Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é medir a autoadministração de etanol em moscas-das-frutas como um proxy para mudanças nos estados de recompensa. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave da neurociência, como como a experiência é codificada no cérebro e leva à modificação do comportamento. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente simples e não requer uma configuração complicada.

O protocolo é composto por duas partes distintas. O primeiro é expor as moscas a experiências gratificantes e não recompensadoras, e o segundo é testar o consumo voluntário de etanol como uma medida da motivação para obter uma recompensa de drogas. As duas partes do protocolo podem ser usadas independentemente.

Induzir a modulação da experiência como um passo inicial para outros ensaios a jusante, ou, como um ensaio de alimentação independente de duas escolhas. Demonstrando o procedimento estarão Shir Zer, um estudante de mestrado, e Julia Ryvkin, uma estudante de pós-graduação, ambos do meu laboratório. Para iniciar a construção do alimentador capilar, primeiro pegue um frasco padrão para moscas com pequenos orifícios ao longo da lateral do frasco.

Use uma lâmina de barbear para cortar o plugue do frasco ao meio, transversalmente. Marque quatro pontos na superfície do plugue, criando uma forma quadrada para posicionar os suportes capilares. Com uma agulha de calibre 18, faça quatro furos no tampão na posição das marcas.

E faça os orifícios mais largos usando uma micropipeta. Usando uma lâmina de barbear, corte quatro micropipetas de modo que segurem firmemente cinco capilares de vidro de microlitros. Insira-os nos orifícios do plugue preparado.

Marque a posição no tampão dos dois capilares que conterão etanol. Em seguida, organize os frascos de vidro em racks de microcentrífuga. Derreta a comida da mosca e despeje dois mililitros em cada um dos frascos.

Deixe os alimentos endurecerem e cubra os frascos com filme plástico. Comece pegando moscas machos que foram alojadas separadamente em frascos menores em reclusão. Atribua-os a dois grupos aleatoriamente.

Aqueles que passarão por experiências de acasalamento gratificantes versus não recompensadoras. Começando com o grupo não recompensador, adicione uma fêmea previamente acasalada a cada frasco. Passando para o grupo de recompensa, adicione uma fêmea virgem a cada frasco.

Observe os encontros de acasalamento para garantir que os machos que interagem com fêmeas virgens acasalem com sucesso na primeira hora. E que os machos que interagem com fêmeas previamente acasaladas não acasalam. É essencial observar com cuidado, para garantir que a coorte acasalada realmente sofra acasalamento e que a coorte rejeitada não consiga acasalar.

Após uma hora, remova do experimento todos os machos da coorte rejeitada que conseguiram acasalar e os machos da coorte acasalada que não acabaram acasalando até o final da primeira sessão de treinamento. Conclua a sessão de condicionamento aspirando as fêmeas previamente acasaladas da condição não recompensadora, mantendo esses indivíduos para testes posteriores. Finalmente, remova e descarte as fêmeas do grupo de machos acasalados.

Deixe as moscas descansarem por uma hora e, em seguida, repita o ensaio de condicionamento de uma hora mais duas vezes com uma hora de descanso entre elas. Essas sessões de treinamento devem ser repetidas novamente a cada dia por mais três dias. Após a sessão final de condicionamento no quarto dia, aspire os machos solteiros e coloque-os em grupos de seis a oito nos frascos de alimentação capilar, mantendo as moscas do mesmo grupo de recompensa juntas.

Use um plugue macio para manter os machos no lugar durante a transferência. Depois que todas as moscas estiverem inseridas, substitua o plugue macio pelo plugue do alimentador capilar. Molhe os plugues adicionando suavemente cinco mililitros de água na parte superior de cada plugue, evitando derramamento no frasco.

Prepare as soluções alimentares de etanol e água e, em seguida, coloque cinco gotas de microlitro em uma tira de filme de laboratório. Deixe a solução encher o capilar até atingir a marca de cinco microlitros. Em seguida, bata-os suavemente na tira para posicionar a solução exatamente na linha pré-marcada.

Sele as extremidades dos capilares mergulhando-as em pequenas gotículas de óleo mineral. Por fim, insira os dois capilares contendo etanol e não contendo etanol nos adaptadores do plugue. Os lados expostos devem sobressair um milímetro ou menos da superfície do plugue.

Manter a abertura para os capilares perto do tampão úmido reduz a evaporação e permite fácil acesso aos alimentos, pois as moscas normalmente se sentam nos tampões e descem no capilar exposto para se alimentar. Além disso, prepare um frasco simulado sem moscas, que será usado como controle para avaliar a evaporação natural. Finalmente, registre a posição relativa do líquido em cada um dos capilares em frascos em relação à linha preta em milímetros.

Coloque os frascos na incubadora experimental por 24 horas. Meça e registre os níveis do líquido em cada capilar removido em relação à linha preta. Quando o experimento estiver em andamento, substitua o capilar em um horário definido, todos os dias.

Umedeça novamente os plugues com dois mililitros de água e, em seguida, coloque os frascos de volta na incubadora. Moscas da fruta machos do tipo cantão selvagem coletadas após a eclosão e envelhecidas até os quatro dias de idade, foram testadas ao longo de quatro dias quanto à sua preferência inata de consumir álcool. A análise dos volumes consumidos a partir de etanol e soluções não contendo etanol mostra que as moscas exibiram uma preferência significativa pela fonte de alimento com 15% de etanol.

O experimento CAFE foi repetido com machos acasalados versus rejeitados. Ambos os grupos haviam sido previamente alojados individualmente e expostos a fêmeas que aceitavam ou rejeitavam o acasalamento. Após a introdução em grupos nos frascos de CAFE, o grupo rejeitado consumiu mais dos capilares de etanol.

Isso sugeriu que a percepção da falta de recompensa levou a um aumento no comportamento de busca de recompensa. Por outro lado, o acasalamento bem-sucedido aumenta os níveis de recompensa interna, o que, por sua vez, reduz o consumo de etanol. Ao tentar este procedimento, é importante manter um ambiente bem umidificado durante todo o experimento, com ênfase extra na parte de consumo, regando os plugues todos os dias e mantendo as extremidades capilares próximas aos plugues úmidos.