Name: Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a injeção na veia porta para estudar metástase hepática de câncer de mama em camundongos imunocompetentes. Este método permite investigar estágios tardios da cascata metastática no fígado murino.

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Os autores gostariam de agradecer a Alexandra Quackenbush por auxiliar nos procedimentos cirúrgicos durante as filmagens do protocolo de vídeo, Hadley Holden pelo suporte histológico, Sonali Jindal pela contribuição sobre tumor e patologia hepática durante o desenvolvimento do método e Breanna Caruso pela revisão crítica do manuscrito. As células tumorais mamárias D2A1 e D2.OR foram um presente da Dra. Ann Chambers, as células tumorais D2A1-GFP foram um presente do Dr. Jeffrey Green e as células tumorais 4T1 foram um presente da Dra. Heide Ford. O Núcleo de Microscopia de Luz Avançada OHSU no Jungers Center foi utilizado para imagens. O trabalho incluído neste manuscrito inclui financiamento do NIH/NCI NRSA F31CA186524 (para ETG) e NIH/NCI 5R01CA169175 (para PS).

Todos os procedimentos com animais neste artigo foram revistos e aprovados pela Oregon Health &amp; Science University Institutional Animal Care e do Comitê Use. 1. Preparação da área cirúrgica e Instrumentos <ol><li> Preparar as tesouras, fórceps, e hemostato em autoclave a 124 ° C durante 30 min, 1 - 2 dias antes das cirurgias planeadas. Garantir o acesso à roupa de cama autoclavado ou estéreis, gaiolas e alimentos para recuperação pós-cirúrgica. </li><li> Prepara-se uma área cirúrgica asséptica, de preferência, numa câmara de fluxo laminar. <ol><li> Limpar todas as superfícies da área cirúrgica com lixívia a 10%, incluindo a almofada de aquecimento, fonte de luz, tubos de anestesia e o cone de nariz, bem como qualquer outra parte do conjunto cirúrgico que vai estar em estreita proximidade com o procedimento cirúrgico ao mesmo tempo que está a ser executada . </li><li> Na área cirúrgica asséptica, coloque a almofada de aquecimento limpo com cortina estéril, fonte de luz, tubos de anestesia e nosecone, seringas de insulina, 1 ml seringas, bupivacaína, lágrimas artificiais, solução salina estéril, 2 x 2 &quot;esponjas de gaze estéril, 4 x 4&quot; de gaze estéril, corte gaze hemostático em 0,5-1 cm2 peças, tesouras, fórceps, pinça hemostática, 4-0 Vicryl com agulha de cone, e 50 ml de 2% gluconato de clorexidina em um recipiente autoclavado. </li><li> Certifique-se de que não há espaço neste espaço para as células tumorais preparados armazenados em gelo. </li><li> No banco adjacente à zona cirúrgica, preparar a área de recuperação com uma segunda almofada de aquecimento e gaiolas limpas com roupa de cama esterilizada. NOTA: Esta área também pode itens de casa como um esterilizador talão. </li></ol></li></ol> Injeção 2. Portal Vein <ol><li> Uma hora antes das injeções planejadas, tratar ratos Balb / c do sexo feminino com idade entre 8 - 15 semanas, com 100 l de 0,015 mg / ml de buprenorfina, por via subcutânea, para controle da dor. NOTA: Este protocolo de injecção pode ser aplicado a qualquer estirpe de rato fêmea ou macho em qualquer idade, usando a apropriadalinhas celulares de alteração da estirpe. </li><li> Preparar as células tumorais para injecção com base em protocolos para a linha de células de tumor ou explante de escolha. Testar todas as linhas de células tumorais antes da administração para a presença de agentes patogénicos de murino para reduzir o risco de introdução de tais agentes patogénicos na colónia animal. <ol><li> Para as linhas de células de tumor Balb / c singeneicos, incluindo D2A1, D2.OR, e células de tumor 4T1, células de descongelamento para uma placa de cultura de tecidos de 10 cm3 dias antes da injecção de tal modo que as seguintes células em dia são ~ 90 - 100% de confluência. </li><li> Lavar as células descongelar células de tumor seguindo um dia, uma vez com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) e as células tumorais trypsinize confluentes utilizando 2 ml de tripsina a 0,05% a 37 ° C durante 5 min. Adiciona-se 8 ml de meio completo (MEMD rico em glicose, soro de bovino fetal a 10%, 2 mM de L-glutamina, e 1x penicilina / estreptomicina) e passagem 1:10 em uma placa de 10 cm fresco com 10 ml de meio completo. </li><li> No dia das injecções, lave as células uma vez com PBS 1x e trypsinize como descrito acima. </li><li> Ressuspender as células tripsinizadas em 8 ml de mídia completo, rotação durante 5 min a 1500 xg, remova a mídia e ressuspender em 5 ml de 1x PBS. </li><li> Contagem de células em um hemocitómetro utilizando exclusão de azul tripano para avaliação de viabilidade. Ressuspender as células para injecção em 1x PBS a uma concentração e volume pré-determinado. NOTA: 5-10 uL é recomendado como menores volumes de injecção evitar danos desnecessários ao fígado. </li><li> Manter as células em gelo durante a duração das injecções. Após a conclusão das injecções, o retorno de uma amostra de células para o laboratório e colocar em cultura em meio completo durante 1 dia para assegurar a viabilidade. </li></ol></li><li> Colocar o rato sob anestesia com 2-2,5% de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano) entregues em oxigénio. Manter a temperatura corporal usando a almofada de aquecimento. Certifique-se de anestesia completo através da avaliação de uma reação a uma pitada dedo do pé, e depois manter a anestesiasia a 2 - 2,5% de isoflurano. NOTA: É importante para monitorar os animais taxa de respiração e ajustar a taxa de fluxo de isoflurano em conformidade durante todo o procedimento. </li><li> Coloque uma pequena quantidade de lágrimas artificiais ou pomada vet sobre cada olho para evitar a secagem excessiva dos olhos durante o procedimento cirúrgico. </li><li> Posicione o mouse em decúbito dorsal, em sua parte traseira com abdômen exposto. </li><li> Remover o cabelo no lado esquerdo ventral do roedor a partir do segundo espaço nervura para baixo para o 4 th inguinal mamilo da glândula mamária, limpando a área com creme depilatório. Permitir que o creme depilatório para se sentar por 1-2 minutos e depois remover completamente com gaze e H 2 O. Este passo pode ser feito 1 - 2 dias de antecedência para economizar tempo, se inúmeras cirurgias são planejadas. </li><li> Tome um 2 x 2 &quot;gaze estéril (embebido em clorexidina 2%) e limpe o mouse no local da remoção do cabelo. Esterilizar toda a área circundante, incluindo a cauda, ​​para minimizar cont bacterianaaminação de instrumentos. </li><li> Limpar o local de depilação e área circundante para baixo com uma compressa embebida em álcool prep. </li><li> Repita clorexidina 2% e os passos de álcool mais uma vez e terminar com um clorexidina final de limpar para um total de três clorexidina 2% e duas lavagens de álcool prep pad. Faça o clorexidina final, limpe tal que o produto químico não está pingando em torno do local da cirurgia para evitar clorexidina em órgãos internos. Nota: A aplicação de grandes quantidades de clorexidina e álcool para a pele e a pele circundante pode resultar numa queda significativa na temperatura do corpo. Não limpe com excesso de volume durante os passos 2,7-2,9. Manter a temperatura do corpo com uma almofada de aquecimento. </li><li> Usando luvas esterilizadas e um bisturi esterilizado com lâmina estéril, fazer uma única incisão de 1 polegada na pele entre os planos médios e sagital no lado esquerdo do rato, começando logo abaixo das nervuras e que termina um pouco acima do plano do quarto inguinal tetina glândula mamária. </li><li> Com uma tesoura e uma pinça autoclavado ou talão esterilizados, fazer uma incisão semelhante de 1 polegada no peritônio. Evitar o corte na almofada de gordura mamaria e assegurar a não cortar o intestino, o fígado, ou diafragma. </li><li> Coloque um 4 x 4 &quot;almofada de gaze embebida em soro fisiológico estéril, no lado esquerdo do rato, em que a incisão foi feito, de modo a que os órgãos internos podem ser colocados sobre a gaze e não entrar em contacto com a pele circundante ou área cirúrgica. </li><li> Prepare células tumorais por pipetagem cima e para baixo várias vezes como células tumorais vai resolver durante a preparação do mouse. Prepare a 25 ul a seringa da agulha removível e agulha de 32-gauge com células tumorais. Empurrar a seringa até que as células tumorais estão na ponta da agulha e o êmbolo está no volume apropriado para injecção; evitar a injecção de bolhas de ar. </li><li> Passe o exterior da agulha com uma almofada de álcool estéril para remover quaisquer células tumorais externos. Tenha cuidado para evitar picadas de agulha. </li><li> Segure o sid médioe da incisão, incluindo a pele e revestimento peritoneal, de lado com os fórceps e usar uma mecha de algodão estéril para puxar cuidadosamente os intestinos grosso e delgado para fora, colocando-os sobre a gaze estéril embebida em soro fisiológico estéril. Retire intestinos grosso e delgado até que a veia porta é visualizado. </li><li> Cubra os órgãos internos do gaze embebida salina para manter a umidade interna e esterilidade. </li><li> Peça a um assistente, também o uso de luvas estéreis, mantenha os intestinos envolto em gaze embebida salina suavemente para fora do caminho com um algodão esterilizado com ponta cotonete para revelar completamente a veia portal. Além disso, pode ser necessário o uso da pinça hemostática ou pinça autoclavado para segurar o tecido de lado no lado mediano da incisão. </li><li> Inserir a agulha carregada com células de tumor ~ 3-5 mm para dentro da veia portal de ~ 10 mm abaixo do fígado num ângulo &lt;5 ° com a veia, com chanfro virado para cima. Injecte lentamente o volume completo contendo células tumorais. Permitir que o sangue flua da agulha hEAD durante vários segundos para evitar o retorno do fluxo de células tumorais para fora da veia. Reduzir o movimento da agulha na veia durante a injecção. Mais uma vez, tome cuidado para evitar picadas de agulha. NOTA: Visualização da veia portal é feito sem ampliação, no entanto um microscópio estéreo podem ser utilizados, se preferir. </li><li> Remova a agulha ao colocar simultaneamente um aplicador de ponta de algodão estéril na veia com pressão. Com o assistente ainda segurando os intestinos lado coloque um pedaço de 0,5-1 cm2 gaze hemostática sobre o local de injeção na veia. NOTA: pó hemostático também foi tentada para esta etapa do protocolo, mas não foi eficaz em parar a perda de sangue venoso após a injecção. </li><li> Segurar a gaze hemostático no local da injecção, com a pressão a partir de um aplicador de ponta de algodão esterilizado durante 5 min. </li><li> Avaliar encerramento da veia levantando cuidadosamente a gaze hemostático, se as varas de gaze para o tecido envolvente, uma pequena quantidade de Sterile solução salina pode ser utilizada para absorver e levantar a gaze. </li><li> Se a perda de sangue ocorre neste momento, colocar uma peça adicional de gaze hemostático no local com pressão por um adicional de 5 min. Quando o fluxo sanguíneo cessou completamente, remova a gaze do mouse. NOTA: A perda de sangue durante o procedimento cirúrgico deve ser cuidadosamente avaliada e, se o volume total permitido a perda de sangue é atingidos ou ultrapassados ​​(com base em procedimentos operacionais padrão regulamentares para conselhos de revisão institucionais do investigador) o mouse devem ser sacrificados sob anestesia por perfusão cardíaca. </li><li> Uma vez que o local da injecção é considerada intacta, sem sangue sair do local de injecção, colocar os órgãos internos suavemente para trás para dentro da cavidade abdominal. </li><li> Suturar o revestimento peritoneal e, em seguida, a pele com sutura estéril 4-0 vicryl e agulha estreitamento utilizando um padrão de sutura contínua ou simples interrompido. Tipicamente, o fechamento da incisão requer 10-15 suturas. </li><li> Injectar 100 ul de Bupicaína (5 mg / ml) ao longo do local de incisão para a gestão de dor local, utilizando uma seringa de insulina. Injectar 0,5 ml de solução salina estéril por via subcutânea utilizando uma seringa de 1 ml, com agulha de calibre 26 para a hidratação. Cirurgias demorar 15 - 25 min para completar. </li><li> Para manter condições estéreis durante toda a cirurgia, certifique-se de que todas as ferramentas e materiais que entram em contacto com o mouse, incluindo as mãos enluvadas, são limpos adequadamente antes do contato. Sempre que possível o uso de materiais e luvas estéreis, ou minimamente utilizar uma solução de etanol a 70% ou solução de lixívia a 10% de limpar. </li><li> Se múltiplas cirurgias estão previstas para uma única sessão refazer a área cirúrgica inicial com cortina fresco estéril, seringas de insulina, seringas de 1 ml, solução salina estéril &quot;, esponjas de gaze estéril, 4 x 4&quot; 2 x 2 gaze estéril, gaze hemostática cortado em 0,5 - 1 cm 2 peças, 4-0 Vicryl com agulha de cone, e 2% de clorexidina. Bead-esterilizar a tesoura, pinça e pinça hemostática em entre cirurgias e permitirpara resfriar adequadamente antes de voltar a usar. </li></ol> 3. Recuperação, Monitorização de roedores Saúde e Análises ponto final <ol><li> Após o procedimento cirúrgico é completa, manter ratos sobre uma almofada de aquecimento para a recuperação em free-cama, gaiolas limpas para um mínimo de 20 min. Ratos normalmente demoram 2 - 4 min de acordar da anestesia. </li><li> Não devolva um animal que foi submetido a cirurgia para co-habitação com outros animais até que ele está totalmente recuperado da anestesia. Não deixe um animal sem vigilância enquanto ele está recuperando a consciência e monitorar até que o animal recuperou a capacidade de manter-se em decúbito esternal. </li><li> Dê ratos 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina no tratamento da dor a cada 6-12 horas após a cirurgia, para até 72 horas. </li><li> Verificar suturas diariamente para assegurar que permanecem intactos durante a cicatrização. No caso em que as suturas ser desfeito, coloque o mouse sob anestesia, remover suturas restantes, e substituir. No caso da infecção ou Inflammção consultar o pessoal veterinário. NOTA: A infecção ou inflamação não foi encontrado com este protocolo. </li><li> Para estudos de metástase, realizar exames de saúde diárias até que os sinais exteriores de doença metastática são observados incluindo, mas não limitados a:&gt; 10% perda de peso / ganho, scruffiness, perda de atenção ao entorno, abdominais edema / ascite, olhos claros e ouvidos, ou uma posição curvada. NOTA: As verificações diárias de saúde são particularmente importantes ao desenvolver o modelo para uso com uma nova linha celular ou concentração de células até que o cronograma de metástase é bem compreendida. </li><li> No ponto final do estudo, os ratinhos eutanásia por inalação de CO 2, seguida por deslocação cervical. NOTA: Os métodos alternativos de eutanásia aprovado pela comissão de supervisão dos investigadores pode ser usado, incluindo perfusão com 1x PBS, enquanto sob anestesia. Perfusão do fígado é realizada por canulação da veia porta, cortando a veia cava inferior, e empurrando th 1x PBSáspera da vasculatura hepática a uma velocidade de 4 mL / min durante 1-2 min para remover o sangue e os leucócitos circulantes. NOTA: Dependendo do ponto de extremidade para o estudo, a linha celular, e a concentração utilizados, a metástase do fígado evidente pode ou não ser evidente na necropsia. lesões micrometastáticas podem ser reveladas com a análise histológica do fígado. Endpoints irá variar de acordo com o desenho do estudo. </li><li> Extrair o fígado com tesouras e pinças removendo primeiro a vesícula biliar, em seguida, cortado por meio da veia cava inferior superior ao fígado. Cortar através da veia cava, veia portal, e a artéria hepática inferior ao fígado. </li><li> Remover todo o fígado suavemente e lavar 5x em PBS 1x. </li><li> Separar o fígado em lobos, direito, mediana e caudado à esquerda. </li><li> correcção fígado Formalina em 10% de formalina tamponada neutra por 48 h sob agitação à temperatura ambiente. Processo de tecidos por meio de uma série de álcoois em concentração crescente e xileno; parafina incorporar o tecido fixo 71 </s-se&gt;. NOTA: Como alternativa, o fígado pode ser snap-congelados através da colocação do tecido numa cryomold com a temperatura de corte óptima (OCT) e fórmula congelação em pastilhas de gelo seco submersas em 95% de etanol. <ol><li> Usando um micrótomo, cortado no bloco de tecido embebido em parafina de tal forma que um tamanho match-chefe do tecido é revelado. </li><li> Corte cinco cortes seriados de 4 micron, este constitui o primeiro nível para análise. </li><li> Corte através de 250 microns de tecido, jogar essas seções no lixo. </li><li> A 250 microns cortar um segundo nível de cinco cortes seriados de 4 mícrons. </li><li> Repita conforme necessário para a seção por todo o fígado. Hematoxilina e eosina a primeira seção de cada nível para avaliar a metástase 72. NOTA: Para o tecido snap-congelados usar um criostato para cortar seções. NOTA: Detecção de doença micrometastática exigirá coloração específica de células tumorais. </li></ol></li><li> Remover ratos de estudo se não houver crescimento do tumor na incisão sentare, como isso indica vazamento de células do tumor para dentro da cavidade peritoneal após injecção. NOTA: Este problema não foi observado. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar e declaram que não há interesses financeiros concorrentes.

O portal do rato modelo de injecção na veia Balb / c permite o estudo de lesões mamarias cancerosas no fígado na ausência de metástases de vários órgãos de confusão e num hospedeiro competente totalmente imune. Nosso protocolo é um avanço de procedimentos cirúrgicos anteriormente publicados que permitam o acesso à veia porta para a injecção de células tumorais directamente para o fígado 16,55,56. Um avanço fizemos é para reduzir significativamente o número de células tumorais injectadas a partir da @ 1 x 10 5 células / injecção 16,55,56 até 10.000 Â células tumorais / injecção. Nós também se expandiram o modelo para o estudo do cancro da mama metástase para o fígado. Usando este protocolo, duas linhas celulares de cancro mamário com potencial metastático conhecido desenvolvem metástases hepáticas com latência menor do que uma linha de células de tumor mamário mais repouso. Além disso, nos pontos de tempo iniciais, as células tumorais são distribuídos por todo o parênquima do fígado, como grupos simples ou pequenos de única cells após a injecção de células tumorais. O modelo está preparada para responder a questões de eficiência metastático incluindo extravasamento tumor de células, a sobrevivência das células, dormência, e proliferação - todos os fenótipos que contribuem para o desenvolvimento da doença metastática e micro-evidente metastático no fígado. É importante ter em conta vários aspectos do protocolo de injeco na veia porta antes de iniciar estudos. Cuidadosamente decidir sobre linhas celulares, concentração celular, número total de células e pontos finais de interesse com base em estudos exploratórios menores é altamente recomendado. Além disso, o uso de hospedeiros imunocompetentes singénicos e linhas celulares é de extrema importância para a compreensão de interacções de células de tumor do hospedeiro. O rato recém-desenvolvido &quot;brilhante cabeça&quot; que expressa eGFP e luciferase a partir da glândula pituitária anterior é uma ferramenta importante para a eliminação de respostas do hospedeiro para exógena eGFP e luciferase, proteínas, muitas vezes usado para identificar linhas de tumor mamário 75 </sup&gt;. Uso do mouse &quot;brilhante cabeça&quot; e singênica marcado células tumorais irá facilitar a fácil identificação de células disseminadas individuais e focos micrometastática por IHC sem a preocupação de respostas inflamatórias para eGFP ou luciferase. Da mesma forma, a escolha de estratégias de gestão de dor cuidadosamente para garantir anti-mínimo ou impacto pró-tumoral do regime de tratamento de drogas é fortemente recomendado. passos críticos neste protocolo incluem a manutenção de condições estéreis por todo cirurgias para garantir que a infecção não ocorre, como isso vai confundir qualquer resultado. Também é importante que a agulha está correctamente colocado na veia portal para assegurar que as células tumorais são entregues para o fígado. Praticando o protocolo com corantes como a Índia tinta vai ajudar com esta questão. O crescimento do tumor no local da incisão na pele é o melhor indicador de que a colocação da agulha imprópria ocorreu. Finalmente, é essencial que a perda de sangue a partir da veia porta é adequadamente controlada e deixa inteiramente antes de suturing do animal. O uso de gaze hemostático diminui grandemente o risco de perda de sangue incontrolada a partir da veia portal a seguir à injecção. Nas nossas mãos, a mortalidade relacionada processual devido a perda de sangue a partir da veia porta a seguir à injecção foi reduzida de 30% para 2% de ratinhos com o uso de gaze hemostático. É importante notar que o modelo de injeco na veia porta não replica da cascata metastática completa, mas se limita ao estudo de extravasão de células de tumor, as interacções célula-nichos do tumor após o extravasamento e o crescimento do tumor. Modelos que se replicam com precisão a cascata metastática completo para o fígado, tal como ocorre em pacientes, são urgentemente necessários. Uma limitação adicional do modelo de injecção na veia portal é que se confunde com o impacto de uma cirurgia no hospedeiro, em que a cicatrização de feridas conhecido para influenciar a progressão da doença 76,77. O modelo de injecção na veia portal representa uma melhoria em relação a outra injecçãomodelos para estudar a metástase do fígado, incluindo modelos e intracardíaca interna do baço. Especificamente, o modelo de injecção na veia portal permite o estudo de uma gama maior de progressão da doença do que o modelo intracardíaca, que é muitas vezes limitada por metástases concomitantes em outros tecidos. Além disso, o modelo da veia porta não é complicada por remoção do baço, tal como é feito no modelo interna do baço. O modelo de injecção na veia portal pode ser uma ferramenta útil para o estudo das metástases do fígado em geral. metástase hepática é o local mais comum de metástase em adenocarcinomas em geral, com taxas particularmente elevadas em cânceres de pâncreas (85% de metástases são para o fígado), cólon e adenocarcinomas retais (&gt; 70%), bem como o estômago e do esôfago (&gt; 30 %) 1. Embora os modelos de tumores primários e espontâneas ortotópicos de adenocarcinomas do cólon e pancreáticos mais prontamente metastizar para o fígado 78,79, o modelo de injecção na veia portal pode prove útil para a compreensão do processo metastático destes cancros como a entrega controlada de células tumorais permite avaliações bioquímicas, moleculares e histológicas em horários especificados após a chegada de células tumorais. Em resumo, o modelo de injecção na veia portal representa uma melhoria importante em modelos de metástases hepáticas disponíveis de cancro da mama, e podem também ser aplicável ao campo de metástases do fígado em geral.

Câncer de mama metastático para o fígado O fígado é um local comum de metástase do câncer de mama, juntamente com o osso e pulmão 1-3. Metástase hepática em doentes com cancro da mama é um fator prognóstico independente para resultados muito pobres 4,5, como médio de sobrevivência de pacientes com câncer de mama com metástase hepática faixas de 4,8 a 15 meses 6-9. Em contraste, pacientes com câncer de mama com pulmão ou metástases ósseas têm taxas de sobrevida média de 9 a 27,4 meses 8,9 e 16,3 para 56 meses 8,10-12, respectivamente. A metástase é um processo de múltiplos passos, referido como a cascata metastática, que começa com disseminação de células tumorais no tumor primário e termina com a mortalidade do paciente devido à sementeira e crescimento de células tumorais em circulação dentro de um órgão distante 13-15. modelos de roedores de metástases revelaram que a cascata metastática é extraordinariamente ineficiente, com apenas 0,02 - 10%de circulação de células tumorais que estabelecem metástase evidente 16,17. Uma grande gargalo da ineficiência metastático é ditada pelas microambientes tecidos originais em sites secundários, chamados nichos metastáticos 18, destacando a importância da compreensão metástase site-specific. O nicho metastático é único para o local de recorrência, e é, em parte, caracterizado por a deposição das proteínas da matriz extracelular distintos 19,20, infiltração de várias populações de células imunes 21-23, e a homeostase do tecido alterada, incluindo a produção desregulada de numerosas citocinas, quimiocinas, factores de crescimento e 15,18,24,25. Deste modo, um entendimento do nicho metastático específica de tecido precede uma compreensão de como alvo a doença metastática. No entanto, os modelos robustos de metástases hepáticas são escassos. Além disso, a melhoria dos modelos de metástase hepática será essencial para a identificação de novos alvos e tratamentos eficazes para pacientes com câncer de mama wimetástases hepáticas th. Modelos de estudo de câncer de mama metástase para o fígado estabelecida Atualmente modelos disponíveis para estudar a metástase do cancro da mama para o fígado incluem xenoenxertos de células de cancro humano em ratinhos imunocomprometidos. Estes modelos utilizam tipicamente linhas celulares bem estudadas humanas de cancro da mama, tais como MCF-7 e MDA-MB-231 e nu, RAG1 - / -, ou SCID imunes comprometidos hospedeiros murinos 26-29. Modelos de xenotransplante de proporcionar a vantagem de envolver derivado humanos linhas celulares de cancro, no entanto, tendo em conta a valorização recente para as células imunitárias em metástase 30-32 e 33-35 na resistência terapêutica, o estudo de metástases num hospedeiro competente totalmente imune é primordial. Modelos para estudar a metástase do cancro da mama para o fígado em hospedeiros imunocompetentes incluem injecção ortotópico de células singeneicas de tumor (por exemplo, 4T1 e linhas de células D2A1) na almofada de gordura mamaria, com ou sem cirúrgicaressecção do tumor primário, e posterior avaliação de metástase 36-38. De nota, a taxa de metástases do fígado a partir de modelos de transplante ortotópico é muito baixa ou inexistente comparada a outras áreas, tais como metastáticos do pulmão 39,40, ou ocorre depois de metástases do pulmão é estabelecida, o que complica o estudo de metástases específico do fígado 37,39 . explantes de tumores de modelos de cancro da mama espontâneos geneticamente modificadas podem ser re-injectado nas almofadas de gordura mamária de anfitriões ingênuas como as células tumorais singï¿½icos. Por exemplo, foi relatado recentemente que os tumores espontâneos de K14 Cre Ecad f / f P53 camundongos f / F, qual o modelo invasivo carcinoma de mama lobular, desenvolver tumores quando ortotopicamente injetado em hospedeiros de tipo selvagem. Após a ressecção cirúrgica destes tumores, uma vez que chegar a 15 mm2, 18% dos ratinhos progrediu para metástases hepáticas 40,41. Uma terceira abordagem para modelar utiliza metástase hepáticametástase espontânea em ratos geneticamente modificados. Até o momento, relatos de modelos murinos espontâneas de metástase de câncer de mama que prontamente se espalhou para o fígado são incomuns. As exceções incluem o H19-IGF2, o p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre, eo f / f P53 K14 Cre Ecad f / f modelos de ratos geneticamente modificados, onde metástase hepática desenvolve em uma pequena percentagem de ratos 38,41- 43. Assim, enquanto que os modelos de rato geneticamente modificadas facilitar o estudo de todas as fases da cascata metastática, fornecendo modelos poderosos e clinicamente relevantes, que são limitadas devido a baixas taxas de metástases do fígado 38. Vários modelos de metástase ignorar os passos iniciais da cascata metastática incluindo disseminação de células tumorais a partir do tumor primário e intravasamento. Estes modelos permitem investigação sobre as etapas posteriores da cascata metastática, de extravasamento para estabelecimento de tumores em locais secundários. o intmodelo de injecção racardiac proporciona células tumorais para o ventrículo esquerdo, o que distribui as células tumorais no sistema circulatório através da aorta. injeção intracardíaca requer ultra-som guiada por imagem do local da injecção ou outras modalidades de imagem, tais como bioluminescência de luciferase com a etiqueta células para confirmar a injeção de sucesso. Injecção das células tumorais através do ventrículo esquerdo, pode resultar em osso, cérebro, pulmão, e / ou metástases do fígado, entre outros órgãos 44-48. Por causa de metástases multi-órgãos, estes ratos frequentemente precisam ser sacrificados antes do desenvolvimento de metástases hepáticas ostensiva, negando a capacidade de investigar plenamente o crescimento metastático no fígado. Uma abordagem alternativa que minimiza significativamente o desenvolvimento de múltiplos locais de metástases é o modelo de injecção interna do baço. Injecção interna do baço proporciona células tumorais através da veia esplénica que se une com a veia mesentérica superior a tornar-se a veia portal 49,50. Os animais podem ser monitorizados relativamente a outgrowth de lesões metastáticas no fígado, pois a formação de metástases em outros locais é raro, e, como resultado, a saúde em geral do animal é mantido 49,50. No entanto, é importante notar que o modelo requer a esplenectomia interna do baço para evitar tumores esplénicos 49,50, um procedimento que impactos função imune. Por exemplo, lesão de reperfusão de isquemia do miocárdio é caracterizada pela infiltração de monócitos Ly6C + subconjuntos que se originam a partir do baço e são responsáveis pela fagocitose e a actividade proteolítica durante a cicatrização de feridas após isquemia 51,52. Com esplenectomia, não é observada uma redução nas populações de monócitos que auxiliam na cicatrização de feridas 52. Além disso, esplenectomia foi mostrado para reduzir o crescimento do tumor primário e as metástases pulmonares em um modelo de cancro do pulmão de não pequenas células, especificamente através de uma redução no número de circular e intra-tumoral CCR2 + CD11b + + Ly6C mielo monocíticacélulas id 53. Além disso, a esplenectomia após a injecção interna do baço de células cancerígenas do cólon resultou na redução dos níveis de células natural killer anti-tumorais nos linfonodos mesentéricos e elevada metástase hepática 54. Em suma, estes resultados sugerem que a esplenectomia compromete a função do sistema imunológico com consequências posteriores para o destino de células metastático. Portal Veia modelo de injeção de fígado Metástase Para investigar a metástase do cancro da mama para o fígado num hospedeiro competente totalmente imune, sob condições em que os ratinhos não estão comprometidos devido a metástases multi-órgãos, um modelo de injecção na veia portal foi desenvolvido. Modelos de injecção intraportal têm sido usados anteriormente para estudar a metástase do fígado de 55,56 colorrectal e melanoma 16 linhas celulares; Aqui nós descrevemos a aplicação da injeção intraportal para modelar metástase das células do tumor mamário singênica. Este modelo pode ser usado para estudaras fases posteriores da cascata metastática, incluindo o extravasamento do cancro da mama celular e semeadura, as decisões do destino da célula de tumor em relação a morte / proliferação / dormência, e crescimento em lesões evidentes. Neste modelo, as linhas de células de tumor mamário de singeneicas são injectados através da veia portal de ratos imuno-competentes Balb / C fêmeas, um método que proporciona células tumorais, em primeiro lugar e directamente para o fígado, sem a remoção do baço. Para desenvolver este modelo, a utilização de quatro linhas de células de tumor mamário que variam na sua capacidade metastática de baixa para alta foram utilizadas: D2.OR, D2A1, e 4T1, e empregaram D2A1 marcado com proteína verde fluorescente (GFP-D2A1) para investigar cedo pontos de tempo após a injecção das células tumorais. 4T1 é uma linha de células altamente metastáticas derivado do tumor 410.4 que surgiu espontaneamente num MMTV + Balb ratinho / c fêmea 36,37 e metástases para pulmão, fígado, cérebro e ossos de gordura mamária almofada tumores primários 39,57,58. células tumorais D2A1 were também originalmente derivada de um tumor mamário espontâneo provenientes de um ratinho BALB / c hospedeiro após o transplante de células de nódulos alveolares hiperplásicas D2, e está confirmado ser metastático do tumor primário para o pulmão 59,60. As células tumorais são uma linha D2.OR irmã não metastático à linha D2A1 e, apesar de escapar ao tumor primário e chegar a locais secundários, eles raramente estabelecer metástases distantes 60,61. Além disso, é importante evitar a utilização de drogas de gestão de dor vulgarmente empregues, incluindo drogas não esteróides anti-inflamatórias (NSAIDs), durante ou após o procedimento cirúrgico. NSAIDs têm actividade anti-tumoral em certos cancros da mama 62-65, e algumas classes de AINEs aumentar o risco de hepatotoxicidade 66,67, potencialmente, comprometer o estudo de metástase do fígado e do nicho metastático do fígado. Além disso, estudos sugerem que os AINEs influenciar diretamente o microambiente do tecido, reduzindo ext pró-metastáticoproteínas da matriz racellular tenascina-C 68 e colágeno fibrilar 62,65. Alternativamente, a utilização de um derivado de opióides, a buprenorfina, foi utilizado devido à sua eficácia no tratamento da dor de roedor e 69 devido à falta de provas de que os opióides têm actividade anti-tumor de 70. Este modelo de injecção na veia portal foi optimizado para menores volumes de injecção de 5 - 10 ul, para evitar danos desnecessários ao fígado. O modelo também foi optimizada para incluir agulhas com diâmetro menor (≥ calibre 32) e a utilização de gaze hemostático imediatamente após a injecção para minimizar a perda de sangue durante o procedimento. Em contraste com estes parâmetros optimizados injecção, o número de células deve ser determinada numa base individual, com base no potencial tumorigénico da linha celular. No entanto, a partir de ≤ 10.000 células / injecção para estudos de longo prazo é recomendado. Para terminais mais curtos (por exemplo, 24 horas após a injecção) consideravelmente mais células tumorais (por exemplo,1 x 05-1 outubro x 10 6) pode ser utilizado se tal se justificar. Em resumo, o modelo de injecção na veia portal detalhado aqui representa uma ferramenta útil para o estudo do cancro da mama de metástase para o fígado e evita um número de limitações de outros modelos de metástases hepáticas. Este modelo facilita o estudo da extravasão de células de tumor, a semeadura, as decisões iniciais fate de sobrevivência, a proliferação, e a dormência, e crescimento metastático de murino em hospedeiros imunocompetentes.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 ml com Agulha de 26 gauge</td><td>BD Seringa</td><td>309597</td><td>Para injeção subcutânea de buprenorfina; use cuidado, afiado</td></tr><tr><td>Almofadas de Preparação de Álcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Para limpeza do abdômen antes da incisão cirúrgica</td></tr><tr><td>Esponjas Multiuso, Estéreis</td><td>Kendall</td><td>8044</td><td>4" x 4", use mergulhado em solução salina estéril para manter os intestinos grosso e pequeno protegidos e hidratados durante cirurgia</td></tr><tr><td>Lágrimas artificiais</td><td>Rugby</td><td>370114</td><td>Óleo mineral 15%, petrolato branco 83%; uso para proteger os olhos durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Buprenorfina HCl, 0,3 mg/ml</td><td>Mfg. por Reckitt Benckiser</td><td>NDC-12496-0757-1</td><td>Use a 0,05 - 0,1 mg/kg de peso corporal, 1 - 2x ao dia por 72 horas, injetado por via subcutânea</td></tr><tr><td>Bupivacaína HCl, 0,5% (5 mg/ml)</td><td>Mfg. por Humira Inc</td><td>NDC-04091163-01</td><td>Use a 0,5%, 1x imediatamente após a cirurgia, 10 &mu; l injetado por via subcutânea no local da incisão&nbsp;</td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td>Uso em imunofluorescência multiplex para excluir leucócitos na identificação de focos metastáticos</td></tr><tr><td>Celox&trade; Gaze hemostática rápida</td><td>Medtrade Products Ltd.</td><td>FG08839011</td><td>Corte em pedaços de 5 mm&sup2; use para parar o fluxo sanguíneo para fora da veia porta com pressão após a injeção</td></tr><tr><td>Depilatório</td><td></td><td></td> Químico <td>Use para remover pelos da área cirúrgica; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Clorexidina, Solução a 2%</td><td>Vet One</td><td>1CHL008</td><td>Tenha cuidado, não obtenha clorexidina nas membranas mucosas ou orelhas do camundongo</td></tr><tr><td>anticorpo anti-CK18</td><td>Abcam</td><td>ab53118</td><td>Use em imunofluorescência multiplex para identificar focos metastáticos</td></tr><tr><td>Aplicadores com Ponta de Algodão, Estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td>Haste de Madeira de 6" 2 pc/envelope</td></tr><tr><td>DMEM, HyClone de Alta Glicose</td><td></td><td>SH30243.01</td><td>Base de meios de cultura celular para uso com linhas celulares de tumor mamário D2A1, D2.OR e 4T1</td></tr><tr><td>Esterilizador</td><td></td><td></td> <td>de esferas de vidro secoUse entre as cirurgias para esterilizar ferramentas de aço inoxidável, tenha cuidado, extremamente quente; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Etanol, solução</td><td></td><td></td> a 70% <td>Use cuidado inflamável; use para limpar a área cirúrgica conforme necessário; vários fornecedores Soro</td></tr><tr><td>fetal bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td>Aditivo de meio de cultura celular para uso com linhagens celulares de tumor mamário D2A1, D2.OR e 4T1, use a 10% em gaze DMEM de alta glicose</td></tr><tr><td>, estéril</td><td>Kendall</td><td>2146</td><td>2" x 2", use mergulhado em solução de clorexidina a 2% para limpeza do abdômen antes da incisão cirúrgica</td></tr><tr><td>anticorpo anti-proteína fluorescente verde</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA0702</td><td>Use para corar para GFP marcado D2A1 ou outras linhas de células tumorais mamárias</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Aditivo de mídia de cultura celular para uso com linhas de células de tumor mamário D2A1, D2.OR e 4T1, uso a 2 mM (1x) em DMEM alta glicose</td></tr><tr><td>Almofada de Aquecimento, x 2 - 3</td><td></td><td></td><td>Use para manter o calor do corpo durante a cirurgia e recuperação; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td>Para uso em cultura de células para contagem de células</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td> Hemostático <td>Aço inoxidável; vários fornecedores</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Heppar-1</td><td>Dako</td><td>M7158</td><td>Use em imunofluorescência multiplex para excluir hepatócitos na identificação de focos metastáticos</td></tr><tr><td>Seringa de Insulina, 0,3 ml, BD</td><td>&nbsp; 29-gauge; &nbsp;</td><td>324702</td><td>Para injeção de bupivacaína no local da sutura; tenha cuidado, afiado</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>NDC-66794-017-25</td><td>Administrado a 2,5%</td></tr> <tr><td>Vaporizador de Isoflurano</td><td>VetEquip</td><td>911103</td><td>Use cuidado, vaporiza gases anestésicos</td></tr><tr><td>Fonte de</td><td></td><td></td> luz <td>Use para visualizar o campo cirúrgico; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra, 10%</td> <td>Anatech Ltd.</td><td>135</td><td>Use cuidado, tóxico; use como fixador de tecido para desfechos de metástase e avaliação da carga metastática por histologia</td></tr><tr><td>Opal &trade; kit fIHC de 4 cores</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL794001KT</td><td>Use para imunofluorescência multiplex de Heppar-1/CD45/CK18 para detectar metástases em fígado murino</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td> de operação <td>Aço inoxidável; use cuidado, afiado; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Aditivo de mídia de cultura de células para uso com linhas de células de tumor mamário D2A1, D2.OR e 4T1, use em 1x em</td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato de alta glicose DMEM</td><td></td><td></td><td>Use em 1x para ressuspender células tumorais antes da injeção, vários fornecedores</td></tr><tr><td>Seringa de Agulha Removível, 25 &mu; l, Modelo 1702</td><td>Hamilton</td><td>7654-01</td><td>Para injeção na veia porta; tenha cuidado, especialmente ao trabalhar com agulhas carregadas de células tumorais, afiada quando a agulha está presa</td></tr><tr>Cabo <td></td><td></td> de<td>bisturi</td><td>Aço inoxidável; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi, #15</td><td></td><td></td><td>Aço carbono, estéril, tamanho 15; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Agulhas removíveis de cubo pequeno, calibre 32</td><td>Hamilton</td><td>7803-04</td><td>Para injeção na veia porta, comprimento de 1", estilo de ponta 4, 12&deg; agulhas reutilizáveis de calibre 33 a 34 também podem ser usadas; use cuidado, especialmente ao trabalhar com agulhas carregadas de células tumorais,</td></tr><tr><td>hipoclorito</td><td></td><td></td> de sódio afiado <td>Use cuidado, corrosivo; use a 10% para desinfetar o espaço de trabalho e as superfícies, vários fornecedores</td></tr><tr><td>Solução salina estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>0,9% NaCl; alternativamente, pode ser caseiro e filtrado estéril</td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas, Estéril</td><td></td><td></td><td>Vários fornecedores</td></tr><tr><td>Suturas, Estéril&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 27" vicryl revestido com agulha de 22 mm 1/2c cônico etalloy; use cuidado, afiada</td></tr><tr><td>Máquina de Anestesia Portátil de Mesa</td><td>VetEquip</td><td>901801</td><td>Use com vaporizador de isoflurano para anestesia de camundongo</td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td> de Curativo para Polegar <td>Aço inoxidável, serrilhado, embotado; vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cortinas de Toalha, Estéril&nbsp;</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>18" x 26", para cobrir a almofada de aquecimento e fornecer um espaço de trabalho estéril durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Para uso em cultura de células para avaliar a viabilidade, use 1:1 com células em 1x PBS</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA, 0,05% (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Use em cultura de células para separar células tumorais de placas de cultura de tecidos</td></tr></tbody></table>

um modelo de injeção da veia porta para o estudo do fígado metástase do câncer de mama

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

O cancro da mama é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em mulheres em todo o mundo. metástase hepática está envolvido em mais de 30% dos casos com metástase do câncer de mama, e resulta em resultados pobres com taxas de sobrevida média de apenas 4,8-15 meses. Current modelos de roedores de metástases de cancro da mama, incluindo o xenoenxerto de células de tumor primário e modelos de tumores espontâneos, raramente metastatizam para o fígado. Intracardíaca e modelos de injecção interna do baço não resultar em metástases do fígado, no entanto, estes modelos podem ser confundidos por metástase concomitante secundária local, ou por imunidade comprometida devido à remoção do baço para evitar o crescimento do tumor no local da injecção. Para abordar a necessidade de melhores modelos de metástases hepáticas, um método de injecção na veia portal de murino que proporciona células tumorais, em primeiro lugar e directamente para o fígado foi desenvolvido. Este modelo proporciona células tumorais para o fígado, sem complicações concomitantes de metástases em outros órgãos ou a remoção do baço. o optimized protocolo veia porta emprega pequenos volumes de injecção de 5-10 ul, ≥ agulhas de calibre 32, e hemostático gaze no local de injecção para controlar a perda de sangue. A abordagem de injeção na veia porta em ratos Balb / c do sexo feminino usando três linhas tumorais mamárias singï¿½icos da variação potencial metastático foi testado; células de alta-metastático 4T1, células D2A1 moderada-metastáticos e células D2.OR low-metastático. As concentrações de ≤ resultados 10.000 células / injeção em uma latência de ~ 20 - 40 dias para o desenvolvimento de metástases hepáticas com os metastático 4T1 e D2A1 linhas mais altas, e&gt; 55 dias para a linha D2.OR menos agressivo. Este modelo constitui uma ferramenta importante para o estudo do cancro da mama metástase para o fígado, e pode ser aplicável a outros tipos de cancro, que frequentemente metastizar para o fígado, incluindo colo-rectal e adenocarcinomas pancreáticos.

O modelo de injeco na veia porta, em que as células tumorais são entregues directamente para o fígado através de um procedimento cirúrgico, permite a injecção de células tumorais na veia porta. Sob as condições de assepsia, num rato anestesiado, incisão cirúrgica um ~ 1 polegada é feita sobre o lado esquerdo do rato entre a mediana e sagital aviões, começando logo acima do plano do quarto inguinal tetina glândula mamaria e terminando abaixo das nervuras . Os intestinos grosso e delgado são delicadamente puxado através da incisão para proporcionar a visualização da veia porta (Figura 1A). anatómica identificação precisa da veia porta e injecção intra-portal de sucesso pode ser confirmada através da prática do protocolo de injecção com tinta da China ou um corante semelhante. Correcta de injecção através da veia porta vai resultar em que a tinta a ser entregue imediatamente e especificamente para o fígado, e não resultará na Índia tinta disseminação para os pulmões (Figure 1B). Além disso, usando o rato D2A1 células de tumor mamário marcadas com GFP, a dispersão das células do tumor ao longo do fígado resulta em noventa minutos pós-injecção, confirmando a entrega injeco na veia porta para o fígado (Figura 1C). Na maior ampliação, torna-se evidente que aos 90 min pós-injecção, as células tumorais são encontrados dentro de sinusóides, bem como dentro do parênquima do fígado em estreita proximidade com tríades portais, onde o sangue da veia porta entra no fígado (Figura 1C). Estes dados sugerem que a extravasão de células de tumor activa está ocorrendo a injecção das células tumorais 90 min. Tomados em conjunto, estes dados confirmam que a injeco na veia porta modelo proporciona o volume de injecção directamente para o fígado, com células de tumor ou de tinta dispersos por todo o fígado e nenhum transporte significativo de volume de injecção para o pulmão. Para avaliar a robustez do modelo de injeção na veia porta, três separcomeu linhas de células de tumor mamário de ratinho singeneicos foram testados em adultos do sexo feminino ratinhos Balb / c. Estas linhas tumorais mamárias foram selecionados com base em seu comportamento caracterizado por modelos de almofada de gordura mamária e incluem a linha altamente agressiva e metastática 4T1 células, a linha D2A1 metastático menos agressiva, ea linha D2.OR baixo / não-metastático 37,61,73 , 74. 2.000 e 10.000 células por injecção foram testados sem diferenças notáveis ​​no tempo para o desenvolvimento de metástase evidente com estas concentrações celulares baixas. Para estes estudos marcadores substitutos de metástases foram utilizadas, tais como a falta de higiene, palidez, e perda de peso para justificar necropsia, sobre o qual a presença ou ausência de metástases no fígado foram confirmadas por avaliação visual do fígado e de outros órgãos para confirmar a entrega intra-portal . Estes dados confirmam os relatórios anteriores que as linhas de células 4T1 e D2A1 representam linhas de tumor mamário mais agressivas, como são observadas taxas de sobrevivência mais curto livres de metástase em comparação com ratinhos injectadoscom a linha D2.OR menos agressiva (Figura 2A). Os ratinhos injectados com metástases hepáticas evidente células 4T1 ou tumorais D2A1 desenvolvido por ~ 30 - 40 dias após a injecção, e algumas metástases desenvolvido tão cedo quanto 18 dias pós-injecção (Figura 2A), enquanto que apenas um rato injectado com células D2.OR tinha metástase hepática aberta desenvolvida pelo final do estudo, que foi de 60 - 65 dias a injeção das células tumorais. Metástases foram posteriormente confirmados por seccionamento através do fígado em 250 mm níveis e análise de hematoxilina e eosina (H &amp; E) secções coradas (Figura 2B-D). Em adição à detecção de lesões metastáticas evidentes no fígado do rato, o modelo de veia porta também pode ser utilizada para estudar os eventos anteriores na cascata metastática incluindo a detecção de agregados individuais células / célula após o extravasamento, e formação de lesões micro-metastática. foi utilizado Multiplex imunofluorescência-coloraçãopara detectar 4T1, D2A1, e células de tumor mamário de D2.OR no fígado, quando estão presentes como células individuais ou lesões micro-metastática, como H &amp; E não é suficiente para confirmar a presença de pequenas lesões. A Figura 3A mostra um rato Balb / c com um representante do fígado focos micrometastática putativo de células tumorais D2A1 que são positivas para o epitelial CK18 queratina, negativo para o CD45 marcador pan-imune e negativo para o marcador de hepatócitos Heppar-1. Os hepatócitos também coram positivo para CK18, necessitando a utilização de Heppar-1 neste painel de coloração. Uma nota importante é que as células epiteliais do ducto biliar e progenitoras do fígado coloração positiva para CK18, exigindo cuidadosa discriminação entre as células do tumor e das vias biliares, particularmente quando se avalia regiões periportais (Figura 3A). Uma alternativa para multiplex imunofluorescência para identificar as células disseminadas individuais e focos micrometastática é utilizar linhas de tumores mamários singï¿½icos marcados com verde fluorescente melhoradaproteína (eGFP) e / ou a luciferase e realizar IHC para a etiqueta (Figura 1C). Devido à imunogenicidade de eGFP, a luciferase, e outras proteínas, que é essencial utilizar modelos de murganho que são tornados tolerantes para estas proteínas, tais como o livro de rato imune competente "incandescência cabeça" que expressa eGFP e da luciferase na glândula pituitária anterior 75. Para a identificação de lesões macrometastatic de linhas singeneicas não marcados, tais como a linha de tumor D2A1, a imunofluorescência multiplex CK18 / Heppar-1 / CD45 é ideal (Figura 3B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig1.jpg"> Figura 1: Veia Porta Injection Proporciona células tumorais diretamente para o fígado. A) injecção na veia Portal; a incisão é feita entre a mediana e sagital esquerda, a partir de acima do plano do quarto inguinal tetina glândula mamaria e terminando abaixo do RIb gaiola. B) Balb / c fígado com injeção de PBS (esquerda). Após a injecção de tinta Índia através da veia porta, o fígado (do meio), mas não no pulmão (direita) leva-se a tinta. C) imagens de cortes finos representativos de células de tumor mamário de ratinho D2A1 marcadas com GFP em um / c de rato fígado de Balb aos 90 min pós-injecção de 1 x 10 6 células tumorais através da veia porta. Os fígados foram fixados com formalina, embebidos em parafina, seccionados e corados com anticorpo anti-GFP para a detecção de células tumorais. painel superior mostra celas escuras marrons manchadas tumorais (setas) dispersos por todo o fígado, asterisco denota coloração dos hepatócitos não específica em torno de veias centrais; barra de escala = 300 mm. painéis inferiores mostram imagens representativas de células tumorais em 90 min após a injecção ainda intimamente associada com vascularização; barra de escala = 50 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <pclass fo: manter-together.within-page='"1"&gt;' alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig2.jpg"></pclass> Figura 2: Conseqüência da mamário de ratinho Lines tumor de células do fígado após Veia Porta Injection. A) curva de Kaplan-Meier mostrando taxas de sobrevida livre de metástases em camundongos injetados com 2,000-10,000 células 4T1, D2A1 ou tumor mamário de rato D2.OR. Os ratinhos foram injectados com células tumorais e monitorizados para sinais de metástases, incluindo a falta de higiene, olhos claros, e alterações de peso. Metástase foi confirmada no momento da necropsia e por H &amp; E em cortes histológicos dos fígados. N = 2 2000 células 4T1; 2 4T1 10.000 células. N = 2 D2A1 2.000 células; 3 D2A1 10.000 células. N = 3 D2.OR 2.000 células; 3 D2.OR 10.000 células. Representante H &amp; E imagens do B) 4T1 lesões aos 21 dias pós-injeção de 10.000 células, C) lesões D2A1 em 26 dias após a injecção de 10.000 células tumorais, e D) lesões D2.OR em59 dias pós-injecção de 10.000 células; Barras de escala = 75 uM. lesões semelhantes são observados quando 2.000 células 4T1 ou D2A1 tumorais foram injectadas. Não foram detectadas lesões com 2.000 células D2.OR. Não há evidência de metástases em outros órgãos ou no local da incisão cirúrgica foi aparente em qualquer rato sobre estes estudos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig3.jpg"> Figura 3: Detecção de células individuais e metastáticos Lesões no fígado do rato usando Multiplex imunofluorescência. A) imunofluorescência multiplex Representante de células tumorais D2A1 em a / c do mouse fígado Balb a 90 min após a injecção, utilizando o modelo de injecção na veia portal. A coloração foi realizada utilizando um kit de multiplex. Da esquerda para a direita mostra DAPI; CD45 para marcar leucócitos; Heppar-1 a Mark hepatócitos; e CK18 para marcar células de tumor, hepatócitos, e epitélio das vias biliares. Imagem mesclada mostra um cluster putativo da CK18 + Heppar-1 - células tumorais D2A1 intimamente associados com uma tríade portal - CD45. Seta = células tumorais D2A1, asterisco = ducto biliar epitélio; barra de escala = 25 um. B) A D2A1 ostensiva lesão metastática representativa, utilizando o mesmo painel coloração como em células tumorais A. são CK18 + enquanto hepatócitos adjacentes são CK18 + Heppar-1 +; barra de escala = 25 um. As imagens foram capturadas num microscópio com 20 x 0,8, 40 x 1,3, 1,4 e 60 x objectivos e câmara CCD, utilizando o software de microscópio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um procedimento cirúrgico foi desenvolvido para entregar células tumorais mamárias ao fígado murino por meio de injeção na veia porta. Este modelo permite a investigação de estágios tardios de metástase hepática em um hospedeiro totalmente imunocompetente, incluindo extravasamento de células tumorais, semeadura, sobrevivência e crescimento metastático no fígado.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

O objetivo geral deste procedimento é entregar células tumorais diretamente ao fígado murino para a modelagem experimental de metástases hepáticas de câncer de mama. Este método pode ser usado para estudar os estágios posteriores da cascata metastática no fígado murino. Incluindo extravasamento, semeadura, morte, proliferação e dormência de células de câncer de mama, bem como crescimento.A principal vantagem dessa técnica é que ela entrega células tumorais diretamente ao fígado sem a remoção do baço ou metástase concomitante de múltiplos órgãos. A demonstração visual desse método é crítica, pois a injeção da veia porta requer manipulações precisas que dependem da vigilância anatômica direta. Ajudando-me com este procedimento estará Alexandra Quackenbush, uma estudante de pós-graduação no laboratório de Pepershadine.Antes de iniciar o procedimento, limpe todas as superfícies da área cirúrgica com alvejante a 10%. Uma hora antes das injeções, trate camundongos fêmeas balb / c de oito a 15 semanas de idade com 100 microlitros de analgesia por via subcutânea para controle da dor. Aplique pomada nos olhos do animal.Em seguida, coloque os camundongos em decúbito dorsal e confirme o nível apropriado de sedação beliscando o dedo do pé. Em seguida, desinfete as áreas cirúrgicas e circundantes do animal, incluindo a cauda, com três lenços umedecidos em gaze 2% embebidos em gaze e dois lenços umedecidos em álcool e dois lenços umedecidos em álcool. Após o último lenço de clorexidina, use um bisturi estéril para fazer uma incisão de uma polegada na pele entre os planos mediano e sagital no lado esquerdo do camundongo, começando logo abaixo das costelas e terminando acima da quarta tetina da glândula mamária inguinal, seguida por uma incisão semelhante de uma polegada através do peritônio.Agora pipete as células tumorais para cima e para baixo várias vezes para ressuspender a solução celular e carregue uma seringa de agulha removível de 25 microlitros, equipada com uma agulha de calibre 32, com 10 microlitros das células. Pressione o êmbolo até que as células estejam na ponta da agulha e o êmbolo esteja no volume apropriado para injeção. Limpe a parte externa da agulha carregada com uma compressa de álcool estéril para remover quaisquer células tumorais externas, tomando cuidado para evitar picadas de agulha.Em seguida, segurando a pele e o revestimento peritoneal do lado mediano da incisão com a pinça, use um cotonete estéril para mover cuidadosamente os intestinos grosso e delgado para uma gaze estéril, embebida em solução salina estéril. Cubra os órgãos internos com gaze embebida em solução salina para manter a umidade interna e a esterilidade. Quando a veia porta estiver visível, peça a um assistente que segure suavemente os intestinos fora do caminho para expor a veia porta com um cotonete estéril e insira a agulha de três a cinco milímetros na veia porta, aproximadamente 10 milímetros abaixo do fígado, em um ângulo inferior a 5 graus, com o lado chanfrado para cima.Injete lentamente todo o volume de células tumorais, permitindo que o sangue passe pela cabeça da agulha por vários segundos para evitar um refluxo das células tumorais para fora da veia. Como a visualização, o acesso e a injeção adequados na veia porta são essenciais, reserve um tempo para garantir que o posicionamento da veia porta, em relação à agulha, seja satisfatório antes de tentar a injeção. Quando todas as células tiverem sido injetadas, remova a agulha enquanto aplica simultaneamente uma leve pressão na veia com um aplicador de ponta de algodão estéril.Em seguida, use um novo aplicador de ponta de algodão estéril para segurar um pedaço quadrado de gaze hemostática de 0,5 a um centímetro sobre o local da injeção. Após cinco minutos, levante cuidadosamente a gaze para avaliar o fechamento da veia. Quando o fluxo sanguíneo cessar completamente, remova a gaze e retorne os intestinos à cavidade abdominal.Usando um padrão de sutura simples contínuo ou interrompido, feche o revestimento peritoneal com a sutura estéril de quatro zero vicryl e afunilamento. Após fechar a pele da mesma maneira, injetar 100 microlitros de anestésico local ao longo do local da incisão, seguido de administração subcutânea de 0,5 mililitros de solução salina estéril. A identificação anatômica precisa da veia porta e a injeção intraportal bem-sucedida podem ser confirmadas praticando o protocolo de injeção com tinta nanquim ou corante similar.Com uma injeção correta através da veia porta, resultando na entrega imediata e específica da tinta ao fígado sem se espalhar para o pulmão. Usando células tumorais de memória de camundongo marcadas com GFP, a dispersão de células tumorais por todo o fígado é aparente 90 minutos após a injeção, confirmando uma entrega bem-sucedida da veia porta ao fígado. As células tumorais são encontradas dentro dos sinusóides, bem como dentro do parênquima hepático, nas proximidades das tríades portais, onde o sangue da veia porta entra no fígado, sugerindo que o extravasamento ativo de células tumorais está ocorrendo neste momento.Conforme demonstrado por essas curvas de sobrevivência, a transferência da veia porta adotiva de linhagens celulares tumorais mamárias agressivas resulta em taxas de sobrevida livres de metástases mais curtas em comparação com camundongos injetados com uma linhagem celular tumoral menos agressiva. As metástases desses animais podem ser confirmadas pela seccionamento através do fígado em níveis de 250 mícrons e subsequente análise de H & E das amostras. Além disso, a análise de imunofluorescência é útil para análises de lesões micro e macro metastáticas de linhagens singênicas não marcadas, como a linha tumoral D2A1, que são CD45 negativas, Heppar-1 negativas e CK18 positivas, conforme demonstrado nessas imagens representativas.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 12 a 14 minutos por mouse, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de levar o tempo necessário para visualizar e acessar adequadamente a veia porta antes de tentar a injeção. Após este procedimento, outros métodos, como imagens intravitais após a injeção de células tumorais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como as células tumorais interagem com o ambiente lubramicro.Com seu desenvolvimento, essa técnica permite que pesquisadores no campo da metástase explorem estágios posteriores da cascata metastática de vários cânceres em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de onde fazer a incisão cirúrgica, como mover suavemente os órgãos internos para acessar a veia porta e como realizar a injeção intraportal. Não se esqueça, trabalhar com seringas carregadas com células tumorais pode ser perigoso e que devem ser tomadas precauções para evitar picadas de agulha durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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