Um protocolo otimizado para analisar glicólise e respiração mitocondrial nos linfócitos

O objetivo geral deste procedimento é medir com precisão a glicólise e a respiração mitocondrial em linfócitos utilizando um ensaio de fluxo extracelular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunometabolismo, como quais alterações metabólicas ocorrem em células imunes após ativação, diferenciação ou durante doenças. A principal vantagem desta técnica é que permite a análise eficiente e em tempo real dos perfis metabólicos de mais de 90 amostras simultaneamente.

Embora este método possa fornecer informações sobre o metabolismo de linfócitos, ele também pode ser aplicado a outras células, incluindo células não aderentes que exigem a adição de placa com mínima perturbação de sua funcionalidade. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os linfócitos são frágeis e requerem manipulação cuidadosa para manter sua funcionalidade e viabilidade. No dia anterior ao experimento, remova a cartela de sensores do analisador de fluxo extracelular e preencha cada poço da placa de utilidade com 200 microlitros de solução calibradora.

Em seguida, posicione o cartucho sobre a placa, submergindo os sensores na solução calibradora, e incube o cartucho durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius, sem dióxido de carbono ou nitrogênio. Na manhã seguinte, recubra cada poço de uma placa de ensaio de 96 poços com 25 microlitros de solução adesiva e incube a placa à temperatura ambiente por 20 minutos. Ao final da incubação, aspire a solução adesiva e lave cada poço duas vezes com 200 microlitros de água estéril.

Enquanto a placa está secando ao ar, coloque um filtro de células de 70 micrômetros sobre um tubo cônico de 50 mililitros e transfira os órgãos coletados para o filtro. Usando o êmbolo de uma seringa estéril de três mililitros, macere o tecido através do filtro, mantendo o filtro e os órgãos úmidos durante todo o processo de maceração mediante a adição de tampão MS conforme necessário. Em seguida, lave o filtro com cinco a 10 mililitros de tampão MS, seguido pela centrifugação da suspensão celular resultante.

Resuspenda o pellet em cinco mililitros de tampão de lise de hemácias ACK. Após cinco minutos em gelo, restabeleça a tenacidade com 10 a 20 mililitros de tampão MS e centrifugue as células novamente. Ao final da centrifugação, coloque um filtro celular de 30 micrômetros sobre um tubo cônico de 15 mililitros e pré-lave o filtro com um mililitro de tampão MS.

Resuspenda as células em cinco mililitros de tampão MS fresco e filtre a suspensão celular através do filtro para remover os agregados de hemácias lisadas. Adicione quatro mililitros de tampão MS fresco para lavar o tubo de lise vazio e passe a lavagem pelo filtro. Conte as células e alíquota um número apropriado de esplenócitos para o ensaio de fluxo extracelular.

Em seguida, pelletize ambos os conjuntos de células, ressuspendendo a amostra de esplenócitos para o ensaio de fluxo extracelular em cinco mililitros de meio RF 10 em gelo. Ressuspenda as células para isolamento com microesferas nos volumes apropriados de coquetel de anticorpos biotinilados, microesferas anti-biotina e tampão MS pelos tempos de incubação indicados a dois a oito graus Celsius. Ao final da segunda incubação, colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão MS fresco por um vezes 10 à oitava potência de células.

Em seguida, coloque a coluna apropriada no ímã de separação e prepare a coluna com três mililitros de tampão MS, descartando o fluxo inicial. Posicione um tubo cônico estéril de 15 mililitros sob a coluna e aplique na coluna todo o volume da amostra celular. Depois, lave o tubo de incubação celular com três mililitros de tampão MS fresco, coletando a lavagem no tubo cônico.

Após a coleta do último eluato, complete o tubo até um volume final de 15 mililitros de tampão MS e centrifugue as células isoladas negativamente. Em seguida, re-suspenda o pellet em cinco mililitros de meio RF 10 fresco em gelo. Não mais do que três horas após o isolamento, centrifugue todas as amostras celulares e re-suspenda os pellets em cinco mililitros do meio apropriado para o ensaio para uma nova centrifugação.

Após a segunda centrifugação, re-suspenda os pellets na concentração experimental apropriada para obter um volume final de 180 microlitros de células por poço em meio de ensaio fresco e plaque 180 microlitros de células em cada poço da placa. Incube as células a 37 graus Celsius por 25 minutos. Em seguida, centrifugue a placa para aderir firmemente as células ao fundo dos poços e retorne a placa ao incubador.

Após 30 minutos, utilize uma micropipeta para carregar os compostos de interesse recém-preparados a 37 graus Celsius nos orifícios injetores apropriados da cartuca de sensores do analisador de fluxo extracelular, carregando os orifícios de controle de fundo e não experimentais com meio somente. Retorne a cartuca carregada para o incubador e configure o programa do ensaio de fluxo extracelular. Em seguida, carregue a cartuca e inicie o programa, substituindo a placa de calibração pela placa de ensaio após a calibração, conforme solicitado.

Após o ensaio de fluxo extracelular, prossiga com as medições do conteúdo proteico. Mais de 90% de todas as populações celulares são viáveis, com pureza de 98 a 99% observada para os linfócitos. A confluência de cada tipo celular correlaciona-se com as densidades iniciais de semeadura.

As concentrações de proteína do lisado apresentam correlação linear com as densidades de plaqueamento, confirmando que as concentrações de proteína podem ser usadas para normalizar com precisão os dados de fluxo extracelular. Números maiores de células correlacionam-se com taxas medidas de consumo de oxigênio mais elevadas, bem como com respostas mais acentuadas aos inibidores mitocondriais. Densidades de plaqueamento mais altas resultam em medidas semelhantes da taxa de consumo de oxigênio normalizada em linfócitos T e esplenócitos, enquanto cinco e 1,25 vezes 10 à quinta células por poço resultam em medidas semelhantes da taxa de consumo de oxigênio normalizada em células B.

Os parâmetros da respiração mitocondrial também apresentam correlação linear com as densidades de plaqueamento. Além disso, o baixo vazamento de prótons indica que a maior parte da respiração basal é utilizada para a síntese de ATP. Densidades de plaqueamento mais altas resultam em taxas de acidificação extracelular mais elevadas e em respostas maiores aos inibidores mitocondriais.

Os parâmetros da glicólise correlacionam-se linearmente com as densidades de semeadura celular, sendo a alta densidade de semeadura determinada como a mais adequada para um ensaio de estresse glicolítico bem-sucedido. A glicose estimula ligeiramente a respiração mitocondrial, a qual é inibida pela oligomicina, enquanto o 2-DG não afeta significativamente o consumo de oxigênio. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em seis a oito horas, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as células em gelo antes da análise de fluxo extracelular e de contar e semear as células com precisão. Após este procedimento, outros métodos, como a medição do potencial mitocondrial e da captação de glicose, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o estado metabólico das células. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar linfócitos e realizar um ensaio de fluxo extracelular.