Espaciais e temporais Análise do Active ERK na C. elegans germinativa

O objetivo geral deste experimento é testar os níveis ativos de ERK in vivo em gônadas de C. elegans. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de sinalização ERK e células germinativas, como os efeitos de tratamentos medicamentosos ou perturbações genéticas na via RAS-ERK e, portanto, no desenvolvimento de células germinativas. A principal vantagem desta técnica é que o padrão e a força do sinal ERK podem ser quantificados in vivo.

Escolha de 100 a 150 minhocas no estágio de desenvolvimento desejado e colete-as em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de tampão M9. Em seguida, encha o tubo da microcentrífuga com mais 900 microlitros de tampão M9 e centrifugue-o a 1000 vezes g por um minuto em temperatura ambiente. Sob um microscópio de dissecação, remova suavemente 900 microlitros do tampão M9.

Em seguida, repita a lavagem mais duas vezes para remover a maioria das bactérias ligadas. Em seguida, usando uma ponta de micropipeta de 200 microlitros com um furo de extremidade larga, transfira os vermes em 100 microlitros de tampão M9 para um prato de relógio de vidro de fundo plano. Em seguida, adicione um a três microlitros de levamisol 0,1 molar ao prato e agite-o suavemente.

Agora, prenda duas agulhas de calibre 25 a duas seringas para fazer uma ferramenta de dissecação para cada mão. Sob um microscópio de dissecação, posicione cada agulha sob e sobre cada verme e faça um corte fino em cada verme perto do segundo bulbo faríngeo, usando um movimento semelhante a uma tesoura. Corte todos os animais pelo menos uma vez, todos em cinco minutos, para que o Levamisol permaneça eficaz.

É muito importante que a dissecação dos animais no prato seja concluída em menos de cinco minutos. Caso uma gônada extrudada não esteja visível, basta pular esse animal. Gônadas extrudadas adequadas são visíveis aqui.

Após a conclusão da dissecação, sob uma coifa, adicione dois mililitros de paraformaldeído a 3% diretamente no prato de vidro do relógio e cubra-o com Parafilm. Então, espere dez minutos. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur de vidro de nove polegadas, adicione três mililitros de PBS-T ao vidro do relógio e misture a solução usando a pipeta.

Em seguida, usando uma nova pipeta de vidro, retire os cinco mililitros de líquido contendo os vermes e transfira-os para um novo tubo cônico de vidro de cinco mililitros. Em seguida, centrifugue o tubo por 30 segundos em uma centrífuga clínica a 1000 g. Agora, sob um microscópio de dissecação, remova e descarte o sobrenadante sem perturbar os tecidos dissecados.

Em seguida, usando alíquotas de cinco mililitros de PBS-T, repita a etapa de lavagem mais duas vezes e finalize com as minhocas em um pequeno volume de solução. Em seguida, usando uma pipeta de vidro, adicione dois mililitros de metanol 100% e misture suavemente os tecidos, puxando-os para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur nova. Agora, incube o tubo a 20 graus Celsius negativos por pelo menos uma hora.

Após o tratamento com metanol, faça três lavagens de PBS-T e finalize com cerca de 500 microlitros de PBS-T. Agora, usando uma pipeta Pasteur nova, transfira os tecidos para um novo tubo de vidro de um mililitro e deixe-os assentar por gravidade. Após cinco a 10 minutos, use uma pipeta nova e o auxílio de um microscópio para remover o máximo possível da lavagem do tubo sem perturbar os tecidos.

Para iniciar o bloqueio, adicione 100 microlitros de soro de cabra normal a 30%, que é o tampão de bloqueio. Em seguida, cubra o tubo com Parafilm e deixe-o descansar em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, usando um microscópio, remova o máximo de líquido possível com uma nova pipeta.

Em seguida, faça 100 microlitros de anticorpo MAPKYT diluído em um em 400 em 30% NGS e adicione-o aos tecidos. Em seguida, sele o tubo com Parafilm e incube-o durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, aqueça os tubos à temperatura ambiente e adicione 800 microlitros de PBS-T.

Em seguida, coloque a amostra em uma pipeta de vidro nova e solte-a suavemente para obter uma suspensão uniforme. Uma vez que os tecidos tenham se acomodado no fundo, remova cuidadosamente o sobrenadante e repita a lavagem um total de três vezes, sempre usando uma pipeta nova e nunca usando um vórtice. O anticorpo secundário é aplicado exatamente como o primário, apenas uma consideração adicional é dada para manter os tecidos no escuro daqui em diante até que possam ser visualizados.

Após a incubação com o anticorpo secundário, adicione 800 microlitros da solução diluída de DAPI aos tecidos assim que a última lavagem for removida. Cubra a boca do tubo com Parafilm e incube-o em temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente, sob um microscópio de dissecação, remova o máximo possível da solução de DAPI com uma nova pipeta.

Depois de remover a última mancha ou lavagem, adicione uma gota da solução de montagem aos tubos. Agora, prepare uma corrediça de montagem com uma almofada de agarose. Adicione uma gota de 2% de agarose derretida a uma lâmina de vidro limpa e coloque rapidamente uma segunda lâmina limpa perpendicular e em cima da agarose.

Por fim, remova com muito cuidado a lâmina superior do microscópio. Agora, transfira os animais dissecados para a almofada e remova todo o excesso de líquido da almofada com o auxílio de um microscópio. Por fim, aplique uma lamínula de 24 por 50 milímetros sem formar bolhas de ar.

Uma vez aplicada a lamínula, não aplique nenhuma pressão adicional. Isso geralmente resulta em perda de sinal. Imagens representativas de animais hermafroditas adultos do tipo selvagem revelaram que a forma ativa difosforilada de ERK é tipicamente visualizada na região do Paquiteno médio, Zona 1, e nos oócitos mais maduros na Zona 2.

As perturbações neste padrão de ativação refletem mudanças na via de sinalização. As linhas germinativas femininas não especificam espermatozóides e, portanto, não exibem ativação de ERK na Zona 2, com apenas ativação fraca na Zona 1. Uma vez dominada, essa técnica pode levar, no máximo, dois dias, sendo que o primeiro dia leva mais tempo, com uma hora, se executada corretamente.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como RNA de peixe, podem ser usados para quantificar coisas, como o nível de transcrição de RNA, além das informações de abundância de proteínas. Após seu desenvolvimento em 1995, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do desenvolvimento de células germinativas para testar os níveis de abundância de proteínas in vivo e acompanhar a morfologia cromossômica em C. elegans.