Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

O objetivo geral deste procedimento é entregar células tumorais diretamente ao fígado murino para a modelagem experimental de metástases hepáticas de câncer de mama. Este método pode ser usado para estudar os estágios posteriores da cascata metastática no fígado murino. Incluindo extravasamento, semeadura, morte, proliferação e dormência de células de câncer de mama, bem como crescimento.

A principal vantagem dessa técnica é que ela entrega células tumorais diretamente ao fígado sem a remoção do baço ou metástase concomitante de múltiplos órgãos. A demonstração visual desse método é crítica, pois a injeção da veia porta requer manipulações precisas que dependem da vigilância anatômica direta. Ajudando-me com este procedimento estará Alexandra Quackenbush, uma estudante de pós-graduação no laboratório de Pepershadine.

Antes de iniciar o procedimento, limpe todas as superfícies da área cirúrgica com alvejante a 10%. Uma hora antes das injeções, trate camundongos fêmeas balb / c de oito a 15 semanas de idade com 100 microlitros de analgesia por via subcutânea para controle da dor. Aplique pomada nos olhos do animal.

Em seguida, coloque os camundongos em decúbito dorsal e confirme o nível apropriado de sedação beliscando o dedo do pé. Em seguida, desinfete as áreas cirúrgicas e circundantes do animal, incluindo a cauda, com três lenços umedecidos em gaze 2% embebidos em gaze e dois lenços umedecidos em álcool e dois lenços umedecidos em álcool. Após o último lenço de clorexidina, use um bisturi estéril para fazer uma incisão de uma polegada na pele entre os planos mediano e sagital no lado esquerdo do camundongo, começando logo abaixo das costelas e terminando acima da quarta tetina da glândula mamária inguinal, seguida por uma incisão semelhante de uma polegada através do peritônio.

Agora pipete as células tumorais para cima e para baixo várias vezes para ressuspender a solução celular e carregue uma seringa de agulha removível de 25 microlitros, equipada com uma agulha de calibre 32, com 10 microlitros das células. Pressione o êmbolo até que as células estejam na ponta da agulha e o êmbolo esteja no volume apropriado para injeção. Limpe a parte externa da agulha carregada com uma compressa de álcool estéril para remover quaisquer células tumorais externas, tomando cuidado para evitar picadas de agulha.

Em seguida, segurando a pele e o revestimento peritoneal do lado mediano da incisão com a pinça, use um cotonete estéril para mover cuidadosamente os intestinos grosso e delgado para uma gaze estéril, embebida em solução salina estéril. Cubra os órgãos internos com gaze embebida em solução salina para manter a umidade interna e a esterilidade. Quando a veia porta estiver visível, peça a um assistente que segure suavemente os intestinos fora do caminho para expor a veia porta com um cotonete estéril e insira a agulha de três a cinco milímetros na veia porta, aproximadamente 10 milímetros abaixo do fígado, em um ângulo inferior a 5 graus, com o lado chanfrado para cima.

Injete lentamente todo o volume de células tumorais, permitindo que o sangue passe pela cabeça da agulha por vários segundos para evitar um refluxo das células tumorais para fora da veia. Como a visualização, o acesso e a injeção adequados na veia porta são essenciais, reserve um tempo para garantir que o posicionamento da veia porta, em relação à agulha, seja satisfatório antes de tentar a injeção. Quando todas as células tiverem sido injetadas, remova a agulha enquanto aplica simultaneamente uma leve pressão na veia com um aplicador de ponta de algodão estéril.

Em seguida, use um novo aplicador de ponta de algodão estéril para segurar um pedaço quadrado de gaze hemostática de 0,5 a um centímetro sobre o local da injeção. Após cinco minutos, levante cuidadosamente a gaze para avaliar o fechamento da veia. Quando o fluxo sanguíneo cessar completamente, remova a gaze e retorne os intestinos à cavidade abdominal.

Usando um padrão de sutura simples contínuo ou interrompido, feche o revestimento peritoneal com a sutura estéril de quatro zero vicryl e afunilamento. Após fechar a pele da mesma maneira, injetar 100 microlitros de anestésico local ao longo do local da incisão, seguido de administração subcutânea de 0,5 mililitros de solução salina estéril. A identificação anatômica precisa da veia porta e a injeção intraportal bem-sucedida podem ser confirmadas praticando o protocolo de injeção com tinta nanquim ou corante similar.

Com uma injeção correta através da veia porta, resultando na entrega imediata e específica da tinta ao fígado sem se espalhar para o pulmão. Usando células tumorais de memória de camundongo marcadas com GFP, a dispersão de células tumorais por todo o fígado é aparente 90 minutos após a injeção, confirmando uma entrega bem-sucedida da veia porta ao fígado. As células tumorais são encontradas dentro dos sinusóides, bem como dentro do parênquima hepático, nas proximidades das tríades portais, onde o sangue da veia porta entra no fígado, sugerindo que o extravasamento ativo de células tumorais está ocorrendo neste momento.

Conforme demonstrado por essas curvas de sobrevivência, a transferência da veia porta adotiva de linhagens celulares tumorais mamárias agressivas resulta em taxas de sobrevida livres de metástases mais curtas em comparação com camundongos injetados com uma linhagem celular tumoral menos agressiva. As metástases desses animais podem ser confirmadas pela seccionamento através do fígado em níveis de 250 mícrons e subsequente análise de H & E das amostras. Além disso, a análise de imunofluorescência é útil para análises de lesões micro e macro metastáticas de linhagens singênicas não marcadas, como a linha tumoral D2A1, que são CD45 negativas, Heppar-1 negativas e CK18 positivas, conforme demonstrado nessas imagens representativas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 12 a 14 minutos por mouse, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de levar o tempo necessário para visualizar e acessar adequadamente a veia porta antes de tentar a injeção. Após este procedimento, outros métodos, como imagens intravitais após a injeção de células tumorais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como as células tumorais interagem com o ambiente lubramicro.

Com seu desenvolvimento, essa técnica permite que pesquisadores no campo da metástase explorem estágios posteriores da cascata metastática de vários cânceres em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de onde fazer a incisão cirúrgica, como mover suavemente os órgãos internos para acessar a veia porta e como realizar a injeção intraportal. Não se esqueça, trabalhar com seringas carregadas com células tumorais pode ser perigoso e que devem ser tomadas precauções para evitar picadas de agulha durante a realização deste procedimento.