Name: Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a medir forças mecânicas no complexo LINC nuclear usando biosensores FRET em células NIH 3T3 vivas. Este método permite quantificar tensões em proteínas nucleares durante a mecanotransdução celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Thomas F. e Kate Miller Jeffress Memoria Trust (para DEC) e NIH conceder R35GM119617 (a DEC). A imagem ao microscópio confocal foi realizada nas instalações de VCU nanomateriais Caracterização do núcleo (NCC).

1. Obter Nesprin-2G DNA do sensor e outras DNA plasmídeo <ol><li> Obter Nesprin-2G TS (sensor de tensão) de controlo, Nesprin-2G HL (sem cabeça), mTFP1, Vénus, e TSmod a partir de uma fonte comercial. Propagar todos os plasmídeos de ADN e purificá-los utilizando estirpes de E. coli convencionais, tais como DH5-α, como descrito anteriormente 12, 13. </li></ol> 2. Células transfectar com Nesprin-2G e outro ADN de plasmídeo <ol><li> Cultivar células de fibroblastos NIH 3T3 de 70-90% de confluência numa placa de cultura de células de 6 poços numa incubadora de cultura de células padrão com temperatura (37 ° C) e a regulação de CO 2 (5%). Para o meio de crescimento celular, uso de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo. </li><li> Num capuz de cultura de célula, remover o meio e lavar cada poço com aproximadamente 1 mL de um meio de células de soro reduzido. Adicionar 800? L de meio celular reduzida de soro a cada poçoe colocar a câmara de 6 poços na incubadora. </li><li> Pipetar 700 L de meio celular reduzida-soro para um tubo de 1,5 mL com 35 uL de uma solução de veículo lipídico para formar o &quot;lipomix&quot;. Misturar por pipetagem. Rotular o tubo com um &quot;L.&quot; </li><li> Reunir seis tubos de 1,5 mL e classificá-los 1 a 6. Pipetar 100 L de meio celular reduzida de soro a cada tubo. <ol><li> Usando a concentração de DNA de plasmídeo a partir do passo 1, pipeta de 2 ug de Nesprin 2G-TS para tubos 1 e 2. Pipetar 2 ug de Nesprin-HL em tubos 3 e 4. pipeta de 1 ug de mTFP em tubo 5. Pipetar 1 ug de mVenus no tubo 6. não reutilizar pontas de pipeta ao pipetar diferentes tipos de DNA. </li></ol></li><li> Pipeta 100 uL da lipomix do &quot;L&quot; do tubo em cada tubo rotulado (1-6) e misturar por pipetagem repetida. Usar uma pipeta para cada tubo limpo. Incubar durante 10-20 minutos. </li><li> Adicionar 200 ul de cada tubo rotulado para um poço na câmara de 6 poços com 70-90% confluentecélulas. Rotular o topo de cada poço com o ADN correspondente adicionado. Coloque a câmara de 6 cavidades em uma incubadora durante 4-6 h. </li><li> Aspirar o meio e adicionar 1-2 mL de meio celular reduzida de soro para enxaguar. Aspirar o meio celular reduzida de soro, adiciona-se 2 mL de tripsina a cada poço, e colocar o prato de 6 poços na incubadora (5-15 min). </li><li> Enquanto as células separar na incubadora, revestimento 6 com fundo de vidro visualização pratos com uma camada de fibronectina numa concentração de 20 ug / mL dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Permitir que os pratos para revestir a superfície da capa de cultura de células (aproximadamente 20 min). </li><li> Neutraliza-se a tripsina por adição de 2 ml de DMEM uma vez que as células são separadas. </li><li> Transferir o conteúdo de cada cavidade para um tubo de centrífuga de 15 mL etiquetados e girar para baixo em 90 xg durante 5 minutos numa centrífuga de rotor oscilante. Aspirar o sobrenadante e re-suspender cada pelete de células em 1000 uL de DMEM por mistura pipeta. </li><li> Aspirar a mistura de fibronectina a partir dapratos de vidro e pipeta de 1000 L de cada suspensão de células para a pratos de vidro. </li><li> Após as células se depositam no fundo dos pratos de vidro (~ 15 min), adicionar outro 1 mL de DMEM + FBS a 10% + 1% de Pen-Strep a cada poço e lugar na incubadora celular. Permitir que as células se fixem e expressar sensor para, pelo menos, 18-24 horas. NOTA: As células são transfectadas utilizando reagentes lipídicos catiónicos comerciais de transfecção (ver a Tabela de Materiais). Em alternativa, linhas de células estáveis podem ser seleccionados utilizando um plasmídeo com um gene que confere resistência a uma toxina (os plasmídeos pcDNA para Nesprin-TS e -HL estão disponíveis em um site repositório de ADN (ver a Tabela de Materiais) proporcionar células que expressam resistência a geneticina ). Além disso, os métodos de infecção viral (lentivus, retrovus, ou adenovus) pode ser utilizada para expressar o sensor em células que são difíceis de transfectar. </li><li> Além Nesprin-TS, transfectar células adicionais com o Nesprin HL-zero parace controlo, como descrito nos passos 2.1-2.12; TSmod também pode ser usado como um controlo da força de zero e deve exibir TERF semelhante ao Nesprin-HL. </li><li> células transfectar com mTFP1 e Vénus para gerar impressões espectrais (ver passo 4). NOTA: mTFP1 e Vénus expressam tipicamente a níveis mais elevados do que Nesprin-TS, e como tal, os valores mais baixos de ADN podem necessitar de ser transfectadas para alcançar níveis de expressão semelhantes. </li></ol> 3. Verificar a eficiência de transfecção <ol><li> Cerca de 18-24 h depois de completar a transfecção, usar um microscópio de fluorescência invertido para examinar a eficiência de transfecção pela comparação do número de células fluorescentes para o número total de células em vista (geralmente 5-30%). <ol><li> Usar um microscópio de fluorescência equipado com uma frequência de excitação perto de 462 nm (mTFP1) ou 525 nm (Vénus) e um filtro de emissão centrada perto de 492 nm (mTFP1) ou 525 nm (Vénus). NOTA: Como alternativa, GFP conjuntos de filtros irá capturar uma combinação de mTFP1 e veemissões nus e vai permitir a confirmação da eficiência de transfecção. </li></ol></li><li> células vivas imagem dentro de 48 h após a transfecção. <ol><li> Alternativamente, as células fixar em paraformaldeo a 4% (em PBS com cálcio e magnésio) durante 5 min, armazenamento em PBS, e vista depois de 48 h 8. NOTA: Beyond 48 h, a qualidade e força do sinal decai. A fixação das células preserva o seu estado, incluindo a FRET ser expresso 8; no entanto, apenas as células devem ser trabalhada em PBS, como meio de montagem pode afectar FRET 14. As células fixadas só pode ser comparada a outras células fixadas, como pode haver uma mudança na expressão. Cuidado: O paraformaldeído é tóxico. Use equipamento de proteção pessoal adequado (EPI). </li></ol></li></ol> 4. Captura Spectral Impressões digitais do mTFP1 e Vênus fluoróforos para de Mistura Espectral <ol><li> Num capuz de cultura de células, substituir o meio de células com mediu imagiologiam (tamponado com HEPES) suplementado com soro bovino fetal a 10%. </li><li> Colocar os pratos entrando num (37 ° C) fase microscópio confocal com temperatura controlada. </li><li> Colocar o prato de vidro de visualização com células mTFP1-transfectadas sobre o objectivo de óleo a 60X de ampliação com uma abertura numérica de 1,4. NOTA: O óleo é usado em um microscópio de varredura a laser no objectivo 60X para se assemelham o índice de refração do substrato de vidro. O óleo é colocado em cima da lente da objectiva e entra em contacto directo com a lamela de vidro. </li><li> Localizar mTFP1 células que expressam com uma fonte de excitação de 458 nm e um filtro de passagem de banda de emissão centrado a 500 nm. </li><li> Com uma célula fluorescente no campo de visão, selecione o modo de detecção espectral ( &quot;Modo Lambda&quot; no software usado aqui) e capturar a imagem espectral (Figura 3-1); incluem todas as frequências para além de 458 nm, utilizando incrementos de 10 nm (Figura 3-3). Selecione um fluores brilhanteregião ENT (ROI) da célula (raio de 20 pixels). NOTA: A forma espectral do mTFP1 expressando ROI deve permanecer relativamente constante através da célula. Se a forma varia consideravelmente, re-ajustar o laser e ganhar configurações para melhorar a relação sinal-ruído. </li><li> Adicione o ROI fluorescente dizer, intensidade normalizada ao banco de dados espectrais, clicando em &quot;salvar espectros de banco de dados.&quot; </li><li> Optimizar a potência do laser e ganhar de tal forma que uma boa relação sinal-ruído é alcançada. Configurações irá variar para diferentes equipamentos. Usando células não fluorescentes, não transf ectadas como um quadro de referência, e aumentar o ganho de potência até que as células são brilhantes, mas não para além da gama dinâmica do detector (ponto de saturação). células de fundo não deve ter fluorescência detectável após uma média. </li><li> Repetir o processo para as células Vénus-transfectadas com as seguintes excepções: <ol><li> Assegure-se que a frequência de excitação é de 515 nm e que o filtro passa-banda é centered perto de 530 nm, quando a localização de células Vénus-exprimem. </li><li> Em &quot;modo espectral,&quot; usar uma frequência de excitação de 515 nm em vez de 458 nm. </li></ol></li></ol> 5. Captura de Imagens Unmixed <ol><li> Mude o modo de captura para &quot;de Mistura Espectral.&quot; </li><li> Adicionar as impressões espectrais de Vénus e mTFP1 para os canais de desmistura (Figura 3, Seta-2). </li><li> Defina o laser de excitação de volta para uma fonte de argônio 458 nm. </li><li> Coloque o prato visualização Nesprin-TS acima do objetivo de petróleo 60X. </li><li> Depois de se concentrar em uma célula fluorescente com expressão suficientemente brilhante, ajustar o poder de ganho e de laser para otimizar a relação sinal-ruído. NOTA: Uma vez que a eficiência FRET de Nesprin-TS está perto de 20%, a imagem venus sem mistura deve ser substancialmente mais fraca do que a imagem mTFP1 sem mistura. Uma vez que uma configuração de energia e ganho aceitável foram determinados de forma iterativa, estes parâmetros devem permanecer constante para todas as imagens captured. </li><li> Capturar um mínimo de 15-20 imagens de células Nesprin-TS com um brilho relativamente similares e evitar a saturação de pixel excessiva (todos os pixels saturados são removidos durante o processamento de imagem). </li><li> Repetir o processo de captura de imagens com as células HL-Nesprin usando parâmetros de imagem idênticos. </li></ol> Processamento 6. Imagem e Análise de Imagem Rácio <ol><li> (Fiji) software ImageJ usando open-source (http://fiji.sc/), imagens no formato nativo abertos usando BioFormats Reader. </li><li> Pré-processar as imagens e calcular as imagens de escala utilizando protocolos previamente estabelecidos 15. </li></ol>

<ol><li>Conway, D. E., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+cellular+mechanotransduction+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis.</a> J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li>
<li>Austen, K., Ringer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+rigidity+sensing+by+talin+isoform-specific+mechanical+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages.</a> Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).</li>
<li>Meng, F., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dynamic+cytoplasmic+forces+with+a+compliance-matched+FRET+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor.</a> J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).</li>
<li>Borghi, N., Sorokina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+under+constitutive+actomyosin-generated+tension+that+is+increased+at+cell-cell+contacts+upon+externally+applied+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).</li>
<li>Cai, D., Chen, S. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Feedback+through+E-Cadherin+Promotes+Direction+Sensing+during+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration.</a> Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).</li>
<li>Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+Shear+Stress+on+Endothelial+Cells+Modulates+Mechanical+Tension+across+VE-Cadherin+and+PECAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio+CB%22%5BJournal%5D)">Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1.</a> Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).</li>
<li>Brenner, M. D., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact%2C+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li>
<li>Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282499670_Controlling_Cell_Geometry_Affects_the_Spatial_Distribution_of_Load_Across_Vinculin">Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).</li>
<li>Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+molecular+interactions+of+linker+of+nucleoskeleton+and+cytoskeleton+%28LINC%29+complex+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins.</a> J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> J Vis Exp. (6), e247(2007).</li>
<li>Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+mounting+and+sealing+with+nail+polish+of+cell+specimens+lead+to+incorrect+FRET+measurements+using+acceptor+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching.</a> Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).</li>
<li>Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+activity+in+live+embryos+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).</li>
<li>Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+deformation+of+the+nucleus+in+micropipette+aspiration+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment.</a> J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).</li>
<li>Wang, N., Naruse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).</li>
<li>Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+stabilize+the+position+of+intranuclear+DNA+through+mechanical+connection+with+the+nucleus+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells.</a> FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).</li>
<li>Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+arrays+of+nuclear+envelope+proteins+harness+retrograde+actin+flow+for+nuclear+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement.</a> Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).</li>
<li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction%2C+imaging%2C+and+analysis+of+FRET-based+tension+sensors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells.</a> Methods Cell Biol. , (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Um método e demonstração da imagem de células vivas da tensão mecânica através Nesprin-2G, uma proteína no complexo nuclear LINC, foi descrito acima. Antes deste trabalho, várias técnicas, tais como a aspiração micropipeta, magnético-grânulo citometria, e microscopia laser de ablação, têm sido usados para aplicar pressão sobre o núcleo da célula e para medir as suas propriedades de material a granel 16, 17, 18. No ...

Sensível à força, sensores de FRET geneticamente codificados surgiram recentemente como uma ferramenta importante para a medição de forças de tracção baseada em células vivas, fornecendo informações sobre como as forças mecânicas são aplicados em proteínas 1, 2, 3, 4. Com essas ferramentas, os pesquisadores podem imagem não-invasiva forças intracelulares em células vivas usando microscópios fluorescentes convencionais. Estes sensores consistem de um par de FRET (proteínas fluorescentes dadores e aceitador, mais frequentemente um dador e aceitador de azul amarela), separadas por um péptido elástica 3. Em contraste para C- ou codificação N-terminal, este sensor está inserido num local interno de uma proteína para medir a força mecânica transmitidos através da proteína, comportando-se como um medidor de tensão molecular. O aumento da tensão mecânica entre os resultados de sensores num aumento da distância entre a FRET-par, o que resulta em diminuição de FRET 3. Como resultado, a FRET é inversamente proporcional à força de tracção. Estes sensores fluorescentes de base têm sido desenvolvidos para proteínas de adesão focal (vinculina 3 e talina 4), as proteínas do citoesqueleto (α-actinina 5), e proteínas de junção célula-célula (E-caderina 6, 7, VE-caderina 8, e PECAM 8). O ligante elástico mais frequentemente utilizados e bem caracterizado nestes biossensores é conhecido como TSmod e consiste de uma sequência repetitiva de 40 aminoácidos, (GPGGA) 8, o qual foi derivado a partir da protea de seda de aranha flageliforme. TSmod tem sido demonstrado que se comportam como um nano-mola elástica linear, com a capacidade de resposta de FRET para 1 a 5 pN de força de tracção 3. Diferentes comprimentos de flageliforme pode ser utilizada para alterar o r dinâmicoange de sensibilidade à força de FRET TSmod 9. Além flageliformes, espectrina repete péptido peça de cabeça 5 e a vilina (conhecido como HP35) 4 têm sido usados como os péptidos elásticas entre pares de FRET em força biossensores semelhantes 4. Finalmente, um relatório recente mostrou que TSmod também pode ser usado para detectar as forças de compressão 10. Desenvolvemos recentemente um sensor de força para o ligante da nucleo-citoesqueleto (LINC) proteína complexo Nesprin2G usando TSmod inserido numa proteína truncada Nesprin2G anteriormente desenvolvido conhecido como mini-Nesprin2G (Figura 2C), o qual se comporta de forma semelhante ao endógeno Nesprin-2G 11. O complexo LINC contém várias proteínas que conduzem a partir do exterior para o interior do núcleo, ligando o citoesqueleto citoplasmática para a lâmina nuclear. Nesprin-2G vincula uma proteína estrutural de tanto ocitoesqueleto de actina no citoplasma e para proteínas sol no espaço perinuclear. Usando nosso biossensor, fomos capazes de mostrar que Nesprin-2G está sujeita a tensão dependente da actomiosina em NIH3T3 fibroblastos 2. Esta foi a primeira vez que a força foi medida diretamente através de uma proteína no complexo LINC nuclear, e é provável que se torne uma ferramenta importante para compreender o papel da força no núcleo em mechanobiology. O protocolo abaixo fornece uma metodologia detalhada de como utilizar o sensor de força Nesprin-2G, incluindo a expressão do sensor de tensão Nesprin (Nesprin-TS) em células de mamífero, bem como a aquisição e análise de imagens FRET de células que expressam Nesprin- TS. Usando um microscópio confocal invertido equipado com um detector espectral, uma descrição de como medir emissão sensibilizados FRET utilizando a separação espectral e imagiologia de FRET raciométrica é fornecido. As imagens raciométrica saída pode ser usado para fazer qua relativacomparações força ntitative. Embora este protocolo é focado sobre a expressão de Nesprin-TS em fibroblastos, é facilmente adaptável a outras células de mamíferos, incluindo ambas as linhas celulares e células primárias. Além disso, este protocolo, uma vez que refere-se a aquisição de imagem e análise de FRET pode ser facilmente adaptada para outros biossensores baseados em FRET força que têm sido desenvolvidos para outras proteínas.

<table><tbody><tr><td>Nesprin-TS DNA</td><td>Addgene</td><td>68127</td><td>Recuperar de https://www.addgene.org/68127/</td></tr> <tr><td>Nesprin-HL DNA</td><td>Addgene</td><td>68128</td><td>Recuperar de https://www.addgene.org/68128/</td></tr> <tr><td>mTFP1 DNA</td><td>Addgene</td><td>54613</td><td>Recuperar de https://www.addgene.org/54613/</td></tr> <tr><td>mVenus DNA</td><td>Addgene</td><td>27793</td><td>Recuperar de https://www.addgene.org/27793/</td></tr><tr><td>TSmod DNA</td><td>Addgene</td><td>26021</td><td>Recuperar de células https://www.addgene.org/26021/</td></tr> <tr><td>competentes</td><td>Bioline</td><td>BIO-85026</td><td></td></tr><tr><td>Liquid LB Media</td><td>ThermoFisher</td><td>10855001</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001</td></tr><tr><td>Solid LB Placas de cultura bacteriana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Biorad</td><td>273 BR 07335</td><td>Cubeta de quartzo SmartSpec Plus</td></tr><tr><td></td><td>Cubeta</td><td>de 1702504</td><td>Biorad para SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de DNA</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740412.5</td><td>NucleoBond Xtra Midi Plus</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Falcon-Corning</td><td>353046</td><td>Multiwell Placa de cultura de polistreno de 6 poços</td></tr><tr><td>Meio de águia modificado de Dulbecco, (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM(1x)</td></tr><tr><td>Soro bovino</td><td>Life Technologies</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>mídia de células de soro reduzido</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Meio de soro reduzido, "optimem"</td></tr><tr><td>Lipídio Solução transportadora</td><td>invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reagente lipídico, "Lipofectamine 2000"</td></tr><tr><td>Tubo de plástico estéril de 1,5 mL</td><td>Denville</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td></tr> <tr><td>prato de visualização de microscópio com fundo de vidro</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>prato de 35 mm com poço de fundo de 20 mm #1,5 vidro</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>ThermoFisher</td><td>33016015</td><td>fibronectina proteína humana, plasma</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td></tr><tr><td>15 mL tubo de centrífuga estéril</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de rotor oscilante&nbsp;</td><td>Thermo electron</td><td>Centra CL2</td><td>Rotor oscilante thermo electron 236</td></tr><tr><td>capa de biossegurança para cultura de células</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de cultura de células climatizada</td><td>ThermoFisher</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>microscópio fluorescente de campo amplo com LED invertido</td> Life <td>technologies</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Clear HEPES tamponado meios de imagem</td><td>Sondas moleculares</td><td></td><td></td>A14291DJ</tr><tr><td>Fetal bovino Serum</td><td>Life technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura Controlada-Confocal invertida com fontes de laser de 458 e 515 nm&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp; LSM 710-w/detector</td><td></td>META espectral</tr><tr><td>Mídia de Crescimento</td><td>Newengland Biolabs</td><td>B9020s</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Fibroblastos</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo para usar a transferência de förster ressonância energia (fret) biossensores -force medir forças mecânicas em todo o complexo linc nuclear

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

O complexo LINC foi hipotetizado como a estrutura crítica que medeia a transferência de forças mecânicas do citoesqueleto para o núcleo. A nesprina-2G é um componente-chave do complexo LINC que conecta o citoesqueleto de actina às proteínas de membrana (proteínas de domínio SUN) no espaço perinuclear. Essas proteínas de membrana se conectam às lâminas dentro do núcleo. Recentemente, uma sonda de força de transferência de energia de ressonância (FRET) de Förster foi clonada em mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (sensor de tensão)) e usada para medir a tensão através do Nesprin-2G em fibroblastos NIH3T3 vivos. Este artigo descreve o processo de uso de Nesprin-TS para medir as forças do complexo LINC em fibroblastos NIH3T3. Para extrair informações de FRET do Nesprin-TS, também é apresentado um esboço de como desmisturar espectralmente imagens espectrais brutas em canais fluorescentes aceitadores e doadores. Usando software de código aberto (ImageJ), as imagens são pré-processadas e transformadas em imagens raciométricas. Finalmente, os dados FRET de Nesprin-TS são apresentados, juntamente com estratégias de como comparar dados entre diferentes grupos experimentais.

Seguindo o protocolo acima, o DNA de plasmídeo foi adquirida a partir do repositório de ADN e transformado em células de E. coli. E. coli que expressam o ADN do sensor foram seleccionados a partir de placas de LB / Ampicilina e amplificado em um caldo de LB líquido. Após a amplificação dos vectores, plasmídeos de ADN foram purificados em tampão TRIS-EDTA utilizando um padrão, disponíveis comercialmente kit de isolamento de ADN. Usando um espectrofotómetro, o ADN purific...

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar as forças no ligante do citoesqueleto do nucleoesqueleto, ou complexo LINC, por meio de microscopia FRET em células vivas por meio de um biossensor projetado para a proteína do complexo LINC, nesprina-2G. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da mecanotransdução, como as forças colocadas nas proteínas no núcleo das células vivas e como essas forças mudam sob condições variantes. A principal vantagem dessa técnica é sua capacidade de medir níveis muito pequenos de força em proteínas e células vivas.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em capturar imagens. Otimizar a potência e o ganho do laser do microscópio para receber um bom sinal entre todos os grupos experimentais é difícil. Para começar, cultive células de blasto de fibra NIH 3T3 entre 70% e 90% de confluência em uma placa de cultura de células de seis poços em uma incubadora de cultura de células padrão com regulação de temperatura e CO2.Em uma capa de cultura de células, remova o meio e enxágue cada poço com aproximadamente 1 mililitro de um meio de células séricas reduzidas. Adicione 800 microlitros de meio de células de soro reduzido a cada poço e coloque a câmara de seis poços na incubadora. Em seguida, pipete 700 microlitros de meio celular sérico reduzido em um tubo de 1,5 mililitro marcado com L com 35 microlitros de solução transportadora lipídica para formar a mistura lipo.Misture a suspensão por pipetagem. Em seguida, pipete 100 microlitros do meio celular sérico reduzido em cada um dos seis tubos de 1,5 mililitro marcados de um a seis. Pipete o DNA plasmático para o sensor de tensão nesprin, controle de força zero sem cabeça nesprin, mTFP1 e vênus em tubos de um a seis, conforme descrito no protocolo de texto.Não reutilize as pontas das pipetas ao pipetar diferentes tipos de DNA. Em seguida, pipete 100 microlitros da mistura lipo do tubo L em cada tubo rotulado e misture por pipetagem repetida, usando uma pipeta limpa para cada tubo. Incube a suspensão por 10 a 20 minutos.Em seguida, adicione 200 microlitros de cada tubo marcado a um poço da câmara de seis poços preparada contendo células. Rotule o topo de cada poço com o DNA correspondente adicionado. Em seguida, coloque a câmara de seis poços em uma incubadora por quatro a seis horas.Após a incubação, aspire o meio e adicione um a dois mililitros de meio celular sérico reduzido para enxaguar. Aspire o meio celular sérico reduzido e adicione dois mililitros de tripsina a cada poço antes de colocar o prato de seis poços na incubadora por cinco a 15 minutos. Enquanto as células se desprendem na incubadora, cubra seis placas de visualização com fundo de vidro com uma camada de fibronectina a uma concentração de 20 microgramas por mililitro dissolvido em solução salina tamponada com fosfato.Deixe os pratos revestirem a superfície da capa de cultura de células. Neutralize a tripsina adicionando dois mililitros de DMEM assim que as células forem destacadas. Em seguida, transfira o conteúdo de cada poço para um tubo de centrífuga de 15 mililitros rotulado e gire a 90 vezes g por cinco minutos em uma centrífuga de rotor oscilante.Aspirar o sobrenadante e ressuspender cada pellet celular em 1.000 microlitros de DMEM usando uma pipeta. Aspire a mistura de fibronectina das placas de vidro e pipete 1.000 microlitros de cada suspensão celular nas placas. Depois que as células se acomodarem no fundo dos pratos de vidro, adicione mais um mililitro de mídia a cada poço.Deixe as células se conectarem e expressarem o sensor na incubadora de células por pelo menos 18 a 24 horas. Para verificar a eficiência da transfecção, use um microscópio fluorescente equipado com uma frequência de excitação próxima a 462 nanômetros para mTFP1 ou 525 nanômetros para vênus. Use um filtro de emissão centrado perto de 492 nanômetros para mTFP1 ou 525 nanômetros para vênus.Aproximadamente 18 a 24 horas após a conclusão da transfecção, use um microscópio fluorescente invertido para examinar a eficiência da transfecção, comparando o número de células fluorescentes com o número total de células em vista. Se as células vivas não puderem ser visualizadas dentro de 48 horas após a transfecção, fixe as células em paraformaldeído a 4% por cinco minutos. Permita que as células expressem o sensor por 24 a 48 horas antes da fixação.Armazene as células no PBS e visualize após 48 horas. Em uma coifa de cultura de células, substitua o meio celular por meio de imagem suplementado com soro bovino fetal a 10%. Coloque os viewpratos em um microscópio confocal com temperatura controlada stage.Coloque o vidro viewprato com células transfectadas mTFP1 sobre a objetiva de óleo com ampliação de 60X com uma abertura numérica de 1.4. Localize as células que expressam mTFP1 no modo fluorescente de campo amplo. Com uma célula fluorescente no campo de visão, selecione o modo de detecção espectral e capture a imagem espectral.Inclua todas as frequências além de 458 nanômetros usando incrementos de 10 nanômetros. Selecione uma região fluorescente brilhante na célula. Adicione a média de ROI fluorescente como a intensidade normalizada ao banco de dados espectral clicando em Salvar espectros no banco de dados.Otimize a potência e o ganho do laser de forma que uma boa relação sinal-ruído seja alcançada. As configurações variam para diferentes equipamentos. Repita o processo para células que expressam vênus e permaneça no modo espectral.Use uma frequência de excitação de 488 nanômetros em vez de 458 nanômetros. Ajuste as configurações de energia conforme necessário, mas não altere as frequências de emissão. Selecione uma ROI fluorescente brilhante de cerca de um raio de 20 pixels.Adicione a média de ROI fluorescente como a intensidade normalizada ao banco de dados espectral, clicando em Salvar espectros no banco de dados. Para capturar as imagens não misturadas, primeiro alterne o modo de captura para separação espectral. Adicione as impressões digitais espectrais de Vênus e mTFP1 aos canais de desmistura.Defina o laser de excitação de volta para uma fonte de argônio de 458 nanômetros. Coloque o sensor de tensão nesprin viewprato acima da objetiva de óleo 60X. Depois de focar em uma célula fluorescente com expressão suficientemente brilhante, ajuste o ganho e a potência do laser para otimizar a relação sinal-ruído.Capture um mínimo de 15 a 20 imagens de células do sensor de tensão nesprin com brilho relativamente semelhante e evite saturação excessiva de pixels. Repita o processo de captura de imagem com células sem cabeça nesprin usando parâmetros de imagem idênticos. Uma imagem representativa ampliada de 10X de fibroblastos 3T3 transfectados com sensor de tensão de nesprina usando um transportador mediado por lipídios é mostrada aqui.Normalmente, apenas uma fração das células é transfectada em um determinado campo de visão. Aqui é mostrado um par representativo de dois núcleos 3T3 expressando nesprin-TS nos canais espectralmente não misturados de vênus e mTFP. Uma imagem colorida mesclada dos dois canais é mostrada no painel direito.Aqui está uma amostra representativa de núcleos mascarados de nesprina-TS de células MDCK estáveis em substratos padronizados e não padronizados. As imagens de razão são definidas como a razão do canal de vênus dividido pelo canal mTFP e podem ser usadas para fazer comparações de força quantitativa relativa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de oito horas se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de rotular cuidadosamente os tubos de DNA durante a transfecção e manter os parâmetros de imagem constantes durante a captura de imagens de resultados espectrais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transfectar células com o sensor de tensão nesprin e capturar imagens espectralmente resolvidas para o índice FRET do computador que se correlaciona com a força no sensor de tensão. Embora, neste caso, um sensor FRET seja usado para nesprina, ele também pode ser aplicado a outras proteínas na célula onde a força de medição é desejada.

a-protocol-for-using-frster-resonance-energy-transfer-fret-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste artigo, descrevem a utilização de uma pinça magnéticos para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática no nível única molécula de uma maneira altamente paralelizável.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Neste protocolo, descrevemos um método de micropipeta para aplicar directamente uma força controlada para o núcleo de uma célula viva. Este ensaio permite interrogatório das propriedades mecânicas nucleares na célula viva, aderente.

Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Apresenta-se aqui um protocolo abrangente para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores processivos de miosina-5, que poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos. O protocolo detalha todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparato experimental até a preparação da amostra, aquisição e análise dos dados.

Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

O estudo detalha a metodologia do mapeamento da FRET, incluindo a seleção de sites de rotulagem, escolha de corantes, aquisição e análise de dados. Essa metodologia é eficaz na determinação de locais de ligação, alterações conformais e movimentos dinâmicos em sistemas proteicos e é mais útil se realizada em conjunto com as informações estruturais 3D existentes.

Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

A espectroscopia de força de conjunto (EFS) é uma técnica robusta para desdobramento mecânico e detecção em tempo real de um conjunto de estruturas biomoleculares em campos biofísicos e de biossensoriamento.

Espectroscopia de Força de Ensemble por Forças de Cisalhamento

Aprenda a medir forças mecânicas no complexo LINC nuclear usando biosensores FRET em células NIH 3T3 vivas. Este método permite quantificar tensões em proteínas nucleares durante a mecanotransdução celular.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear (Vídeo) | JoVE Journal

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Explorar mais vídeos