Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Nosso grupo trabalha na interação entre célula e matriz extracelular. As células podem produzir, mas também podem degradar o elemento da matriz extracelular. A degradação da matriz pode ocorrer durante processos fisiológicos, mas também patológicos, como neurodegênese e invasão de tumor celular.

No nível celular, podemos notar a presença de estrutura baseada em actina envolvida na degradação da matriz. E essas estruturas são chamadas de invadossomos. Invadossomo, é um termo geral que inclui podossomos em células normais e invadopódios em células cancerígenas.

A degradação deste invadossomo pode ser auto-organizada em diferentes formas, pontos, agregados e rosetas. E a atividade desse invadossomo é impulsionada por metaloproteinases, como MMP2 e MT1-MMP. Não é há muito tempo que o casal, MMP2, MT1-MMP é ativado pelas fibrilas de colágeno tipo 1.

Para estudar a atividade dos invadossomas, foi utilizado um ensaio clássico de zimografia in-situ. Mas para estudar o papel e o impacto das fibrilas de colágeno tipo 1 nos invadossomas, decidimos criar um novo ensaio. Para isso, criamos uma matriz mista composta por gelatina e fibrilas de colágeno tipo 1.

Neste filme da primeira parte, Eloide Henriet mostrará como geramos esse tipo de matriz. Na segunda parte, Zakaria Ezzoukhry mostrará como podemos medir o impacto das fibrilas de colágeno tipo 1 na morfologia, formação e ativação dos invadossomas. E na última parte, Julie Di Marino mostrará como adaptamos um ensaio de invasão de colágeno 3D.

Vou mostrar como preparar uma matriz mista composta de gelatina e fibrilas de colágeno tipo 1. Vou fazer dois tipos de matriz mista. Um para fazer o ensaio de zimografia in-situ com gelatina de fluoresceína e colágeno tipo 1 não fluoresceína.

E outro que nos permite visualizar as fibrilas de colágeno com gelatina sem fluoresceína e fibrilas de colágeno marcadas. Para preparar a matriz de gelatina, alíquota de 20 microlitros gotículas de gelatina em um pedaço de parafilme. Cubra cada gota com uma lamínula de vidro autoclavada.

Incube em temperatura ambiente por 20 minutos e proteja da luz. Para fixação de gelatina, alíquota de gotículas de 40 microlitros de 0,5% de glutaraldeído em PBS. Usando uma pinça, transfira lamínulas revestidas de gelatina para cada gota de glutaraldeído.

Incube em temperatura ambiente por 40 minutos e proteja da luz. Pegue uma placa de cultura de células multipoços e encha cada poço com 500 microlitros de PBS 1X estéril. No final do período de incubação, coloque cada lamínula, com o lado da gelatina voltado para cima, em cada poço.

Lave as lamínulas duas vezes em 1X PBS por cinco minutos cada. Nesta etapa, as lamínulas podem ser usadas para experimentação ou armazenadas para uso posterior. Pipete 0,4 mg por ml de colágeno em um tubo.

Adicionar o corante fluorescente até obter uma concentração final de 10 microgramas por ml. Misturar a solução no tubo e incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. Dilua até o volume final com 1x DPBS e adicione 500 microlitros da solução em cima de lamínulas revestidas com gelatina em uma placa multipoços.

Incube por quatro horas a 37 graus Celsius para polimerização do colágeno. Após a incubação, remova o excesso de colágeno. Adicione células para um volume final de 500 microlitros e incube as células a 37 graus Celsius antes da fixação.

Este tipo de matrizes pode ser modificado com outros elementos da matriz, como fibronectina, vitronectina ou colágeno tipo IV. De minha parte, mostrarei como realizar a imunofluorescência usando Tks5, um marcador de invadossomos, e como quantificar invadossomos lineares em lamínulas revestidas de colágeno tipo 1. Podemos apresentar os resultados pelo número de células presentes nos invadossomos lineares, mas também podemos apresentar o número de estruturas em cada célula.

Fixe as lamínulas por 10 minutos em 500 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS. Lave duas vezes com 1x PBS e permeabilize as células com 0,2% Triton X-100 em 1x PBS por 10 minutos. Alíquota de gotículas de 50 microlitros de solução de anticorpo primário em 4% BSA em 1x PBS em um pedaço de parafilme.

Coloque cada lamínula em uma gota. Incubar durante 40 minutos à temperatura ambiente e protegido da luz. Lave as lamínulas duas vezes com 1x PBS e incube as lamínulas em anticorpo secundário, coloidina e corante Hoechst por 30 minutos protegido da luz.

Após a incubação, lave duas vezes com 1x PBS, seguido de água destilada para remover os sais. Monte as lamínulas em uma lâmina de vidro com meio de montagem de polimerização. Deixe a lâmina secar durante a noite em temperatura ambiente antes de fazer a imagem.

Para a análise das imagens, adquira uma imagem de actina e Tks5 sequencialmente usando um microscópio confocal. Para quantificar o tamanho e o número de invadossomos lineares por célula, use o software ImageJ e a macro fornecida. Primeiro execute a macro no ImageJ e abra a imagem de actina.

Em seguida, abra a imagem Tks5. Defina o limite e aplique a macro. Os resultados analisados aparecerão em duas tabelas.

O número de invadossomos lineares por célula e outras informações, como a área percentual usada pelos invadossomos lineares na célula, estarão na tabela de resumo. O tamanho de cada invadosoma linear estará na tabela de resultados. Após a quantificação das imagens, podemos apresentar os resultados mostrando o número de estruturas por célula.

Então, de minha parte, adaptamos um método para demonstrar a presença de invadossomos lineares em 3D. Realizamos o gel composto apenas por colágeno uma fibrila e este ensaio é utilizado para avaliar a invasão celular no contexto colágeno um. Prepare a solução de colágeno tipo 1 em gelo a uma concentração final de dois mg por ml.

Adicione o corante fluorescente a uma concentração final de um micrograma por mililitro. Misturar a solução e incubar no gelo durante cinco minutos, protegido da luz. Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS 10x gelado.

Em seguida, adicione 6,25 microlitros de hidróxido de sódio molar gelado. Adicione água estéril para obter a concentração correta e misture a solução. Coloque as inserções da câmara de Boyden em uma placa de cultura de células multipoços.

Adicione 100 microlitros de colágeno uma solução a cada inserção. Para polimerizar o gel de colágeno, incube o prato por uma hora a 37 graus Celsius. Adicione meio de cultura de células enriquecido com soro a cada poço e coloque as inserções no meio.

Semeie 30.000 células em meio sem soro em cima do gel de colágeno. Para fixar as células, adicione solução de paraformaldeído a 4% em um poço vazio. Remova o meio celular da inserção sem tocar no gel de colágeno.

Coloque a inserção em poços com a solução de paraformaldeído a 4% e adicione mais solução de paraformaldeído a 4% em cima do gel de colágeno. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a fixação, remova a solução de paraformaldeído a 4% e lave com 1x PBS.

Após a lavagem, o gel de colágeno deve ficar transparente. Agora as inserções estão prontas para imunofluorescência. Primeiro drene as inserções.

Em seguida, coloque as inserções em novos poços da placa multipoços. Para permeabilizar as células, adicione uma solução de 0,2% Triton X-100 em 1X PBS em cima do gel de colágeno por 30 minutos. Drene as inserções.

Lave com 1X PBS e adicione solução de anticorpo primário em cima do gel de colágeno por uma hora protegido da luz. Remova a solução de anticorpo primário, lave com 1X PBS e incube o gel de colágeno com a solução de anticorpo secundário por 1,5 horas protegido da luz. Lave a solução de anticorpos secundários com 1X PBS.

Para preparar o gel de colágeno para montagem, corte a membrana de inserção com um bisturi. Coloque o gel de colágeno preso à membrana em um prato com fundo de vidro. É importante que a parte superior do gel esteja em contato com o fundo do prato.

Adicione mídia de montagem e uma lamínula na parte superior para observação de microscopia. Com este ensaio, demonstramos o papel fundamental do receptor DDR1 na invasão celular em um gel de colágeno. Este ensaio também pode ser usado para avaliar o efeito de drogas na invasão celular.

Em nosso estudo diferente, demonstramos que apenas a adição de um novo elemento de matriz extracelular em sua confirmação fisiológica, aqui as fibrilas de colágeno tipo 1, pode modificar a morfologia, a composição molecular e a atividade dos invadossomos. Então, usando os diferentes ensaios descritos neste filme, demonstramos a existência de novas estruturas, uma nova organização do invadosoma que chamamos de invadossomas lineares. Gerando matrizes complexas e mais fisiológicas, permitimos a identificação de novas vias envolvidas na adição, migração e invasão celular.