ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

O objetivo geral deste procedimento é obter o tecido limpo e intacto e visualizar suas informações moleculares tridimensionais usando métodos de imunomarcação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da neurociência e da biologia do desenvolvimento, como conexões neuronais, categorização molecular e mudança estrutural durante o desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é que o tecido permite claramente a análise em nível subcelular de grandes amostras sem seccionamento.

Para iniciar este procedimento, incube os órgãos fixados em solução de monômero de hidrogel A4P0 a quatro graus Celsius por 12 a 24 horas com agitação suave. Depois disso, adicione cinco mililitros de solução de monômero de hidrogel a um tubo inferior redondo de 10 mililitros. Em seguida, transfira a amostra de cérebro de camundongo para ele e envolva a parte superior do tubo com Parafilm.

Em seguida, borbulhe nitrogênio através do líquido com a amostra de cérebro infundida com hidrogel por um minuto. Feche rápida e firmemente a amostra contendo o tubo. Transfira o tubo para banho-maria por duas horas.

Depois disso, verifique a viscosidade do hidrogel e, em seguida, lave brevemente a amostra polimerizada com 0,1 X PBS para remover o excesso de hidrogel. Nesta etapa, transfira a amostra polimerizada para um recipiente de tecido. E coloque o recipiente de tecido na câmara ETC.

Em seguida, encha a câmara ETC com tampão ETC usando uma bomba peristáltica. Defina as condições de EPT e ative-as. Fatias de cérebro de um a dois milímetros de espessura são limpas em duas horas.

E um cérebro inteiro é suficientemente limpo dentro de cinco a seis horas. Em seguida, transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mililitros com 45 mililitros de 0,1 X PBS. Lave a amostra várias vezes com 0,1 X PBS até que não sejam vistas bolhas quando o tubo for agitado brevemente para confirmar a remoção completa do SDS.

Para realizar o c-PRESTO, transfira uma pequena amostra para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de solução de diluição de anticorpos com um fator de diluição de um a 500 para o anticorpo colágeno tipo quatro e centrifugue o tubo a 600 vezes g por duas horas. Em seguida, lavar a amostra corada com 0,1 X PBS por centrifugação a 600 vezes g durante 30 minutos.

Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de diluição de anticorpos com um fator de diluição de um a 500 para o anticorpo secundário Anti Rabbit conjugado Cy3 e centrifugue 600 vezes g por duas horas. Em seguida, lavar a amostra corada com 0,1 X PBS por centrifugação a 600 vezes g durante 30 minutos. Para realizar o s-PRESTO para tecidos maiores, transfira a amostra para uma seringa conectada à válvula de três vias na posição de válvula fechada.

Adicione cinco a sete mililitros de solução de diluição de anticorpos com um fator de diluição de um a 500 para o anticorpo colágeno tipo quatro. Em seguida, adicione a solução de anticorpos à amostra abrindo a válvula. Em seguida, na posição de válvula aberta, coloque o pistão da seringa na posição de 17 mililitros para fornecer espaço suficiente para o movimento de retirada da infusão.

Em seguida, feche a válvula de três vias após a conclusão do ajuste da seringa. Coloque a seringa contendo a amostra em uma bomba de seringa. Defina as condições da bomba de seringa para um volume de retirada de infusão de dez mililitros por minuto e um tempo de pausa de quatro minutos no modo de ciclo contínuo.

Depois, ligue a bomba de seringa por três a 24 horas em temperatura ambiente. Em seguida, abra a válvula de três vias e substitua a solução por 0,1 X PBS. Lave a amostra corada duas vezes com 0,1 X PBS por uma hora de cada vez, usando a bomba de seringa.

Em seguida, substitua o PBS pela solução de diluição de anticorpos contendo anticorpo secundário Anti Rabbit conjugado Cy3 e opere a bomba de seringa por três a 24 horas. Em seguida, abra a válvula de três vias e substitua a solução por 0,1 X PBS. Antes da aquisição de imagens, incube a amostra corada em uma quantidade apropriada de solução de montagem cúbica por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave.

Após uma hora, substitua a solução por uma solução nova de montagem cúbica e incube por mais uma hora. Como os anticorpos não podem penetrar em tecidos densos por difusão, os métodos de imunomarcação PRESTO são projetados para infundir ativamente macromoléculas e fornecer reagentes em tecidos densos. A aplicação de forças centrífugas usando uma centrífuga de mesa padrão facilitou significativamente a entrega de anticorpos.

A aplicação do fluxo de convecção com uma bomba de seringa também melhorou a penetração de anticorpos. Para s-PRESTO, uma bomba de seringa foi usada para administrar os anticorpos. Os órgãos do camundongo, como rins e fígado, foram marcados com colágeno tipo 4.

Em comparação com os métodos convencionais, três horas de c ou s-PRESTO aumentam significativamente a profundidade de rotulagem. No rim e no fígado, a profundidade do eixo z atinge 300 a 350 micrômetros ou mais nas amostras PRESTO, enquanto as amostras de controle são marcadas a uma profundidade de apenas 40 a 50 micrômetros. Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser feitas em um dia para o tecido claramente se forem executadas corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter claramente o tempo de fixação do tecido, emulsão de monômero de hidrogel e tecido eletroforético. Após o procedimento, outros métodos, como imunomarcação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como análise da dinâmica celular e identificação de um alvéolo neuronal em vários órgãos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da ciência médica explorarem o diagnóstico de doenças.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer a incorporação de hidrogel e a polimerização de tecidos. Não se esqueça de que trabalhar com solução de monômero de hidrogel pode ser extremamente perigoso e deve-se sempre tomar precauções ao realizar este procedimento.