Name: Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar células estaminais neurais adultas da zona subcalosa em ratos. Este método simples e preciso utiliza sistemas de cultura não aderente e aderente para expandir as células.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa do Cérebro através da National Research Foundation (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro da Coreia (Grants NRF-2015M3C7A1028790); e por uma doação do Korea Health Technology P&D Project através do Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar, República da Coreia (HI14C3347).

1. Preparação de Materiais e Meio de Cultura <ol><li> Para a dissecção e dissociação do SCZ, enrole a matriz cérebro, lâmina de dois gumes lâmina de barbear, e uma pinça com papel alumínio e, em seguida, esterilizá-los por autoclavagem. </li><li> Prepare 50 ml de tampão PBS fria para lavar todo o cérebro do rato. </li><li> Defina-se um microscópio de dissecção e preparar os instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecção do cérebro (tesouras e pinças) e autoclavados o isolamento do SCZ (seringa de 1 ml, 30 agulha G, matriz cérebro, e uma pinça fina). </li><li> Preparação de N2 Médio: <ol><li> Prepare F-12 / DMEM (+ L-glutamina, + bicarbonato de sódio) forma com 2% B27, 1% suplementos de N2, e 1% de Penicilina-Estreptomicina. Nota: O meio de crescimento consiste em factores de crescimento médias e N2 (ml de factor de crescimento epidérmico purificada (EGF) e 20 ng / factor de 20 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico (bFGF2)). </li></ol></li><li> Preparar um tampão de digestão (40 unidades / ml papaína, 2,4 unidades / ml dispase II, e 2% de penicilina-estreptomicina, em PBS) para a digestão de tecido. </li><li> Preparação da placa de revestimento e Lamela: <ol><li> Prepare a poli-L-ornitina (PLO; 0,01%) e laminina (10 ug / mL dissolvidos em dH2O). Para revestir placas de 6 poços para a manutenção de SCZ-aNSCs como uma monocamada ou lamelas 18 mm para a imunocoloração, incubar-los com PLO durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH 2 O. Permitir que as placas e lamelas para secar após a última lavagem. </li><li> Em seguida, incubar as placas com laminina durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH 2 O. Cuidado: Não seque a laminina, o que afetará a fixação das células. Nota: As soluções de revestimento podem ser reutilizados 3 vezes. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento e dissociação do SCZ Adulto <ol><li> Antes da preparação cultura, colocar a matriz cérebro e lâmina de dois gumes no gelo. Nota: Não congelar a matriz cérebro, porque o brain poderia anexar a ele. </li><li> Sacrificar um rato (8 semanas de idade) por asfixia com CO2 ou deslocamento cervical. <ol><li> Cortar a cabeça com uma tesoura afiada após a pulverização de 70% de etanol. Para imobilizar a cabeça, segure ambos os lados da cabeça com força. Cortar a pele com uma tesoura na linha média em sentido caudal-rostral. Isto promove a remoção completa da pele do crânio. </li><li> Remova a parte caudal do crânio (posterior ao lambda) em primeiro lugar e, em seguida, inserir a pinça entre o crânio eo cérebro na posição dorsal na linha média. Agarrar o osso parietal esquerda (ou direita) e descasque-o cuidadosamente para fora. Repetir este procedimento para a remoção do outro osso parietal. Nota: A desconexão de nervo óptico e remoção das meninges do cérebro tornar mais fácil para separar o cérebro do crânio. </li><li> Transferir o cérebro para tampão PBS frio (25 ml) e lave-o duas vezes para remover o excesso de sangue. </li></ol></li><li> Coloque o cérebro na matriz cérebro no gelo e make cortes coronais obter fatias grossas 1 mm. Transferir as fatias de cérebro (1 mm) contendo as regiões SCz que estão localizados na parte posterior do cérebro para um PBS frio num prato de petri de plástico de 35 mm. Cuidado: A fim de se obter um plano paralelo de secções coronais, assegurar que a fissura do cérebro é colocado na linha média do cérebro matriz; é fundamental para evitar variações desnecessários nas secções. Nota: obter fatias de cérebro em 2-3 mm posterior ao bregma; isto permite a separação do SCZ a partir do SVZ. </li><li> Sob o microscópio de dissecção com uma ampliação de baixo, micro-dissecar o SCZ da área de matéria branca do córtex e no hipocampo, com uma agulha de 30G 6,9 dobrada. Em seguida, remova as regiões do córtex acima do SCZ. Coloque a região SCZ dissecados das fatias em um prato de plástico Petri 35 mm no gelo sem PBS frio. Nota: A contaminação de regiões extra que contêm neurônios maduros podem afetar a viabilidade de aNSCs e neurosphere formação because eles sofrem morte celular em condições de cultura ANSC. </li><li> Usando um 30 G agulha torta, corte imediatamente os tecidos dissecados em pedaços pequenos. Nota: Se um tempo maior é necessário para dissecar o tecido SCZ, mergulhar os tecidos dissecados em PBS frio antes de cortar. </li><li> Re-suspender o tecido picado com 1 ml de tampão de digestão, o tecido transferir para um tubo de 15 ml contendo 2 ml de tampão de digestão, e incubar durante 30 min num banho de água a 37 ° C. Nota: Agitar o tubo a cada 10 minutos para misturar bem. </li></ol> 3. Cultura Adulto Neural Stem Cell Subcallosal Zone-derivado <ol><li> Toque o tubo suavemente para dissociar o tecido digerido, e em seguida, centrifugar o tubo a 145 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante, re-suspenso do tecido digerido com 1 mL de meio de pré-aqueceu-se N2 para lavar o tampão de digestão, e pipetar suavemente a solução de amostra no máximo 5 vezes usando uma pipeta P1000. Nota: Over-trituração com uma estreitapipeta de ponta pode diminuir a viabilidade celular e subsequente crescimento. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 145 xg durante 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, re-suspender o sedimento de células em 1 ml de meio N2. </li><li> Prepare 1 ml de meio N2 num prato não-revestido de 6 poços e adicionar 1 mL da suspensão de células para fazer um volume final de 2 ml. </li><li> Adicionar EGF (20 ng / ml) e de bFGF (20 ng / ml) em cada poço. Agite suavemente o prato de cultura de 6 poços à mão para misturar os fatores de crescimento adicionados com as células plaqueadas. Manter a placa de 6 cavidades em uma incubadora de CO 2 temperatura de 37 ° C e 5%. </li><li> Adicionar EGF (20 ng / ml) e de bFGF (20 ng / mL) a cada poço a cada dia durante 8 dias. Cada terceiro dia, adicionar 200 ul de meios de N2 para manter o volume de 2 ml aproximada do meio. </li></ol> 4. Passaging de NSC como neuroesferas e para culturas em monocamada <ol><li> Reúna os neurospheres e transferi-los para um novo tubo cônico de 15 ml. Nota: O número de neuroesferas (&gt; 50 um de diâmetro) epR bem do SCZ de um único cérebro de rato foi de 64,3 ± 7,31, o que era menos do que a do SVZ (190,5 ± 6.33) 9. </li><li> Incubar as neuroesferas com 0,5 ml de tampão de dissociação durante 5 min num banho de água a 37 ° C para dissociar as neuroesferas em células individuais. neurospheres primárias podem ser dissociados em células individuais e mantido ao longo de várias passagens como neuroesferas ou monocamada culturas. Nota: Expansão SCZ-aNSCs como uma monocamada é superior a neurospheres porque SCz-aNSCs podem ser passadas&gt; 10 vezes em um formato de cultura em monocamada, mas &lt;5 vezes em um formato de cultura neurosphere. Cuidado: EZ-aNSCs exibem agregação forte, e é difícil para dissociar-los em células individuais. Assim, o formato da cultura neuroesfera não é recomendado para a expansão de células de rotina. </li><li> Suavemente pipetar a solução amostra cima e para baixo com uma pipeta P1000 menos de 5 vezes e o tubo de centrifugação a 145 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e re-supassar as neuroesferas com 1 ml de meio N2. Nota: Mais de trituração com uma ponteira estreita pode diminuir a viabilidade celular e subsequente crescimento. </li><li> Para contar as células, fazer uma mistura 1: 1 de suspensão de células (10 uL) e a solução de azul de tripano a 0,4%, e depois contar o número de células vivas em um hematocytometer. Depois de o revestimento de uma placa de 6 poços com PLO / laminina, a chapa células a 2,5 x 10 5 culas / ml com 2 ml de meio para cada poço de N2. Nota: As mudanças na densidade celular pode afetar sua condição e potencial de diferenciação. </li><li> Manter as SCZ-aNSCs com um tratamento diário de factores de crescimento (2 ml, 20 ng / ml) durante 5 dias, e eles passagem los. </li></ol> 5. Diferenciação de Subcallosal Zona derivados de células-tronco adultas neurais <ol><li> ANSCs placa sobre uma lamela de 18 milímetros PLO / laminina-revestidas com 1 x 10 5 culas / ml em 1 ml de N2 com factores de crescimento (20 ng / ml) durante a diferenciação dos SCZ-aNSCs. </li><li> O dia seguinte,quando as células estão firmemente ligados à lamela, trocar o meio de crescimento com N2 para remover os factores de crescimento. </li><li> Após 6 dias, lavar as células diferenciadas com 1 ml de PBS para remover os restos celulares e corrigi-los para a imunocoloração. Nota: podem ser de BrdU incorporada no ADN recentemente sintetizado de células em proliferação. Portanto, se desejado, BrdU (10 ug / mL) pode ser adicionado a células vivas antes da fixação das células. </li></ol> 6. Células Estaminais Imunomarcação Adulto Neurais e diferenciado Progenitores <ol><li> Para a imunocoloração, lavar as células com PBS e corrigi-los com PFA a 4% durante 20 min à temperatura ambiente. Cuidado: PFA é altamente tóxico; evitar o contacto com a pele e os olhos. </li><li> Remova a PFA 4%, lavar as células fixas com PBS 3 vezes, e em seguida armazená-los a 4 ° Cuntil eles são necessários para a imunocoloração. </li><li> Incubam-se as células sobre a lamela com uma solução de bloqueio (3% de albumina sérica bovina e 0,1% de Triton X-100 em 1x PBS) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Prepare os anticorpos primários em solução de bloqueio fresco e incubar as amostras durante a noite a 4 ° C. <ol><li> Imunocoloração os aNSCs <ol><li> Manchar o aNSCs utilizando anticorpos anti-nestina e anticorpos anti-BrdU. Antes de fixação, adiciona-se 20 ug de BrdU para os aNSCs e incubar durante 2 h. Realizar o passo de desnaturação utilizando HCl 2 N durante 20 min a 37 ° Cbefore realizando o passo de bloqueio. </li></ol></li><li> Imunocoloração os progenitores diferenciadas: <ol><li> Utilizar anticorpos anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) anti-O4, anti-BIII-tubulina, e para marcar os progenitores diferenciadas. </li></ol></li></ol></li><li> Lavam-se as amostras com PBS 3 vezes e incuba-os com anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes (1: 500) em solução de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lavar as amostras 3 vezes com PBS. Nota: Utilize anticorpos secundários que correspondem aos anfitriões do primárioanticorpos. Hoechest33343 (1: 2000) é usado para coloração nuclear. </li><li> Adicionar solução de montagem a uma lâmina de vidro e prosseguir com a montagem. Observe e imagem da amostra sobre um microscópio confocal de múltiplos comprimentos de onda: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), e Hoechest33343 (405 nm). </li></ol>

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este documento descreve um protocolo detalhado para gerar NSCs do SCZ do rato adulto e para mantê-los para várias aplicações. Há três passos críticos para o estabelecimento do sistema in vitro cultura necessária para purificar e expandir a EZ-NSC. Em primeiro lugar, é importante para garantir que a região de SCZ é precisamente dissecados a partir de outros potenciais regiões neurogénicos (Figura 1B). Secções espessas e precisos que contêm as regiões SCz foram obtidos com uma matriz cerebral int...

NSCs têm características de auto-renovação e diferenciação de múltiplas linhagens. Para confirmar essas propriedades, um sistema de cultura de neuroesferas tem sido amplamente utilizado. O sistema de cultura de neuroesferas foi desenvolvido no início dos anos 1990 e serviu como um sistema padrão de cultura de células-tronco1. Dependendo da potência de auto-renovação, os NSCs proliferam continuamente e geram uma massa celular em uma cultura em suspensão. O número de células e o tamanho da neuroesfera são considerados intimamente associados às propriedades de proliferação dos NSCs. As culturas de monocamada também são amplamente utilizadas para a manutenção e diferenciação de NSCs. Em comparação com a cultura da neuroesfera, o sistema de cultura de monocamada proporciona melhor manutenção homogênea e expansão dos NSCs2. Esses dois sistemas de cultura bem desenvolvidos contribuíram para a caracterização de aNSCs in vitro. 
NSCs residem em diferentes regiões do cérebro, como a zona subventricular (SVZ) do ventrículo lateral e a zona subgranular (SGZ) do hipocampo3-5. A zona subcalosa (SCZ) da substância branca subcortical caudal é reconhecida como uma nova região neurogênica6-8. Recentemente, foi relatado que os SCZ-aNSCs têm potencial terapêutico no traumatismo cranioencefálico9. Em comparação com outras regiões neurogênicas, a SCZ reside ao longo da substância branca subcortical. No cérebro humano, a substância branca subcortical ocupa uma região maior do que no cérebro do camundongo10. Portanto, uma compreensão das características das SCZ-aNSCs usando um sistema de cultura in vitro é importante para promover o uso potencial dessas células para regeneração neural. A dissecção precisa da região cerebral desejada é necessária para descartar possível contaminação por regiões indesejadas contendo NSCs ativos ou quiescentes. Por exemplo, aNSCs em regiões não neurogênicas podem ser ativadas e produzir novas células neurais em cérebros lesionados ou durante a cultura in vitro 11. Para obter NSCs da SCZ, as células foram coletadas de fatias de cérebro contendo a SCZ. Em seguida, foi realizada uma microdissecção cuidadosa da região da ZCC com agulha fina. Para gerar a neuroesfera a partir da SCZ, pedaços de tecido SCZ microdissecados foram dissociados em células únicas e depois cultivados como uma suspensão na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Depois que as SCZ-aNSCs formam neuroesferas, elas também podem ser mantidas como neuroesferas ou monocamadas para expansão. Este procedimento também demonstra processos de imunomarcação com vários marcadores para a detecção de NSCs e sua progênie após sua expansão e diferenciação em uma cultura de monocamada. Aqui, um protocolo visual do sistema de cultura SCZ-aNSC é apresentado. Este protocolo contém instruções detalhadas para a microdissecção da região SCZ e para a manutenção e passagem das células.

<table><tbody><tr><td><forte>Componentes médios</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td> <td>+ L-glutamina, + Bicarbonato de sódio</td></tr><tr><td>Caneta / Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td>1x diluição</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dissociattion buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>04-942-078-001</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine pinça</td><td>WPI</td><td>555229F</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Storz</td><td>E3321-C</td><td></td></tr><tr><td>Matriz cerebral (1 mm)</td><td>RWD</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Navalha de dois gumes</td><td>DORCO</td><td>ST-300</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de 30 G</td><td>SUNGSHIM</td><td>N1300</td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte>Tubos de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>15 ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 35 mm</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>Prato de Petri</td></tr> prato <tr><td>de 100 mm</td><td>SPL</td><td>10090</td><td>Placa de Petri</td></tr><tr><td>Lamínula (18 mm)</td> <td>Deckglaser</td><td>111580</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 12 poços</td><td>SPL</td><td>32012</td><td>sem revestimento</td></tr><tr><td>Prato de 6 poços</td><td>SPL</td><td>32006</td><td>sem revestimento</td></tr><tr><td>< forte > materiais de revestimento< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>0,01%</td></tr> <tr><td>Laminina</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td><forte>Anticorpos primários&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td>camundongo (1:1.000)</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>Abcam</td><td>ab2430</td><td>coelho (1:1.000)</td></tr><tr><td>DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8066</td><td>cabra (1:500)</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>coelho (1:2.000)</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>rato (1:1.000)</td></tr><tr><td>O4</td><td>Camundongo Millipore</td><td>MAB345</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Rato (1:500)</td></tr><tr><td><forte>Anticorpos secundários</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anti-camundongo cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo 647</td><td>Jackson</td><td>715-606-150</td><td></td></tr><tr><td>anti-coelho 488</td><td>Alexa</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>anti-coelho cy3</td><td>Jackson</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-coelho 647</td><td>Jackson</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-cabra 488</td><td>Alexa</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>anti-cabra cy3</td><td>Jackson</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>anti-cabra 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato cy3</td><td>Jackson</td><td>712-166-150</td><td></td></tr><tr><td>anti-rato 647</td><td>Jackson</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore</td><td>82-100-6</td><td>3% BSA com 0,1% Triton X-100 em PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>usb</td><td>22686</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Biosesang</td><td>P2031</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest33342</td><td>Life Technology</td><td>H3570</td><td>Corante para coloração de núcleos</td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de células estaminais adultas neurais do subcallosal zona rato

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

As células-tronco neurais adultas (aNSCs) podem ser usadas para a regeneração do tecido cerebral danificado. As NSCs têm potencial para diferenciação e proliferação em três tipos de células: neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. A identificação de regiões derivadas de aNSC e a caracterização das propriedades de aNSC são críticas para o uso potencial de aNSCs e para a elucidação de seu papel na regeneração neural. A zona subcalosa (SCZ), localizada entre a substância branca e o hipocampo, foi recentemente relatada como contendo aNSCs e continuamente dando origem a neuroblastos. Uma baixa porcentagem de aNSCs da SCZ é diferenciada em neurônios; A maioria das células é diferenciada em células gliais, como oligodendrócitos e astrócitos. Sugere-se que essas células tenham um potencial terapêutico para lesão cortical traumática. Este protocolo descreve em detalhes o processo para gerar SCZ-aNSCs a partir de um cérebro de camundongo adulto. Uma matriz cerebral com intervalos de 1 mm é usada para obter as fatias coronais contendo SCZ e para dissecar com precisão a SCZ de todo o cérebro. As seções SCZ são inicialmente submetidas a uma cultura de neuroesfera. Um sistema de cultura bem desenvolvido permite a verificação de suas características e pode aumentar a pesquisa sobre NSCs. Um sistema de cultura de neuroesferas fornece uma ferramenta útil para determinar a proliferação e coletar os NSCs genuínos. Uma cultura em monocamada também é um sistema in vitro para testar a proliferação e diferenciação. Significativamente, esse sistema de cultura fornece um ambiente mais homogêneo para NSCs do que o sistema de cultura da neuroesfera. Assim, usando uma região cerebral discreta, esses sistemas de cultura serão úteis para expandir nosso conhecimento sobre aNSCs e suas aplicações para usos terapêuticos.

Definindo o sistema de cultura para aNSCs da região neurogênica desconhecido é essencial para a compreensão dessas células e para o desenvolvimento de seu potencial uso no reparo do cérebro 12. Sabe-se que as NSC em diferentes estádios de desenvolvimento ou em regiões diferentes se comportam de maneira diferente 3,4. Recentemente, foi relatado que células-derivadas SCZ exibem potenciais diferenciais para a diferenciação neuronal in vivo e in vitro,...

O estabelecimento de sistemas de cultura para a expansão de células-tronco neurais adultas (aNSCs) permite o exame e a aplicação de aNSCs para terapia. A zona subcalosa (SCZ) foi recentemente reconhecida como uma nova região formadora de neuroblastos em camundongos adultos. Aqui, são descritos métodos para o isolamento, expansão e diferenciação de SCZ-aNSCs.

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

O objetivo geral deste sistema de cultura celular neural adulta é isolar células-tronco neurais adultas da zona subcalosa e expandir as células em sistemas de cultura não aderentes e aderentes. Esta abordagem pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de células-tronco neurais adultas, como o isolamento e a culturização de células-tronco neurais a partir de pequenas lesões cerebrais, tais como a zona subcalosa. A principal vantagem desta técnica é o isolamento de células-tronco neurais adultas a partir da zona subcalosa.É simples, mas preciso. Para iniciar este procedimento, esterilize em autoclave a matriz cerebral, uma lâmina de barbear de dupla face e uma pinça. Em seguida, prepare 50 mililitros de PBS frio para lavar o cérebro do camundongo.Em seguida, monte um microscópio de dissecação e prepare os instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecação do cérebro e isolamento de SCZ. Prepare o meio DMEM F-12 com suplementos de B-27 a 2%, N-2 a 1% e penicilina-estreptomicina a 1%. Em seguida, prepare o tampão de digestão para a digestão do tecido.Em seguida, prepare a poli-L-ornitina a 0,01% e laminina. Após isso, revista seis placas pequenas para a manutenção de cél

isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from-mouse-subcallosal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve o método utilizado para o isolamento de neuroprecursors desenvolvimento do córtex de ratos embrionárias. O procedimento para a remoção de embriões do útero, dissecando o tecido cortical, e digerindo o córtex cerebral isolado é mostrado.

Cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Este protocolo video demonstra o método de ensaio neurosphere para gerar e expandir as células-tronco neurais adultas da região periventricular do mouse, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível.

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

O vídeo demonstra o processo de isolamento e cultura de células-tronco neurais da zona subcalosa do cérebro do camundongo. Envolve dissecar tecidos, dissociação enzimática e cultivá-los com fatores de diferenciação para se desenvolverem em células neurais maduras.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Neurais Adultas da Zona Subcalosa de Camundongos

Este vídeo demonstra um protocolo detalhado para isolar as paredes laterais do ventrículo do cérebro de camundongo adulto e realizar a dissociação enzimática do tecido para obter células únicas. Essas células são então submetidas a condições específicas de cultura que aumentam seletivamente a proliferação de células-tronco neurais e promovem sua diferenciação em co-culturas de oligodendrócitos e astrócitos.

Obtenção de uma cultura mista de oligodendrócitos e astrócitos a partir de células-tronco neurais de camundongos adultos

Este vídeo demonstra um método para isolar células-tronco do cerebelo pós-natal de camundongos e diferenciá-las em células neurais. As células-tronco da suspensão de células isoladas são purificadas usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos e são cultivadas para formar neuroesferas. As neuroesferas são então mantidas em um meio de diferenciação para gerar células neurais.

Isolamento de células-tronco do cerebelo pós-natal de camundongo e diferenciação em células neurais

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Aprenda a isolar e cultivar células estaminais neurais adultas da zona subcalosa em ratos. Este método simples e preciso utiliza sistemas de cultura não aderente e aderente para expandir as células.

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

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