Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

O objetivo geral deste procedimento é determinar as forças no ligante do citoesqueleto do nucleoesqueleto, ou complexo LINC, por meio de microscopia FRET em células vivas por meio de um biossensor projetado para a proteína do complexo LINC, nesprina-2G. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da mecanotransdução, como as forças colocadas nas proteínas no núcleo das células vivas e como essas forças mudam sob condições variantes. A principal vantagem dessa técnica é sua capacidade de medir níveis muito pequenos de força em proteínas e células vivas.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em capturar imagens. Otimizar a potência e o ganho do laser do microscópio para receber um bom sinal entre todos os grupos experimentais é difícil. Para começar, cultive células de blasto de fibra NIH 3T3 entre 70% e 90% de confluência em uma placa de cultura de células de seis poços em uma incubadora de cultura de células padrão com regulação de temperatura e CO2.

Em uma capa de cultura de células, remova o meio e enxágue cada poço com aproximadamente 1 mililitro de um meio de células séricas reduzidas. Adicione 800 microlitros de meio de células de soro reduzido a cada poço e coloque a câmara de seis poços na incubadora. Em seguida, pipete 700 microlitros de meio celular sérico reduzido em um tubo de 1,5 mililitro marcado com L com 35 microlitros de solução transportadora lipídica para formar a mistura lipo.

Misture a suspensão por pipetagem. Em seguida, pipete 100 microlitros do meio celular sérico reduzido em cada um dos seis tubos de 1,5 mililitro marcados de um a seis. Pipete o DNA plasmático para o sensor de tensão nesprin, controle de força zero sem cabeça nesprin, mTFP1 e vênus em tubos de um a seis, conforme descrito no protocolo de texto.

Não reutilize as pontas das pipetas ao pipetar diferentes tipos de DNA. Em seguida, pipete 100 microlitros da mistura lipo do tubo L em cada tubo rotulado e misture por pipetagem repetida, usando uma pipeta limpa para cada tubo. Incube a suspensão por 10 a 20 minutos.

Em seguida, adicione 200 microlitros de cada tubo marcado a um poço da câmara de seis poços preparada contendo células. Rotule o topo de cada poço com o DNA correspondente adicionado. Em seguida, coloque a câmara de seis poços em uma incubadora por quatro a seis horas.

Após a incubação, aspire o meio e adicione um a dois mililitros de meio celular sérico reduzido para enxaguar. Aspire o meio celular sérico reduzido e adicione dois mililitros de tripsina a cada poço antes de colocar o prato de seis poços na incubadora por cinco a 15 minutos. Enquanto as células se desprendem na incubadora, cubra seis placas de visualização com fundo de vidro com uma camada de fibronectina a uma concentração de 20 microgramas por mililitro dissolvido em solução salina tamponada com fosfato.

Deixe os pratos revestirem a superfície da capa de cultura de células. Neutralize a tripsina adicionando dois mililitros de DMEM assim que as células forem destacadas. Em seguida, transfira o conteúdo de cada poço para um tubo de centrífuga de 15 mililitros rotulado e gire a 90 vezes g por cinco minutos em uma centrífuga de rotor oscilante.

Aspirar o sobrenadante e ressuspender cada pellet celular em 1.000 microlitros de DMEM usando uma pipeta. Aspire a mistura de fibronectina das placas de vidro e pipete 1.000 microlitros de cada suspensão celular nas placas. Depois que as células se acomodarem no fundo dos pratos de vidro, adicione mais um mililitro de mídia a cada poço.

Deixe as células se conectarem e expressarem o sensor na incubadora de células por pelo menos 18 a 24 horas. Para verificar a eficiência da transfecção, use um microscópio fluorescente equipado com uma frequência de excitação próxima a 462 nanômetros para mTFP1 ou 525 nanômetros para vênus. Use um filtro de emissão centrado perto de 492 nanômetros para mTFP1 ou 525 nanômetros para vênus.

Aproximadamente 18 a 24 horas após a conclusão da transfecção, use um microscópio fluorescente invertido para examinar a eficiência da transfecção, comparando o número de células fluorescentes com o número total de células em vista. Se as células vivas não puderem ser visualizadas dentro de 48 horas após a transfecção, fixe as células em paraformaldeído a 4% por cinco minutos. Permita que as células expressem o sensor por 24 a 48 horas antes da fixação.

Armazene as células no PBS e visualize após 48 horas. Em uma coifa de cultura de células, substitua o meio celular por meio de imagem suplementado com soro bovino fetal a 10%. Coloque os viewpratos em um microscópio confocal com temperatura controlada stage.

Coloque o vidro viewprato com células transfectadas mTFP1 sobre a objetiva de óleo com ampliação de 60X com uma abertura numérica de 1.4. Localize as células que expressam mTFP1 no modo fluorescente de campo amplo. Com uma célula fluorescente no campo de visão, selecione o modo de detecção espectral e capture a imagem espectral.

Inclua todas as frequências além de 458 nanômetros usando incrementos de 10 nanômetros. Selecione uma região fluorescente brilhante na célula. Adicione a média de ROI fluorescente como a intensidade normalizada ao banco de dados espectral clicando em Salvar espectros no banco de dados.

Otimize a potência e o ganho do laser de forma que uma boa relação sinal-ruído seja alcançada. As configurações variam para diferentes equipamentos. Repita o processo para células que expressam vênus e permaneça no modo espectral.

Use uma frequência de excitação de 488 nanômetros em vez de 458 nanômetros. Ajuste as configurações de energia conforme necessário, mas não altere as frequências de emissão. Selecione uma ROI fluorescente brilhante de cerca de um raio de 20 pixels.

Adicione a média de ROI fluorescente como a intensidade normalizada ao banco de dados espectral, clicando em Salvar espectros no banco de dados. Para capturar as imagens não misturadas, primeiro alterne o modo de captura para separação espectral. Adicione as impressões digitais espectrais de Vênus e mTFP1 aos canais de desmistura.

Defina o laser de excitação de volta para uma fonte de argônio de 458 nanômetros. Coloque o sensor de tensão nesprin viewprato acima da objetiva de óleo 60X. Depois de focar em uma célula fluorescente com expressão suficientemente brilhante, ajuste o ganho e a potência do laser para otimizar a relação sinal-ruído.

Capture um mínimo de 15 a 20 imagens de células do sensor de tensão nesprin com brilho relativamente semelhante e evite saturação excessiva de pixels. Repita o processo de captura de imagem com células sem cabeça nesprin usando parâmetros de imagem idênticos. Uma imagem representativa ampliada de 10X de fibroblastos 3T3 transfectados com sensor de tensão de nesprina usando um transportador mediado por lipídios é mostrada aqui.

Normalmente, apenas uma fração das células é transfectada em um determinado campo de visão. Aqui é mostrado um par representativo de dois núcleos 3T3 expressando nesprin-TS nos canais espectralmente não misturados de vênus e mTFP. Uma imagem colorida mesclada dos dois canais é mostrada no painel direito.

Aqui está uma amostra representativa de núcleos mascarados de nesprina-TS de células MDCK estáveis em substratos padronizados e não padronizados. As imagens de razão são definidas como a razão do canal de vênus dividido pelo canal mTFP e podem ser usadas para fazer comparações de força quantitativa relativa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de oito horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de rotular cuidadosamente os tubos de DNA durante a transfecção e manter os parâmetros de imagem constantes durante a captura de imagens de resultados espectrais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transfectar células com o sensor de tensão nesprin e capturar imagens espectralmente resolvidas para o índice FRET do computador que se correlaciona com a força no sensor de tensão. Embora, neste caso, um sensor FRET seja usado para nesprina, ele também pode ser aplicado a outras proteínas na célula onde a força de medição é desejada.