Name: Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprenda a preparar matrizes 2D de gelatina e colágeno I e plugs 3D para estudar a formação de invadosomas lineares e a degradação da matriz extracelular em células primárias e linhagens tumorais.

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O JDM foi apoiado por uma bolsa de doutorado do INSERM / Région Aquitaine e agora é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do ARC e o Tisch Cancer Institute na Mount Sinai School of Medicine. A EH é apoiada por um doutorado do Ministério da Educação Superior e da Investigação. A ZE é apoiada por uma bolsa pós-doutoral da Agência Nacional de Pesquisa (ANR). O CM é apoiado pelo Instituto de Câncer Tisch na Faculdade de Medicina Mount Sinai e JJBC é apoiado pela concessão do NIH / NCI K22CA196750, o Fundo JJR do Prêmio Científico Científico da TCI e pelo Instituto Tisch Cancer na Escola de Medicina Mount Sinai. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS é apoiado pela &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot;. VM e FS são suportados pelo financiamento da &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; e Institut National du Cancer, INCA_8036 e PLBio2012.

NOTA: Antes da fixação, todas as etapas são completadas em uma capa de fluxo laminar estéril. 1. matriz 2D NOTA: as matrizes 2D são usadas para determinar a porcentagem de células que formam invadosomes e a área de degradação da matriz por célula. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg"> Figura 1: Protocolo. Resumo do protocolo utilizado para preparar matrizes de gelatina e colágeno I. É possível fazer apenas a matriz de gelatina ou uma matriz mista de gelatina e colágeno I. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Matriz de gelatina NOTA: As matrizes de gelatina fluorescente são usadas para quantificar a degradação da matriz e a gelatina não fluorescente é usada para promover a adesão das fibras de colágeno I. Tapete de gelatina fluorescenteOs arroz são também utilizados para estudos de podosomas e invadopodias (ver Figura 1 ). <ol><li> Sob um capuz de fluxo laminar estéril, coloque um parafino (20 cm x 15 cm) na área de trabalho e desinfecte-o com etanol a 70%. </li><li> Alíquotas 20 μL de gotículas de 1 mg / mL de gelatina em uma linha, espaçadas aproximadamente a 1 cm de distância; Consulte a Figura 1 para organização de gotículas. </li><li> Cubra cada 20 μL de gotícula de gelatina com um lamínula de vidro autoclavado (12 mm de diâmetro). </li><li> Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Se a gelatina estiver fluorescente, proteja-a da luz. </li><li> Alíquotas de 40 μL de gotículas de 0,5% de glutaraldeído em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma linha, cada uma espaçada aproximadamente 1 cm abaixo da linha de lamínulas do passo 1.1.3. CUIDADO: O glutaraldeído é um agente fixador tóxico. Use luvas e não inspire. </li><li> Usando fórceps jewelled, transfira cada lamela revestida de gelatina para uma gota de glutaraldeído. AnoteÉ normal que uma pequena gota de gelatina permaneça no parafilme. Não reutilize isso para outro experimento. </li><li> Incubar durante 40 min à temperatura ambiente. Para lamínulas fluorescentes, proteja-os da luz. </li><li> Pegue uma placa de cultura de células de 24 poços e preencha cada poço com 500 μL de 1x PBS estéril. Coloque os lamínulas, com a gelatina voltada para cima, em cada poço. </li><li> Lave duas vezes em 1x PBS por 5 minutos cada. NOTA: Nesta etapa, os lamínulas podem ser usadas para experimentação ou armazenadas em 1x PBS a 4 ° C. Os lamínulas não fluorescentes podem ser armazenados por uma semana, e lâminas fluorescentes podem ser armazenadas por 48 h. </li></ol></li><li> Matriz de tipo I do colágeno fibrilante NOTA: A matriz de colágeno tipo I de fibrilação é utilizada para estudar a formação de invadosoma linear e a degradação da matriz associada. Uma combinação de colágeno fluorescente I e lâminas de gelatina não fluorescentes é usada para colocar os marcadores invadossais com fibras de colágeno ( por exemplo, F-actina iN o canal distante, o colágeno I no canal vermelho, o Tks5 no canal verde e o tintura Hoechst para uma mancha nuclear). Por outro lado, uma combinação de colágeno não fluorescente I com lâminas de gelatina não fluorescentes é usada para maximizar o número de marcadores de invadosoma corados ( por exemplo, F-actina no canal vermelho distante, cortactina no canal vermelho, Tks5 em O canal verde e tintura Hoechst para uma mancha nuclear). Finalmente, uma combinação de colágeno não fluorescente I com lâminas de gelatina fluorescentes é usada para quantificar a degradação associada à gelatina ( por exemplo, F-actina no canal vermelho distante, Tks5 no canal vermelho, no canal verde e tintura Hoechst Para uma mancha nuclear) (ver Figura 1). O tinte Hoechst é usado para manchar o núcleo, e também verifica a contaminação por micoplasma, além de um teste de PCR feito regularmente nas linhas celulares utilizadas. <ol><li> Colágeno fluorescente I <ol><li> Use colágeno comercial que extrai do tendão do rato-cauda em 0,02 N de ácido acéticoD. Retirar a quantidade de colágeno necessário para preparar 500 μL de solução por lamínula a uma concentração final de 0,4 mg / mL de colágeno I. </li><li> Adicionar éster succinimidílico de 5-carboxi x rodamina a uma concentração final de 10 μg / mL, calculado para o volume final da solução de colagénio I (nx 500 μL). </li><li> Misturar a solução pipetando para cima e para baixo e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Diluir para o volume final com 1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) contendo cálcio e magnésio, e usar diretamente. </li></ol></li><li> Cobertura do colágeno Fibrilar I <ol><li> Use os lâminas de gelatina não fluorescentes ou fluorescentes previamente preparadas no passo 1.1. </li><li> Prepare uma solução de colágeno fluorescente ou não fluorescente I em uma concentração final de 0,4 mg / mL em DPB 1X contendo cálcio e magnésio. </li><li> Adicionar 500 μL de solução de colágeno I fluorescente ou não fluorescente porLamínula em uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Incubar durante 4 h a 37 ° C para a polimerização de colágeno I. </li><li> Após a incubação, remova o excesso de colágeno I inclinando a placa e pipetando no lado do poço (não diretamente na lamínula) para evitar danificar a matriz. NOTA: Esta matriz não pode ser armazenada. Semeie as células imediatamente após remover o excesso de colágeno I. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Semeadura de células, tempo de cultura e fixação <ol><li> Dependendo do tipo de célula, prepare as células no meio de cultura apropriado e adicione células para um volume final de 500 μL por poço. </li><li> Para caracterizar a capacidade de uma linha celular para formar invadossomas lineares e para degradar a matriz, prenda as células por 4 h, 12 h e 24 h na matriz de colágeno I para determinar a cinética da formação de invadosoma linear e a atividade de degradação associada. NOTA: A Tabela 1 contém exemplos de linhas celularesTestado em laboratório. <table border="1"><tbody><tr><td> Linha celular </td><td> Número de células por capa </td><td> Tempo de contato com a matriz para quantificação de invadosoma linear </td><td> Tempo de contato com a matriz para quantificação da atividade de degradação do invadosoma linear </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> HUH7 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> SNU 398 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> NIH 3T3, src </td><td> 30.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50,000 </td><td> 6 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h &amp;# 160; </td></tr><tr><td> CRU </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Referência de semeadura celular e tempo de incubação. Esta tabela apresenta uma lista não exaustiva de linhas celulares usadas para estudar invadossomas lineares. Indica o número de células para semente na matriz, o tempo necessário para observar invadossomas lineares e o tempo necessário para observar a degradação da matriz associada. Os invadosomes lineares têm uma vida curta. Para poder observar invadossomas lineares no número máximo de células, as células devem estar em contato com a matriz de colágeno I por um curto período de tempo. Por outro lado, para poder visualizar a degradação de gelatina relatada, as células devem estar em contato com a matriz de colágeno I por um período de tempo maior que os listados acima. </li><li> Após a remoção do meio de cultura de células,Conserte os lamínulas durante 10 minutos em 500 μL de paraformaldeído a 4% em PBS 1X. </li><li> Lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Armazenar a 4 ° C, protegido da luz. </li></ol> 3. Imunofluorescência <ol><li> Permeabilize as células por 10 min com uma solução fresca. De Triton X-100 a 0,2% em 1x PBS. Não reutilize esta solução. </li><li> Lave os lamínulas duas vezes com 1x PBS. </li><li> Coloque um parafino (20 cm x 15 cm) no banco. </li><li> Diluir o anticorpo primário em 4% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x PBS, conforme descrito na Tabela de Materiais . </li><li> Alíquotas de 50 μL de gotículas de solução de anticorpo primário em uma linha, cada uma espaçada aproximadamente a 1 cm de distância. </li><li> Coloque cada lamínula sobre uma gota. </li><li> Incube durante 40 min à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Após o período de incubação, lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Diluir o anticorpo secundário, faloidina e tintura Hoechst em 4% BSA em 1xPBS. </li><li> Alíquotas de 50 μL de gotículas da mistura, cada uma espaçada aproximadamente 1 cm abaixo da primeira linha de lamínulas, conforme feito anteriormente. </li><li> Coloque cada lamínula sobre uma gota. </li><li> Incube durante 30 min à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Após a incubação, lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Lave uma vez com água destilada para remover os sais. </li><li> Monte os lamínulas em uma lâmina de vidro com meio de montagem de polimerização. </li><li> Deixe os cobertores secar durante a noite à temperatura ambiente, protegidos da luz, antes da microscopia. </li></ol> 4. Quantificações <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg"> Figura 2: Quantificação do invadosoma linear. A macro requer imagens confocadas de F-actina e coloração Tks5 (formato: 1.024 x 1.024). ( A ) Primeiro, abra a imagem F-actina e faça uma máscara. ( B ) Então, abraA imagem Tks5 e limita-a. Aplique a macro. ( C ) Os resultados analisados ​​aparecerão em duas tabelas. O número de invadosomes lineares por célula e outras informações, como a área de porcentagem usada por invadoss linux na célula, estará na tabela Resumo. O tamanho de cada invadosoma linear será na tabela de resultados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Porcentagem de células que formam invadossomas lineares <ol><li> Contar as células que formam invadossomas lineares, aproximadamente 100 células por lamelas (use triplicados técnicos). Quantifique pelo menos 300 células por n, com n = 3. </li><li> Calcule a porcentagem de células que formam invadossomas lineares, tomando a média de três experiências independentes, resultando em 900 células quantificadas. </li></ol></li><li> Tamanho e número de invadosome linear de células </li><li> Use ImageJ com a macro suplementar. </li></ol><li> Degradação por célula <ol><li> Use três lamínulas por condição. </li><li> Pegue 30 imagens por lamínula de gelatina fluorescente e núcleos manchados com Hoechst. </li><li> Use o software ImageJ como descrito em Martin KH et al. 9 . </li></ol></li> 5. Ensaio de invasão de colágeno 3D <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg"> Figura 3: esquema de ensaio de invasão. Resumo do protocolo de ensaio de invasão. O colágeno I é reticulado com corante de éster succinimidílico e polimerizado durante 1 h a 37 ° C. As células são adicionadas em meio isento de soro em cima do plugue de colágeno I. A inserção é colocada em média wi10% FBS. Os tampões de colágeno I são fixados 1 h após a semeadura celular no controle e 3 dias após a semeadura celular na condição experimental para determinar a capacidade de invasão das células. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Preparação de plugue de colágeno e eu <ol><li> Faça um curso de tempo de 4 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h para o primeiro experimento para determinar a cinética de invasão no gel de acordo com o tipo de célula. Para cada experiência, adicione um ponto de tempo de 1 h como um ponto de tempo de referência quando não ocorre uma invasão. </li><li> Prepare a solução de colágeno I no gelo sob uma capa de fluxo laminar estéril. Prepare 500 μL de solução para 3 inserções de câmara Boyden. </li><li> Aspirar 1 mg de colágeno comercial de rato-cauda I para preparar uma solução com uma concentração final de 2 mg / mL de colágeno I. </li><li> Adicionar 5-carboxi x éster succinimidílico de Rhodamine aUma concentração final de 1 μg / mL, calculada para o volume final da solução de colágeno I (neste caso, 500 μL). </li><li> Misture bem e incube durante 5 minutos no gelo sob o capô de fluxo laminar estéril, protegido da luz. </li><li> Adicionar 50 μL de PBS 10X arrefecido com gelo e 6,25 μL de hidróxido de sódio 1 M gelado (NaOH). </li><li> Adicione água estéril de acordo com a fórmula 443.75 - x μL de colágeno I. </li><li> Adicione 100 μL de solução por inserção da câmara de Boyden. </li><li> Incubar durante 1 h a 37 ° C para permitir a polimerização. </li><li> Adicionar meio de cultura celular enriquecido com soro fetal bovino (FBS) em novos poços; Coloque inserções nesses poços. </li><li> Semeiam 30 mil células em cima do colágeno que eu conto em meio sem FBS. </li><li> Após a cultura das células a 37 ° C, coloque o tampão de colagénio I durante 30 minutos em paraformaldeído a 4% em 1x PBS. </li><li> Imunofluorescência completa como no passo 3, com exceção das seguintes etapas: permeabilidadeZe com 0,2% de Triton X-100 em 1x PBS durante 30 min, não 10 min; Incubar com soluções de anticorpos primários e secundários por 1,5 h cada, em vez de 40 min e 30 min, respectivamente. Mancha para F-actina ou núcleos para localizar as células. </li><li> Após imunofluorescência, use um bisturi para cortar a membrana da inserção e transferir cuidadosamente o plugue de colágeno I para um prato de fundo de vidro. Certifique-se de que a parte superior do plugue de colágeno I esteja em contato com o vidro. Mantenha a membrana de inserção ligada ao fundo do plugue de colágeno I para manter a integridade do plugue. NOTA: O plugue de colágeno I permanece intacto no prato de fundo de vidro. A profundidade entre o fundo de vidro eo plástico que circunda o fundo de vidro é equivalente à espessura do bujão. </li><li> Coloque um lamínula no plugue de colágeno I e monte com o meio de montagem de polimerização para evitar que o plugue seque. </li><li> Use um microscópio confocal invertido para projetar o plugue de colágeno I; O topo deO plugue está em contato com o fundo de vidro do prato. <ol><li> Adquira uma pilha z da parte superior para a parte inferior do plugue de colágeno I para visualizar a invasão celular. Determine a espessura da pilha z ao examinar quão profundamente as células invadem o campo de imagem. Execute aquisições com um objetivo de óleo 40X em um formato de 512 x 512 com um tamanho de passo z de 0,25 μm. NOTA: Para referência, a pilha média de células MDA-MB-231 3 dias após a semeadura é de 30 μm. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Classicamente, os invadosomas são estudados in vitro , independentemente do microambiente e da matriz em que as células são banhadas. São atualmente utilizados vários tipos de matrizes, incluindo gelatina, fibronectina, vitronectina ou colágeno fibrilar de alta densidade (HDFC) 7 , 11 ; No entanto, muitas vezes não são representativas do microambiente em que as células residem e não são fisiologicamente relevantes. Aqui, foi utilizado um novo tipo de ma...

A remodelação da matriz extracelular (ECM) ocorre durante processos fisiológicos e patológicos, como angiogênese e invasão de células tumorais. Em condições fisiológicas, muitos tipos de células, principalmente da linhagem hematopoiética, são capazes de degradar elementos ECM. Por exemplo, os macrófagos são capazes de atravessar barreiras anatômicas para atingir os tecidos e osteoclastos degradam a matriz óssea para garantir a homeostase do cálcio. Mais globalmente, todas as matrizes do corpo se renovam para manter suas propriedades físicas e químicas. Nos tecidos do câncer, a composição do microambiente do tumor é alterada. Por exemplo, no câncer de mama e câncer de pulmão, o colágeno de tipo I é sobre-expressado e se acumula em torno do tumor. Além disso, essa acumulação está associada a um risco aumentado de desenvolver metástases 1 , 2 . A metástase do câncer depende da capacidade das células cancerosas para degradar o ECM e invadir os tecidos adjacentes. oA atividade invasiva das células é atribuída a estruturas especializadas em ricas em actinas conhecidas como invadosomes. Este termo inclui podossomas e invadopodia, que estão presentes, respectivamente, em células normais e cancerígenas ( por exemplo, macrófagos, células endoteliais e células cancerosas, como a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231). In vitro , os invadosomes podem se organizar em diferentes formas: pontos, agregados ou rosetas 3 . Classicamente, os invadosomes são compostos de um núcleo de F-actina contendo várias proteínas, como a proteína de andaimes Tks5 e cortactina, cercada por moléculas de placa de adesão, como integrinas e vinculina 4 . Recentemente, mostrou-se que a TK5 e a RhoGTPase Cdc42 podem ser usadas como uma assinatura molecular mínima para invadosomas funcionais 5 . Essas estruturas são capazes de degradar o ECM através do recrutamento e ativação de proteínas de metaloprotease específicas, como MT1-MMP e MMP-2 6. Em um estudo anterior, relatamos que a interação entre as fibrilas de colágeno tipo I e o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1), um receptor específico de fibrilas de colágeno tipo I, leva à formação de uma nova classe de invadossomas, denominados invadossomas lineares. Os invadosomas lineares são formados ao longo de fibrilas de colágeno tipo I 7 . Essas estruturas são capazes de degradar fibrilas de colágeno tipo I através do recrutamento e ativação de MT1-MMP / MMP2. Além disso, sua formação depende da Tks5 e Cdc42 5 . In vitro , demonstramos a existência de invadossomas lineares eo envolvimento de DDR1 na sua formação e atividade 8 usando diferentes estratégias consistindo em uma combinação de vários elementos da matriz, incluindo: i) lamínulas fluorescentes revestidas com gelatina, ii) fibrilação de colágeno tipo I fluorescente Lamelas revestidas e iii) tampas de colágeno 3D tipo I. Devido ao uso de diferentes matrizes, pudemos estudar e caracterizarFormação de invadosoma linear e sua atividade de degradação 7 , 8 . Finalmente, para compreender melhor a biologia das células invasivas, utilizou-se uma combinação de componentes de ECM nos sistemas de cultura 2D e 3D, imitando a complexidade da composição do microambiente do tumor. Abaixo estão protocolos para revestimento de lamínulas com colágeno de gelatina / tipo I em sistemas de cultura 2D e 3D.

<table><tbody><tr><td>Solução de gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Estoque 20 mg/ml usado a 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatina de pele de porco Oregon green 488 conjugado</td><td>Tecnologias de vida de sonda molecular</td><td>G13186</td><td>5mg diluído a 1 mg/ml em água estéril</td></tr><tr><td>Óculos de cobertura para microscópio</td><td>Marlenfeld GmbH & Co</td><td>111520</td><td>&Oslash; 12mm No.1</td></tr><tr><td>2.5% Glutaraldeído em tampão de cacodilato de sódio 0.1M pH 7.4</td><td>Ciência da microscopia eletrônica</td><td>15960</td><td>Diluir a 0.5% em água estéril</td></tr><tr><td>1x PBS pH 7.4</td><td>Gibco da life technologies</td><td>10010-015</td><td>Use este PBS em todas as etapas antes da fixação</td></tr><tr><td>Colágeno I Cauda de rato</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>5 carboxi X rhodamin siccinimidyl ester</td> Life <td>technologies</td><td>C-6125</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x + cálcio + magnésio</td><td>Gibco da life technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16% solução</td><td>Microscopia eletrônica</td><td>ciência 15710</td><td>Diluir a 4% em 1X PBS</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10x tampão PBS pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>Diluir a 1X em água Usar em etapas após a fixação</td></tr><tr><td>Anticorpo</td> <td>Tks5Santa Cruz</td><td>sc-30122</td><td>Marcadores de invadossomo Diluição: 1/100</td></tr><tr><td>Anticorpo Cortactin 4F11</td><td>Millipore</td><td>5180</td><td>Marcadores de invadossomo Diluição: 1/100</td></tr><tr><td>Anticorpo DDR1</td><td>Sinalização celular</td><td>5583</td><td>Receptor linear de invadossomo</td></tr><tr><td>Diluição: 1/100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faloidina FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FT-AZ0330</td><td>Marcador de actina fibrilar Diluição :1/200</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>33258</td><td>Marcador de núcleo Diluição :1/200</td></tr><tr><td>Anticorpos secundários FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FP-488 FP-547H ou FP-647H</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Diluir a 4% em 1X</td></tr><tr><td>PBS Fluoromount G meio de montagem</td><td>Interchim</td><td>FP 483331</td><td></td></tr><tr><td>software ImageJ</td><td>Domínio</td><td></td> <td>públicohttp://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td></tr> <tr><td>Inserção de cultura de células</td><td>Corning</td><td>353097</td><td>8.0&micro; m tamanho do poro / 24 poços</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr></tbody></table>

matrizes 2d e 3d para estudar formação e atividade de invadosome linear

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

A adesão celular, a migração e a invasão estão envolvidas em muitos processos fisiológicos e patológicos. Por exemplo, durante a formação de metástases, as células tumorais devem atravessar barreiras anatômicas para invadir e migrar através do tecido circundante, a fim de atingir o sangue ou vasos linfáticos. Isso requer a interação entre células e a matriz extracelular (ECM). No nível celular, muitas células, incluindo a maioria das células cancerosas, são capazes de formar invadosomes, que são estruturas baseadas em F-actina capazes de degradar ECM. Os invadosomos são estruturas de actina protrusivas que recrutam e ativam metaloproteinases de matriz (MMPs). A composição molecular, a densidade, a organização e a rigidez do ECM são cruciais na regulação da formação e ativação do invadosoma. In vitro , um ensaio de gelatina é o ensaio padrão usado para observar e quantificar a atividade de degradação do invadosoma. No entanto, a gelatina, que é o colágeno I desnaturado, não é uma matriz fisiológica eLement. Um novo ensaio utilizando fibrilas de colágeno de tipo I foi desenvolvido e utilizado para demonstrar que esta matriz fisiológica é um potente indutor de invadossomas. Os invadosomas que se formam ao longo das fibrilas de colágeno são conhecidos como invadosses lineares devido à sua organização linear nas fibras. Além disso, a análise molecular de invadossomas lineares mostrou que o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1) é o receptor envolvido em sua formação. Esses dados demonstram claramente a importância de usar uma matriz fisiologicamente relevante para entender as complexas interações entre células e ECM.

Usando uma combinação de dois tipos de matrizes, gelatina e colágeno tipo I ( Figuras 1 e 4 ), destacamos um novo tipo de invadosoma, conhecido como invadossomas lineares. A rotulagem dessas matrizes permite a observação da formação de invadosoma linear ao longo de fibras de colágeno I e de suas capacidades de degradação ( Figura 5 ). O número de estruturas invasivas pode então ser quantificado pela macro descrita anteriormente (passo 4....

Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer.

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Nosso grupo trabalha na interação entre célula e matriz extracelular. As células podem produzir, mas também podem degradar o elemento da matriz extracelular. A degradação da matriz pode ocorrer durante processos fisiológicos, mas também patológicos, como neurodegênese e invasão de tumor celular.No nível celular, podemos notar a presença de estrutura baseada em actina envolvida na degradação da matriz. E essas estruturas são chamadas de invadossomos. Invadossomo, é um termo geral que inclui podossomos em células normais e invadopódios em células cancerígenas.A degradação deste invadossomo pode ser auto-organizada em diferentes formas, pontos, agregados e rosetas. E a atividade desse invadossomo é impulsionada por metaloproteinases, como MMP2 e MT1-MMP. Não é há muito tempo que o casal, MMP2, MT1-MMP é ativado pelas fibrilas de colágeno tipo 1.Para estudar a atividade dos invadossomas, foi utilizado um ensaio clássico de zimografia in-situ. Mas para estudar o papel e o impacto das fibrilas de colágeno tipo 1 nos invadossomas, decidimos criar um novo ensaio. Para isso, criamos uma matriz mista composta por gelatina e fibrilas de colágeno tipo 1.Neste filme da primeira parte, Eloide Henriet mostrará como geramos esse tipo de matriz. Na segunda parte, Zakaria Ezzoukhry mostrará como podemos medir o impacto das fibrilas de colágeno tipo 1 na morfologia, formação e ativação dos invadossomas. E na última parte, Julie Di Marino mostrará como adaptamos um ensaio de invasão de colágeno 3D.Vou mostrar como preparar uma matriz mista composta de gelatina e fibrilas de colágeno tipo 1. Vou fazer dois tipos de matriz mista. Um para fazer o ensaio de zimografia in-situ com gelatina de fluoresceína e colágeno tipo 1 não fluoresceína.E outro que nos permite visualizar as fibrilas de colágeno com gelatina sem fluoresceína e fibrilas de colágeno marcadas. Para preparar a matriz de gelatina, alíquota de 20 microlitros gotículas de gelatina em um pedaço de parafilme. Cubra cada gota com uma lamínula de vidro autoclavada.Incube em temperatura ambiente por 20 minutos e proteja da luz. Para fixação de gelatina, alíquota de gotículas de 40 microlitros de 0,5% de glutaraldeído em PBS. Usando uma pinça, transfira lamínulas revestidas de gelatina para cada gota de glutaraldeído.Incube em temperatura ambiente por 40 minutos e proteja da luz. Pegue uma placa de cultura de células multipoços e encha cada poço com 500 microlitros de PBS 1X estéril. No final do período de incubação, coloque cada lamínula, com o lado da gelatina voltado para cima, em cada poço.Lave as lamínulas duas vezes em 1X PBS por cinco minutos cada. Nesta etapa, as lamínulas podem ser usadas para experimentação ou armazenadas para uso posterior. Pipete 0,4 mg por ml de colágeno em um tubo.Adicionar o corante fluorescente até obter uma concentração final de 10 microgramas por ml. Misturar a solução no tubo e incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. Dilua até o volume final com 1x DPBS e adicione 500 microlitros da solução em cima de lamínulas revestidas com gelatina em uma placa multipoços.Incube por quatro horas a 37 graus Celsius para polimerização do colágeno. Após a incubação, remova o excesso de colágeno. Adicione células para um volume final de 500 microlitros e incube as células a 37 graus Celsius antes da fixação.Este tipo de matrizes pode ser modificado com outros elementos da matriz, como fibronectina, vitronectina ou colágeno tipo IV. De minha parte, mostrarei como realizar a imunofluorescência usando Tks5, um marcador de invadossomos, e como quantificar invadossomos lineares em lamínulas revestidas de colágeno tipo 1. Podemos apresentar os resultados pelo número de células presentes nos invadossomos lineares, mas também podemos apresentar o número de estruturas em cada célula.Fixe as lamínulas por 10 minutos em 500 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS. Lave duas vezes com 1x PBS e permeabilize as células com 0,2% Triton X-100 em 1x PBS por 10 minutos. Alíquota de gotículas de 50 microlitros de solução de anticorpo primário em 4% BSA em 1x PBS em um pedaço de parafilme.Coloque cada lamínula em uma gota. Incubar durante 40 minutos à temperatura ambiente e protegido da luz. Lave as lamínulas duas vezes com 1x PBS e incube as lamínulas em anticorpo secundário, coloidina e corante Hoechst por 30 minutos protegido da luz.Após a incubação, lave duas vezes com 1x PBS, seguido de água destilada para remover os sais. Monte as lamínulas em uma lâmina de vidro com meio de montagem de polimerização. Deixe a lâmina secar durante a noite em temperatura ambiente antes de fazer a imagem.Para a análise das imagens, adquira uma imagem de actina e Tks5 sequencialmente usando um microscópio confocal. Para quantificar o tamanho e o número de invadossomos lineares por célula, use o software ImageJ e a macro fornecida. Primeiro execute a macro no ImageJ e abra a imagem de actina.Em seguida, abra a imagem Tks5. Defina o limite e aplique a macro. Os resultados analisados aparecerão em duas tabelas.O número de invadossomos lineares por célula e outras informações, como a área percentual usada pelos invadossomos lineares na célula, estarão na tabela de resumo. O tamanho de cada invadosoma linear estará na tabela de resultados. Após a quantificação das imagens, podemos apresentar os resultados mostrando o número de estruturas por célula.Então, de minha parte, adaptamos um método para demonstrar a presença de invadossomos lineares em 3D. Realizamos o gel composto apenas por colágeno uma fibrila e este ensaio é utilizado para avaliar a invasão celular no contexto colágeno um. Prepare a solução de colágeno tipo 1 em gelo a uma concentração final de dois mg por ml.Adicione o corante fluorescente a uma concentração final de um micrograma por mililitro. Misturar a solução e incubar no gelo durante cinco minutos, protegido da luz. Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS 10x gelado.Em seguida, adicione 6,25 microlitros de hidróxido de sódio molar gelado. Adicione água estéril para obter a concentração correta e misture a solução. Coloque as inserções da câmara de Boyden em uma placa de cultura de células multipoços.Adicione 100 microlitros de colágeno uma solução a cada inserção. Para polimerizar o gel de colágeno, incube o prato por uma hora a 37 graus Celsius. Adicione meio de cultura de células enriquecido com soro a cada poço e coloque as inserções no meio.Semeie 30.000 células em meio sem soro em cima do gel de colágeno. Para fixar as células, adicione solução de paraformaldeído a 4% em um poço vazio. Remova o meio celular da inserção sem tocar no gel de colágeno.Coloque a inserção em poços com a solução de paraformaldeído a 4% e adicione mais solução de paraformaldeído a 4% em cima do gel de colágeno. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a fixação, remova a solução de paraformaldeído a 4% e lave com 1x PBS.Após a lavagem, o gel de colágeno deve ficar transparente. Agora as inserções estão prontas para imunofluorescência. Primeiro drene as inserções.Em seguida, coloque as inserções em novos poços da placa multipoços. Para permeabilizar as células, adicione uma solução de 0,2% Triton X-100 em 1X PBS em cima do gel de colágeno por 30 minutos. Drene as inserções.Lave com 1X PBS e adicione solução de anticorpo primário em cima do gel de colágeno por uma hora protegido da luz. Remova a solução de anticorpo primário, lave com 1X PBS e incube o gel de colágeno com a solução de anticorpo secundário por 1,5 horas protegido da luz. Lave a solução de anticorpos secundários com 1X PBS.Para preparar o gel de colágeno para montagem, corte a membrana de inserção com um bisturi. Coloque o gel de colágeno preso à membrana em um prato com fundo de vidro. É importante que a parte superior do gel esteja em contato com o fundo do prato.Adicione mídia de montagem e uma lamínula na parte superior para observação de microscopia. Com este ensaio, demonstramos o papel fundamental do receptor DDR1 na invasão celular em um gel de colágeno. Este ensaio também pode ser usado para avaliar o efeito de drogas na invasão celular.Em nosso estudo diferente, demonstramos que apenas a adição de um novo elemento de matriz extracelular em sua confirmação fisiológica, aqui as fibrilas de colágeno tipo 1, pode modificar a morfologia, a composição molecular e a atividade dos invadossomos. Então, usando os diferentes ensaios descritos neste filme, demonstramos a existência de novas estruturas, uma nova organização do invadosoma que chamamos de invadossomas lineares. Gerando matrizes complexas e mais fisiológicas, permitimos a identificação de novas vias envolvidas na adição, migração e invasão celular.

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Research

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Bioengineering

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