Name: ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda a técnica ACT-PRESTO para clareamento de tecidos e imunomarcação em órgãos de camundongo, permitindo análise subcelular tridimensional sem necessidade de secção. Este método acelera a penetração de anticorpos em amostras grandes.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa do Cérebro por meio da National Research Foundation (NRF) financiada pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro da Coreia (NRF-2015M3C7A1028790).

experiências em animais devem estar em conformidade com todas as normas governamentais e institucionais relevantes. 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Para a solução de hidrogel monómero (A4P0): Adiciona-se 20 g de acrilamida e 450 mL de 0,1 x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ajustar o volume a 500 ml com 0,1 x PBS. CUIDADO: monómeros acrilamida são tóxicos. Efectuar todos os procedimentos em um exaustor com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório, luvas e sapatos fechados. <ol><li> Imediatamente antes de usar, adicionar 100 mg de 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propano] di-hidrocloreto a 40 mL de solução de monómero de hidrogel (A4P0) num tubo cónico de 50 mL sob uma coifa . </li></ol></li><li> Para a limpeza de tecidos electroforética (ETC) tampão: Adicionar 40 g de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) e 12,37 g de ácido bórico e 800 mL de H 2 O desionizada (dH2O). Ajustar o pH para 8,5 com NaOH e ajustar o volume para1 L com DH adicional de 2 O. CUIDADO: SDS é um produto químico prejudicial; portanto, lidar com isso com cuidado. </li><li> Para a solução CUBIC de montagem: Adicionar 250 g de sacarose, 125 g de ureia e 125 g de N, N, N &#39;, N&#39; -tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 150 ml de dH 2 O e perfazer o volume para 500 mL com dH2O </li></ol> 2. Preparação de amostras e Fixação <ol><li> Eutanásia do mouse. <ol><li> Prepara-se o alfaxalona (1 mg / kg) e xilazina (0,5 mg / kg) na mesma seringa. </li><li> Intraperitoneal injetar a mistura de alfaxalona e xilazina e permitir que 3 min para o mouse para se tornar inconsciente. </li><li> Espere até que o rato anestesiado já não responde a estímulos dolorosos, como uma pitada cauda, ​​antes de prosseguir. ATENÇÃO: Siga as orientações institucionais apropriados para a manipulação de animais. </li></ol></li><li> Transcardialmente perfundir o rato com 100 mL de NaCl a 0,9% (pH 7,4-7,5) solução decontendo heparina (100 U / mL) para desangrar, seguido por 100 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x (pH 7,4) 14. CUIDADO: solução PFA é tóxico. A preparação da solução de PFA e todo o tratamento posterior deve ser conduzida em um exaustor e com equipamento de protecção individual. </li><li> Cortar a cabeça do rato, abrir a pele, e quebrar o crânio entre os olhos usando uma tesoura pequena. </li><li> Remover pedaços do crânio usando pequenas pinças, curvado. </li><li> Retire do cérebro ou órgãos desejados. </li><li> Incubar o cérebro e os órgãos em pós-fix solução PFA a 4% a 4 ° C durante a noite. NOTA: Para específica da região de compensação de tecidos, dissecar a região específica ou cortar o tecido após a fixação do tecido. CUIDADO: solução PFA é tóxico. A perfusão transcardial e todo o tratamento posterior do rato deve ser conduzida em um exaustor e com equipamento de protecção individual. </li></ol> 3. Hidrogel Monómero de infusão e Polymerization <ol><li> Incubar os órgãos fixos em solução hidrogel monómero A4P0 a 4 ° C durante 12-24 horas com agitação suave. </li><li> Hidrogel monómero-infundido polimerização tecido. <ol><li> Transfira a amostra para um tubo de fundo redondo de 10 mL com 5 mL de solução de monómero de hidrogel. Enrole a parte superior do tubo de fundo redondo com Parafilm. </li><li> Remover o oxigénio a partir do tubo de fundo redondo contendo o rato inteiro amostra infundidos cérebro-hidrogel fazendo borbulhar azoto através do líquido durante 1 minuto. De forma rápida e firmemente fechar o tubo contendo amostra. </li></ol></li><li> Transferir o tubo para um banho-maria (37 ° C) durante 2 h. </li><li> Lava-se a amostra polimerizada brevemente com 0,1 x PBS para remover o excesso de hidrogel. CUIDADO: monómeros de hidrogel são tóxicos. Para evitar o contato da pele com monômero de hidrogel, execute todos os procedimentos em um exaustor e com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório e luvas. NOTA: polimerizado tecidospode ser armazenada em 0,1X PBS contendo azida de sódio durante mais de 2 semanas a 4 ° C. CUIDADO: A azida sódica é altamente e altamente tóxico. Efectuar todos os procedimentos em um exaustor e com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório e luvas. </li></ol> 4. eletroforética Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Transferir a amostra polimerizada a um recipiente de tecido e colocar o recipiente na câmara de tecido, etc. </li><li> Encha a câmara ETC ETC com tampão usando a bomba peristatic. </li><li> Defina as condições ETC e executar o ETC. Use as seguintes configurações. <ol><li> Para configurações etc para órgãos inteiros, utilize as seguintes definições: (1,5 AMP), temperatura (37 ° C), hora (6,0 h), a velocidade da bomba (30 rpm) em execução. </li><li> Para configurações etc para grossas fatias de cérebro de rato de 1 a 2 mm, use as seguintes configurações: atual (1,5 amp), temperatura (37 ° C), hora (2,0 h), a velocidade da bomba (30 rpm) em execução. </li></ol></li><li> transferência tele limpou amostra para um tubo cônico de 50 mL com 45 mL de 0,1 x PBS. Lavam-se as amostras compensadas várias vezes com 0,1X PBS até não há bolhas são vistas quando o tubo é agitado brevemente (para confirmar a remoção completa do SDS). </li></ol> 5. imunomarcação de tecidos processados-ACT <ol><li> Para toda rato cérebro: incubar a amostra num volume de 3 mL de solução de anticorpo contendo 1x PBS, 6% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% de Triton X-100, e 0,01% de azida de sódio (solução de diluição do anticorpo) com uma diluição fator de 1/500 para a tirosina hidroxilase anticorpo (TH) durante 4 dias a 37 ° C com agitação suave. Substituir a solução de anticorpo no final do dia 2. <ol><li> Lava-se a amostra num tubo cónico de 50 ml com 45 ml de 0,1 x PBS durante 3 - 5 h e mudar o tampão de cada hora. </li><li> Incubar a amostra num volume de 3 ml de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo secundário de burro anti-coelho de 488 durante 4 dias a 37 ° C com agitação suave. Replace as soluções anticorpo diluído no dia 2. </li></ol></li><li> Para a espessura 1- tecido cerebral cortado 2 mm: incubar a amostra durante a noite ou até um máximo de um dia, num volume de 0,5 a 1 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio do tipo IV a 37 ° C com agitação suave. <ol><li> Lava-se a amostra num tubo cónico de 15 mL com um volume de 12 ml de 0,1 x PBS durante 1-2 h. Alterar o buffer a cada hora. </li><li> Incubar a amostra num volume de 0,5 a 1 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para Cy3-conjugado de anticorpo secundário anti-coelho durante a noite ou até um máximo de 1 dia a 37 ° C com agitação suave. </li></ol></li><li> Lavar a amostra com 0,1 x PBS durante 3-5 h; mudar o tampão de cada hora. </li><li> Antes de imagiologia, incubar a amostra em uma quantidade adequada de solução de montagem cúbico por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Substitua com uma solução CUBIC-mount fresco e incubar durante mais 1 h. NOTA: </b&gt; 76 Tipo de anticorpos funcionou bem no tecido processado-ACT rato, incluindo 31 anticorpos monoclonais 14. Pré-tecido marcado pode ser combinado com a imunomarcação de mais dois fluorocromos no tecido ACT-processados. </li></ol> 6. imunomarcação de densas tecidos (Presto) <ol><li> c-PRESTO NOTA: c-PRESTO é adequado para pequenos porte amostras, tais como testículo inteiro, rim inteiro, ou pequenas seções de órgãos maiores. <ol><li> Transferir a amostra para um tubo de 1,5 ml, adicionar 500 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio tipo IV, e centrifuga-se o tubo a 600 × g durante 2 h. </li><li> Lava-se a amostra corada com 0,1 x PBS por centrifugação a 600 x g durante 30 min. </li><li> Adicionar 500 uL de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Cy3 e centrifugar a 600 x g durante 2 h. </li><li> Lavar a amostra corada com 0.1x PBS por centrifugação a 600 x g durante 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO NOTA: s-PRESTO é adequado para tecidos maiores. <ol><li> Prepare uma seringa (volume de 30 mL) e conectá-lo a uma válvula de 3 vias (Figura 1A). Cole a válvula com uma pistola de cola para as condições de alta pressão (Figura 1B). </li><li> Transferir a amostra para a seringa conectada à válvula de 3 vias em a posição da válvula fechada. </li><li> Adicionar 5 - 7 ml de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio do tipo IV. Libertar a solução de anticorpo na amostra através da abertura da válvula. </li><li> Colocar o pistão da seringa para a posição de 17 mL para proporcionar espaço suficiente para o movimento infusão / retirada. Isto pode ser feito na posição da válvula aberta. Fechar a válvula de 3 vias, após a definição seringa está terminado. </li><li> Colocar a seringa que contém a amostra em uma bomba de seringa. Definir as condições de bomba de seringa a um volume de infusão / retirada de 10 ml / min e um 4-min tempo de pausa no modo de ciclo contínuo (Figura 1C). NOTA: A bomba infunde até atingir o volume alvo (10 ml), e, em seguida, a direção de fluxo de alterações após uma breve pausa (4 min). </li><li> Executar a bomba de seringa, durante 3 - 24 h à temperatura ambiente (Figura 1F). </li><li> Abra a válvula de 3 vias e substituir a solução com 0,1 x PBS. </li><li> Lava-se a amostra corada duas vezes com 0,1 x PBS, durante 1 h cada vez usando a bomba de seringa. </li><li> Mudar com solução de diluição do anticorpo contendo anticorpo secundário anti-coelho Cy3 conjugada (factor de diluição de 1/500) e executar a bomba de seringa para 3-24 h. </li><li> Abra a válvula de 3 vias e substituir a solução com 0,1 x PBS. </li></ol></li><li> Antes de imagiologia, incubar a amostra manchado em uma quantidade adequada de solução de montagem cúbico por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Substitua com uma solução CUBIC-mount fresco e incubar durante mais 1 h. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Coloque o tecido marcado em um prato confocal e adicionar solução CUBIC de montagem até que o tecido é coberto. Coloque uma lamela sobre o tecido. Use um microscópio confocal para a imagem do tecido 14 sob a objetiva de 10X. </li></ol>

<ol><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Dodt, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22NATURE%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Kim, S. -Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li>
<li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+for+optical+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631(2016).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Má fixação ou a imersão do hidrogel em tecidos pode causar a perda de proteínas e a distorção do tecido durante o processo de limpeza do tecido. Todo o cérebro do rato adulto deve ser incubada em paraformaldeído a 4% durante a noite, seguido por imersão num volume mínimo de 20 mL de solução de monómero de hidrogel para 12 - 18 h com agitação suave. Para grandes tecidos, incluindo tecidos de origem humana, tais como fatias de cérebro e medula espinal, estendido imersão tempo na solução de monómero de hidrogel é necessária. O protocolo ACT é facilmente aplicável à limpeza de tecidos fixos porque os passos de fixação de tecido e de infusão de polímero são separados. Depois de limpa de tecido, tecidos humanos foram bem coradas com vários anticorpos. Note-se que a técnica ACT compensação não é compatível com fixadores álcool, tal como etanol e metanol. A etapa de polimerização tecido-hidrogel também é fundamental para a produção de tecidos de boa qualidade no seguimento do processo de compensação. Porqueo oxigénio inibe a polimerização de acrilamida, que deve ser removido por desgaseificação a solução contendo o tecido sob um sistema de infusão de azoto gasoso. Alternativamente, DE-oxigenação pode ser executado usando uma câmara de vácuo com um bloco de aquecimento durante 23 h. A taxa de compensação é dependente de vários fatores, incluindo o tamanho do órgão, o conteúdo de lipídios ou proteínas fibrosas ECM, a condição de fixação, etc. A maioria dos tecidos do rato adulto pode ser afastada pelo ETC durante a noite. No entanto, há um risco desnecessário de sobre-compensação e inchaço dos tecidos; Assim, as diferenças de tempo de compensação são de consideração importante. condições tecido de limpeza deve ser determinada empiricamente. Mais importante, o conteúdo da ECM podem afectar a aparência do tecido limpo. A cor dos tecidos permanece branca ou opaca, mesmo após a ACT em tampão ETC, porque ACT não limpa fibras de proteína densas. No entanto, quando estes órgãos foram imersos em solução correspondente RI, oy se tornou transparente. A taxa de inchamento dos tecidos parece ser dependente do conteúdo de ECM os tecidos e órgãos moles, tais como o cérebro, exibem uma proporção de inchaço superior a órgãos densas. Porque o aumento do inchaço dos tecidos vai ajudar o processo de tecido-clearing, ACT rotineiramente utiliza destilada tampão à base de água na maioria dos casos. Em alguns casos, quando o inchaço dos tecidos ou deformidade transitória não é desejável, tais como em embriões, tampão contendo 0,1 x PBS pode ser aplicada para imagens de alta resolução. Deve-se também notar-se que as concentrações mais elevadas de sal no tampão poderia causar o encolhimento dos tecidos. O método ACT pode esclarecer órgãos inteiros e até mesmo todo o corpo de um rato 14. No entanto, processamento de imagem de tecidos profundos de tecido transparente exige microscópios e objetivos especiais. Assim, o tecido cerebral de 1 a 2 mm de espessura é mais eficaz para imagiologia com um microscópio confocal convencional. Nas nossas mãos, a remoção da etiquetaanticorpos ed dos tecidos processados-ACT é dependente de anticorpos, e rodadas de rotulagem anticorpo diferente não são recomendados. Vários anticorpos, como TH e GFAP, trabalhou especialmente bem para todo o cérebro immunolabeling 14. Por outro lado, alguns anticorpos, tais como TuJ1 ou Map2, frequentemente marcado apenas a superfície dos tecidos. Isto pode ser melhorado por outros métodos, tais como o interruptor 15. Outra limitação potencial é que pode ser difícil para preservar estruturas de proteínas finas no tecido processado-ACT devido ao inchaço dos tecidos e encolhimento durante a etapa de remoção de tecido. A técnica presto é aplicável a uma grande variedade de técnicas de rotulagem tecido. Por exemplo, em métodos de tecido transparente usando tecido pré-marcada, como SeeDB 4 e 7 iDISCO, imunomarcação de tecido denso requer períodos de incubação mais longos do que alguns dias a semanas. No entanto, Presto pode encurtar o tempo de incubação a várias horas, enabling a realização de todo o processo dentro de um dia, com 1 mm de espessura de tecido denso. PRESTO pode melhorar a eficácia de deep-rotulagem de espessura, tecidos densos, ou tecidos grossos mesmo un-desmatadas. Porque Presto utiliza uma centrífuga de mesa ou bomba de seringa e não requer qualquer equipamento especial, é relativamente fácil de implementar esta técnica com os procedimentos laboratoriais de rotina.

Um dos desafios da neurociência é a visualização de fiação do circuito neuronal e as células individuais dentro do tecido cerebral intacto. Até recentemente, demonstrando as conexões entre os neurônios desta forma necessária 1) cortes seriados de tecidos; 2) rotulagem molecular de alvos específicos, como axônios ou proteínas; e 3) a visualização de reconstrução 3D de todo o cérebro através de registro computacional ou o alinhamento das imagens em série 2D 1. Estes passos são trabalhoso, requer uma grande quantidade de tempo, e são susceptíveis de perder informações durante o corte e rotulagem, fazendo o mapeamento de rede neuronal extremamente difícil. No entanto, muitos métodos que permitem a visualização de tecido intacto, sem corte têm sido desenvolvidos. Os tecidos biológicos pode ser feita opticamente transparente por meio de técnicas de limpeza de tecido 2-10. Um dos principais métodos é reduzir as diferenças do índice de refracção entre o tecido intacto e a solução de imersão em ordempara reduzir a dispersão da luz no tecido intacto, tornando assim o tecido transparente e permitindo a observação de estruturas profundas. Alguns tipos de soluções de imersão tem propriedades hidrofóbicas, o que resulta na rápida paragem da fluorescência durante o processo de desidratação. Por conseguinte, estes métodos não são compatíveis com imagens fluorescentes ao longo de um longo período de tempo de 11,12. Em vez de reagentes hidrofóbicas, outros métodos utilizam reagentes hidrofílicos para limpeza de tecidos, tais como SeeDB 4 e Sca l e 6, que mantêm a informação estrutural e de fluorescência do 4,6,8 tecido biológico. Contudo, macromoléculas, incluindo anticorpos, podem não alcançar o núcleo de tecido intacto por difusão por si só. Portanto, a pré-marcação de moléculas alvo em áreas profundas de tecidos densamente-embalados é tecnicamente desafiador. Num método tecido desobstrução-recentemente desenvolvidos, Clareza 3, um i de tecido biológico embebido em hidrogels formados com acrilamida, e os lípidos são removidos por electroforese sob sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a solução molecular contendo. A amostra é então imerso numa solução com um índice de reflexão correspondente para reduzir a luz de espalhamento 3. O sistema de remoção de lípidos foi posteriormente modificada em clareza avançada 13 e PACT (técnica de clareza passiva) 10. Após a polimerização, as cadeias de ligação cruzada com proteínas de acrilamida, formando hidrogel-tecido. componentes lipídicos pode não reticulam com acrilamida; Assim, os lípidos podem ser eliminados por electroforese sob o tampão contendo SDS. Através da eliminação ativa de lipídios, o tecido cerebral aumenta acentuadamente em transparência 9. No entanto, estes métodos não abordam a impossibilidade de deep-rotulagem por difusão livre. Para superar essa limitação, técnicas para o transporte ativo de reagentes para as partes mais profundas de tecidos grossos são necessários. Embora CLAREZA permite compensação de tecido e tecido-fundovisualização, não é um processo fácil ou rápido. Ele pode levar várias semanas para limpar a 7,14 cérebro do rato inteiro. compensação rápida dos tecidos é essencial para a aplicação de tais métodos para definições básicas ou clínicas laboratoriais para pesquisa de ciências biológicas ou diagnóstico volume. O protocolo atual fornece um processo simplificado para apuramento tecido biológico e detecção da proteína subsequente mediante a entrega de imuno-coloração assistida por pressão. É apropriado para a formação de imagens espaciais de alta resolução de sistemas de processamento de dados arquivados grandes e 3D através da combinação com métodos de imagem.

<table><tbody><tr><td>4% de Paraformaldeído</td><td>Lugen SCI&nbsp;</td><td>Fixação de amostra LGB-1175-4B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>Solução de monômero de hidrogel&nbsp;</td></tr><tr><td>2,2'-Azobis [2-(2-imidazolin-2-il) propano] dicloridrato</td><td>Wako Pure Chemical Industries&nbsp; &nbsp;</td><td>VA-044 Solução de</td><td>monômero de hidrogel&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão de ácido bórico</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Tampão Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETC</td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sódio</td><td>Junsei químico</td><td>1310-73-2</td><td>Tampão ETC</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323A</td><td>Imunomarcação</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Imunomarcação</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Imunomarcação</td></tr><tr><td>Tirosina hidroxilase (TH)</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Anticorpo/imunomarcação</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 Burro anti-Coelho IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Anticorpo/imunomarcação secundária</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro anti-Coelho IgG (H+L)</td><td>Life Technologies - Molecular Sondas</td><td>A21206</td><td>Anticorpo/imunomarcação secundários</td></tr><tr><td>Prato confocal</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td> de imagem <td>Leica</td><td>SP8</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Junsei chemical</td><td>31365-0301</td><td>Solução de montagem CUBIC&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de</td> montagem CUBIC <td>Urea Affymetrix</td><td>23036</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N,N',N' -tetrakis(2-hidroxipropil)etilenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>solução de montagem CUBIC&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmara ECT</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de câmara ECT</td> do sistema ETC <td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>Sonda de temperatura do sistema ETC</td></tr><tr><td></td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>Sistema ETC</td></tr><tr><td>Bomba periestática</td><td>Baoding bomba de precisão mais longa Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>Sistema ETC</td></tr><tr><td>Reservatório tampão</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>Sistema ETC</td></tr><tr><td>Recipiente de tecido&nbsp;</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>Sistema C12001</td><td>ETC</td></tr><tr><td>Suporte de recipiente para 1 recipiente de tecido</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>Sistema ETC</td></tr><tr><td>Suporte de fatia de cérebro de rato</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12004</td><td>Sistema ETC</td></tr><tr><td>Suporte de cérebro de rato inteiro</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>Sistema ETC</td></tr><tr><td>Tubulação de bomba peristáltica</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETC sistema</td></tr><tr><td>de mesa-centrífuga</td><td>Hanil science industrial Co., Ltd</td><td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Baoding bomba de precisão mais longa Co., Ltd</td><td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>Seringa (30 mL)</td> <td>Korea vaccine Co., Ltd.</td><td>KV-S30</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>torneira de 3 vias</td><td>Hyupsung medical Co.,Ltd.</td><td>HS-T-01N</td><td>s-PRESTO</td></tr></tbody></table>

act-presto: clearing tecido biológico e métodos imunomarcação for imaging volume

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

A identificação e exploração da organização detalhada de órgãos ou de todo o corpo no nível celular são desafios fundamentais da biologia. métodos de transição requerem uma quantidade substancial de tempo e esforço para obter uma imagem 3D e incluindo o seccionamento do tecido intacto, imunomarcação e imagiologia do tecido em série em corte, o que produz uma perda de informação em cada passo do processo. Em abordagens recentemente desenvolvidas para imagens de alta resolução dentro do tecido intacto, caracterização molecular foi restringido à rotulagem de proteínas. No entanto, os protocolos disponíveis atualmente para compensação de órgãos exigem um tempo de processo consideravelmente longo, tornando-se difícil de implementar técnicas de limpeza de tecidos em laboratório. Recentemente, estabeleceu um protocolo rápido e altamente reprodutível denominado ACT-PRESTO (a ctive c laridade t echnique- p ressão r exultante e ficiente e s tabela t ransferênciade macromoléculas para o rgans), o que permite o afastamento do tecido dentro de várias horas. Além disso, ACT-PRESTO permite imunomarcação rápida com os métodos convencionais e acelera a penetração de anticorpos na camada profunda da densamente formados espécimes, de espessura através da aplicação de fluxo de pressão ou convecção. Nós descrevem como preparar tecidos, como limpar pela remoção de lipídios usando eletroforese, e como imuno-mancha por um parto assistido à pressão. A rapidez e consistência do protocolo irá acelerar o desempenho da investigação histológica 3D e diagnósticos baseados no volume.

Clearing ACT-tecidos Um fator importante que afeta a compensação de tecidos é a fixação do tecido. PFA fixação e infusão de acrilamida são etapas separadas neste protocolo. Depois do passo de polimerização do tecido de hidrogel, a solução A4P0 livre não é polimerizado, apesar de infusão de tecido hidrogéis são reticulados com macromoléculas endógenas. Portanto, não deve formar gel de fora do tecido (Figura 2A). O procedimento ACT resulta em menos reticulação entre as proteínas e acrilamida em comparação com o protocolo de clareza. Assim, a amostra de tecido de hidrogel é mais porosa. Este recurso permite a extração rápida de lipídios e a difusão de macromoléculas. As secções de cérebro de rato de 1 a 2 mm de espessura foram suficientemente afastada dentro de 1 - 2 horas (Figura 2B), e 5-6 h de etc foi suficiente para Clearance de cérebros inteiros de rato (Figura 2C). compensação de tecido mediada por Hidrogel induziu a expansão do tecido depois do passo etc, mas o tecido devolvido ao seu tamanho original, em solução pareados por índice de reflexão. A amostra de tecido de hidrogel formado no procedimento ACT é altamente porosa, e, assim, compostos pequenos e macromoléculas poderia penetrar eficientemente e difundir facilmente (Figura 3). Após 2 h de incubação de fatias de cérebro de 1 mm com tirosina-hidroxilase (TH) e o anticorpo de tipo IV do colagénio, uma subsequente de 2 horas de incubação com um anticorpo secundário era suficiente para rotular os neurónios dopaminérgicos, a uma profundidade de 500 um (Figura 3) . Imunomarcação PRESTO-tecidos órgãos densas têm, geralmente, concentrações elevadas de fibras de ECM, que afecta a penetração dos anticorpos para os tecidos. Assim, os anticorpos Penetavaliaram a uma profundidade de apenas 20-30 uM em tecidos densos, tais como o tecido renal, após 12 h de incubação. Para superar esta limitação, desenvolvemos métodos de penetração de macromoléculas activas que permitem a entrega de reagentes para os tecidos profundos, isto é, presto (pressão relacionada com a transmissão estável e eficiente de macromoléculas para os órgãos) (Figura 4). Em comparação com a incubação estática de tecido renal processado-ACT com soluções de anticorpos, a aplicação de forças centrífugas (600 xg) com uma centrífuga de mesa (PRESTO centrífuga, c-PRESTO) melhorou muito a entrega de anticorpos no tecido profundo (Figura 5). Quando aplicamos o procedimento c-PRESTO aos tecidos densos, 3 h de incubação foi suficiente para rotular 250 para estruturas profundas 300 mícrons. Para melhorar a distorção do tecido, sem dano tecidual significativa, que também projetou uma máquina que fornece fluxo de convecção com uma bomba de seringa (PRESTO seringa, s-PRESTO). Este processo igualmente melhorada pe de anticorposnetration comparada à difusão passiva (Figura 5). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg"> Figura 1. Preparação do aparelho s-presto. A. Uma seringa (30 mL) e torneira de três vias. B. A torneira de três vias conectada e colada à seringa. C. A seringa contendo a solução de amostra e o anticorpo, e a seringa colocada sobre a bomba de seringa. D. A bomba de seringa e configuração de condição de trabalho. E. A bomba de infusão de um solução contendo os reagentes de marcação para o espécime. Quando o volume designado é atingido, as mudanças de direcção de bombagem e se retira a solução após um período de tempo designado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. ACT compensação tecido do cérebro de rato. A. Após a polimerização, as soluções A4P0 livres não são polimerizados; hidrogeles infusão de tecido são gelificado por reticulação com macromoléculas endógenas. B. 1 a fatias de cérebro de espessura de 2 mm foram apuradas para 1 - 2 h, e o grau de expansão e recuperação de tamanho em índice de reflexão (RI) solução -Correspondência foram registrados. C. A espessura de todo o cérebro do rato é de cerca de 0,8 cm e 5-6 h da ETC foi suficiente para limpar completamente o cérebro. Após 3 h de ETC, houve uma quantidade significativa de tecido não apagada. Por 6 h de ETC, no entanto, havia ocorrido compensação de todo o cérebro. A cor dos tecidos após ACT no buffer ETC é branca ou opaca. Pelo ajuste RI, os tecidos tornam-se transparentes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique dela</a>e para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg"> Figura 3. imunomarcação com tecido cerebral do rato limpou-ACT. Imagens de 1 mm fatias processadas-ACT cérebro do rato mostrando córtex cerebral do rato corado com um anticorpo para colágeno tipo IV e parte do mesencéfalo coradas com um anticorpo para tirosina hidroxilase (TH). barra de escala, 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg"> Figura métodos imunomarcação 4. PRESTO. Os anticorpos não conseguem penetrar em tecidos densos por difusão. métodos PRESTO imunomarcação foram projetados para infundir ativamente macromoléculas e entregar reagentes paratecidos densos. A aplicação de forças centrífugas, usando uma centrífuga de bancada padrão (Presto centrífuga, c-Presto) nitidamente facilitada a entrega de anticorpos. A aplicação de fluxo de convecção com uma bomba de seringa (PRESTO seringa, s-PRESTO) melhorou a penetração do anticorpo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg"> Figura 5. PRESTO imunomarcação de tecido denso limpou-ACT. Para C-Presto, os tecidos foram centrifugadas a 600 xg durante 3 h, usando uma centrífuga de bancada padrão, a fim de acelerar a penetração dos anticorpos primários e secundários. Para S-Presto, uma bomba de seringa foi utilizado para entregar os anticorpos. órgãos do rato, tais como os rins e do fígado, foram marcadas com colagénio de tipo IV. Comparado com os métodos convencionais, 3 h deC ou S-PRESTO marcadamente aumenta a profundidade rotulagem. No rim e fígado, a profundidade do eixo Z atinge 300-350 uM ou mais profundo em amostras presto (à direita), enquanto as amostras de controlo são rotulados a uma profundidade de apenas 40 - 50 | iM (esquerda). A imagem reconstruída 3D foi obtida com um microscópio confocal. barra de escala, 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

ACT-PRESTO (clareza técnica de pressão ativo relacionado transferência eficiente e estável de macromoléculas em órgãos) permite o rápido e eficiente, mas barato compensação tecido e penetração anticorpo rápida nos tecidos foi afastada pelo difusão passiva ou parto assistido à pressão. Usando este método, uma vasta gama de tecidos pode ser apagada, por immunolabeled anticorpos múltiplos, e o volume-fotografada.

ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

O objetivo geral deste procedimento é obter o tecido limpo e intacto e visualizar suas informações moleculares tridimensionais usando métodos de imunomarcação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da neurociência e da biologia do desenvolvimento, como conexões neuronais, categorização molecular e mudança estrutural durante o desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é que o tecido permite claramente a análise em nível subcelular de grandes amostras sem seccionamento.Para iniciar este procedimento, incube os órgãos fixados em solução de monômero de hidrogel A4P0 a quatro graus Celsius por 12 a 24 horas com agitação suave. Depois disso, adicione cinco mililitros de solução de monômero de hidrogel a um tubo inferior redondo de 10 mililitros. Em seguida, transfira a amostra de cérebro de camundongo para ele e envolva a parte superior do tubo com Parafilm.Em seguida, borbulhe nitrogênio através do líquido com a amostra de cérebro infundida com hidrogel por um minuto. Feche rápida e firmemente a amostra contendo o tubo. Transfira o tubo para banho-maria por duas horas.Depois disso, verifique a viscosidade do hidrogel e, em seguida, lave brevemente a amostra polimerizada com 0,1 X PBS para remover o excesso de hidrogel. Nesta etapa, transfira a amostra polimerizada para um recipiente de tecido. E coloque o recipiente de tecido na câmara ETC.Em seguida, encha a câmara ETC com tampão ETC usando uma bomba peristáltica. Defina as condições de EPT e ative-as. Fatias de cérebro de um a dois milímetros de espessura são limpas em duas horas.E um cérebro inteiro é suficientemente limpo dentro de cinco a seis horas. Em seguida, transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mililitros com 45 mililitros de 0,1 X PBS. Lave a amostra várias vezes com 0,1 X PBS até que não sejam vistas bolhas quando o tubo for agitado brevemente para confirmar a remoção completa do SDS.Para realizar o c-PRESTO, transfira uma pequena amostra para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de solução de diluição de anticorpos com um fator de diluição de um a 500 para o anticorpo colágeno tipo quatro e centrifugue o tubo a 600 vezes g por duas horas. Em seguida, lavar a amostra corada com 0,1 X PBS por centrifugação a 600 vezes g durante 30 minutos.Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de diluição de anticorpos com um fator de diluição de um a 500 para o anticorpo secundário Anti Rabbit conjugado Cy3 e centrifugue 600 vezes g por duas horas. Em seguida, lavar a amostra corada com 0,1 X PBS por centrifugação a 600 vezes g durante 30 minutos. Para realizar o s-PRESTO para tecidos maiores, transfira a amostra para uma seringa conectada à válvula de três vias na posição de válvula fechada.Adicione cinco a sete mililitros de solução de diluição de anticorpos com um fator de diluição de um a 500 para o anticorpo colágeno tipo quatro. Em seguida, adicione a solução de anticorpos à amostra abrindo a válvula. Em seguida, na posição de válvula aberta, coloque o pistão da seringa na posição de 17 mililitros para fornecer espaço suficiente para o movimento de retirada da infusão.Em seguida, feche a válvula de três vias após a conclusão do ajuste da seringa. Coloque a seringa contendo a amostra em uma bomba de seringa. Defina as condições da bomba de seringa para um volume de retirada de infusão de dez mililitros por minuto e um tempo de pausa de quatro minutos no modo de ciclo contínuo.Depois, ligue a bomba de seringa por três a 24 horas em temperatura ambiente. Em seguida, abra a válvula de três vias e substitua a solução por 0,1 X PBS. Lave a amostra corada duas vezes com 0,1 X PBS por uma hora de cada vez, usando a bomba de seringa.Em seguida, substitua o PBS pela solução de diluição de anticorpos contendo anticorpo secundário Anti Rabbit conjugado Cy3 e opere a bomba de seringa por três a 24 horas. Em seguida, abra a válvula de três vias e substitua a solução por 0,1 X PBS. Antes da aquisição de imagens, incube a amostra corada em uma quantidade apropriada de solução de montagem cúbica por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave.Após uma hora, substitua a solução por uma solução nova de montagem cúbica e incube por mais uma hora. Como os anticorpos não podem penetrar em tecidos densos por difusão, os métodos de imunomarcação PRESTO são projetados para infundir ativamente macromoléculas e fornecer reagentes em tecidos densos. A aplicação de forças centrífugas usando uma centrífuga de mesa padrão facilitou significativamente a entrega de anticorpos.A aplicação do fluxo de convecção com uma bomba de seringa também melhorou a penetração de anticorpos. Para s-PRESTO, uma bomba de seringa foi usada para administrar os anticorpos. Os órgãos do camundongo, como rins e fígado, foram marcados com colágeno tipo 4.Em comparação com os métodos convencionais, três horas de c ou s-PRESTO aumentam significativamente a profundidade de rotulagem. No rim e no fígado, a profundidade do eixo z atinge 300 a 350 micrômetros ou mais nas amostras PRESTO, enquanto as amostras de controle são marcadas a uma profundidade de apenas 40 a 50 micrômetros. Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser feitas em um dia para o tecido claramente se forem executadas corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter claramente o tempo de fixação do tecido, emulsão de monômero de hidrogel e tecido eletroforético. Após o procedimento, outros métodos, como imunomarcação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como análise da dinâmica celular e identificação de um alvéolo neuronal em vários órgãos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da ciência médica explorarem o diagnóstico de doenças.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer a incorporação de hidrogel e a polimerização de tecidos. Não se esqueça de que trabalhar com solução de monômero de hidrogel pode ser extremamente perigoso e deve-se sempre tomar precauções ao realizar este procedimento.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples de células de imagem fluorescente etiquetado em fatias grossas semi-cérebro. Através da fixação, corte, limpeza e opticamente tecido cerebral descrevemos como imagens de epifluorescência ou confocal padrão pode ser usado para visualizar as células individuais e redes neuronal no tecido nervoso intacto.

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

Para obter imagens de alta resolução de células marcadas com fluorescência dentro de grandes tecidos, idealmente, as amostras biológicas devem ser visualizadas sem seccionamento. 3DISCO é um procedimento simples de limpeza de tecidos baseado na incubação sequencial com solventes orgânicos. Após a limpeza, os órgãos tornam-se transparentes, permitindo uma varredura a laser de ponta a ponta da amostra.

Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método rápido para a determinação das concentrações relativas dos compostos marcados com fluorescência no interior e entre os tecidos ou os grupos de tratamento. Por outro lado, a histologia quantitativa de fluorescência, enquanto que mais trabalho intensivo, permite a quantificação dos níveis absolutos de tecido de moléculas marcadas.

O uso de Ex Vivo Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 + cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Este estudo apresenta um protocolo para o tecido reversível compensação, imunocoloração, renderização 3D e análise de redes vasculares em amostras de vilosidades da placenta humana na ordem de 1-2 mm3.

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

O presente protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para limpeza óptica rápida e simultânea, marcação multi-redonda e reconstrução volumétrica 3D de dezenas de cortes cerebrais humanos post-mortem, combinando a técnica de transformação de tecido curto (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) com imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz em um protocolo de alto rendimento de rotina.

Limpeza óptica e marcação para microscopia de fluorescência de folha de luz em imagens cerebrais humanas em larga escala

Este protocolo apresenta um método rápido para imagens vasculares tridimensionais quantitativas de montagem total usando microscopia de fluorescência de folha de luz. A eficácia do método é demonstrada usando o sistema de artérias do arco faríngeo do modelo de embrião de galinha, com forças hemodinâmicas quantificadas via fluidodinâmica computacional.

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Aprenda a técnica ACT-PRESTO para clareamento de tecidos e imunomarcação em órgãos de camundongo, permitindo análise subcelular tridimensional sem necessidade de secção. Este método acelera a penetração de anticorpos em amostras grandes.

ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

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