células é capaz de gerar potenciais de ação, mesmo no estágio inicial de diferenciação. O patch clamp também foi usado para medir as correntes pós-sinápticas excitatórias recebidas pelas células. O número de entradas que as células recebem aumentou durante o processo de diferenciação.
Tanto a frequência quanto a amplitude das correntes pós-sinápticas excitatórias aumentaram durante o processo de diferenciação. A atividade eletrofisiológica das células diferenciadas em arranjos de microeletrodos foi medida durante o processo de diferenciação. Aqui, a atividade da rede neuronal aumentou durante o processo de diferenciação e mostrou eventos síncronos após 23 dias.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas em redes neuronais funcionais dentro de três a quatro semanas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar estéril e tratar as células com cuidado. Após esse procedimento, outros métodos, como testes farmacológicos, podem ser usados para resgatar o fenótipo, observado nas linhagens celulares dos pacientes.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de neurociência estudarem oficialmente os defeitos de atividade da rede em distúrbios neurológicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciar, induzir células-tronco pluripotentes em neurônios de maneira rápida e controlada.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo modificado para a diferenciação rápida de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios. O método permite o controle da densidade celular neuronal e é compatível com matrizes de microeletrodos para a medição de propriedades eletrofisiológicas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia de Células-Tronco
- Elefisiologia
Contexto
- Células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) podem diferenciar-se em vários tipos neuronais.
- Compreender as redes neuronais é fundamental para estudar distúrbios neurológicos.
- Matrizes de microeletrodos (MEAs) facilitam a medição da atividade neuronal.
- Protocolos de diferenciação rápida aumentam a eficiência da pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para gerar redes neuronais a partir de hiPSCs.
- Permitir o estudo de mecanismos neurobiológicos e distúrbios neurológicos.
- Fornecer um protocolo que mantenha controle sobre a densidade celular.
Métodos Utilizados
- Preparação de meios de cultura e técnicas de dissociação celular.
- Plaqueamento de hiPSCs em matrizes de microeletrodos.
- Monitoramento de marcadores de diferenciação e maturação neuronais.
- Registros eletrofisiológicos para avaliar a atividade neuronal.
Resultados Principais
- Diferenciação bem-sucedida de hiPSCs em neurônios funcionais.
- Aumento da expressão de marcadores neuronais durante a diferenciação.
- Atividade de potenciais de ação e sináptica demonstrada nos neurônios diferenciados.
- A atividade da rede neuronal aumentou ao longo do tempo, indicando maturação.
Conclusões
- O protocolo modificado permite a geração eficiente de redes neurais.
- Essa técnica pode ser aplicada para estudar diversas questões neurobiológicas.
- Mantém condições estéreis e manipulação cuidadosa são cruciais para o sucesso.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A diferenciação rápida e controlada de hiPSCs em redes neuronais funcionais resolve um gargalo crítico na descoberta de fármacos com foco em neurobiologia. Este protocolo permite a geração reprodutível de neurônios humanos maduros e excitatórios, adequados para ensaios eletrofisiológicos de alto conteúdo, oferecendo confiança preditiva em pesquisas de doenças neurológicas em estágios iniciais. A abordagem aprimora a tomada de decisões em portfólios ao fornecer modelos humanos escalonáveis e relevantes para doenças, destinados à investigação mecanicista e farmacológica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de mecanismos neuronais relevantes para doenças utilizando neurônios excitatórios derivados de humanos.
- Apoia a validação funcional de alvos mediante a medição de respostas eletrofisiológicas em nível de rede.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio de populações neuronais controladas e homogêneas.
- Aprimora a confiabilidade preditiva na seleção e triagem de alvos neurológicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece culturas neuronais padronizadas e reprodutíveis para triagem de compostos posteriores.
- Oferece leituras eletrofisiológicas quantitativas por meio de matrizes de microeletrodos.
- Permite escalabilidade do ensaio e comparabilidade entre estudos por meio do controle explícito da densidade celular.
- Apóia a avaliação confiável de intervenções farmacológicas em redes neuronais humanas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a atividade de redes neurais in vitro com desfechos funcionais relevantes para doenças.
- Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao permitir estudos mecanicistas em linhagens derivadas de pacientes.
- Reduz o risco de translação ao modelar disfunções de redes neurais humanas observadas em distúrbios neurológicos.
- Facilita a descoberta de biomarcadores por meio de medições eletrofisiológicas longitudinais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a geração rápida de redes neuronais humanas funcionais para validação de alvos, triagem e estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias em sistemas neuronais humanos.
- Triagem: Fornece culturas neuronais prontas para ensaios, reprodutíveis, com saídas quantitativas de atividade em rede.
- Análises: Oferece medições eletrofisiológicas e análises estatísticas para comparação de condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro aos mecanismos de doenças e possíveis biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalável e reutilizável para diversos programas de pesquisa neurológica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurológicos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios neuronais.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao permitir a geração robusta de dados em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas para distúrbios neurológicos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura de células-tronco, diferenciação neuronal e análise eletrofisiológica.
- Requer acesso a instrumentação de matriz de microeletrodos e software personalizado de análise de dados.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para densidade celular e protocolos de diferenciação.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de hiPSCs ou modelos de doenças.
- As limitações incluem a necessidade de técnica estéril e manipulação cuidadosa das células para garantir reprodutibilidade.
