Name: Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a induzir diferenciação condrogênica em células-tronco derivadas de tecido adiposo usando gravidade centrífuga. Este método sem citocinas promove a expressão de SOX9 para reparo de cartilagem.

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Esta pesquisa foi apoiada por uma doação do Projeto de P&D de Tecnologia de Saúde da Coreia por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria de Saúde da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar da República da Coreia (número da concessão: HI14C2116) e pelo Fundo de Pesquisa do Hospital St. Mary's de Seul, Universidade Católica da Coreia.

Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC16EAME0162) e realizada de acordo com as diretrizes do NIH. Todos os tecidos foram obtidas com consentimento informado por escrito. 1. centrífugas Gravidade carregar e Cultura Pellet <ol><li> Cultura de células e colheita <ol><li> ASC Culture (P2-P3; ver Lista de Materiais) em modificação Médio-baixo teor de glucose de Eagle da Dulbecco (DMEM-LG) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2. </li><li> Quando as células atingem a confluência de 80%, descartar o meio e lava-se as células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS). </li><li> Adicionar 1 ml de PBS contendo EDTA 1 mM e incuba-se durante 2 min a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2. </li><li> Toque da placa de cultura suavemente, adicionar 4 ml de meio fresco e transferir para as célulasum tubo de 15 mL cónico, e centrifugar as células a 250 x g durante 2 minutos à temperatura ambiente (TA). </li></ol></li><li> Carregando gravidade centrífuga <ol><li> Após centrifugação (passo 1.1.4), remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM-LG com FBS a 10%. Contar as células usando um hemocitômetro. </li><li> Por CG carga, transferir 2,5 x 10 5 células para um novo tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 2400 x g durante 15 min. </li></ol></li><li> cultura pellet <ol><li> Imediatamente após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e adicionar 500 mL de meio de diferenciação condrogénica definido (CDM, DMEM-elevado teor de glucose suplementado com FBS a 1%, com 100 nM de dexametasona, 1x MEM não essenciais solução de aminoácidos 1% ITS + Premix, 50 ug / ml de L-prolina, e 1% de penicilina / estreptomicina). Adicionar 50? G / ml de ácido L-ascórbico 2-fosfato preparada de fresco a cada mudança de meio. Como um controlo positivo, induzir differentiati condrogênicasem células não centrifugada por adição de MDL contendo 10 ng / mL de TGF-β1. </li><li> Colocar os tubos tapados frouxamente contendo os peletes numa posição de pé e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2. </li><li> Alterar o meio em dias alternados durante 3 semanas. </li></ol></li><li> cultura Micromass <ol><li> Imediatamente após a centrifugação (passo 1.2.2; 2400 × g durante 15 min), aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de MDL. </li><li> Para formar um Micromass, colocar as células ressuspensas no centro de um poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Após 2 h, adicionar cuidadosamente 1 mL de MDL para o poço, pipetando contra a parede da placa para evitar perturbar o Micromass. Como um controlo positivo, realizar uma cultura de micromassa com células não centrifugada por adição de MDL contendo 10 ng / mL de TGF-β1. </li><li> Incubar a Micromass a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2. </li><li> Alterar o ev médioery outro dia durante 3 semanas. </li></ol></li></ol> 2. Transcriptase Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) para detectar transcricional A sobre-regulação de marcadores condrogénica Diferenciação <ol><li> No dia 14, utilizar uma pipeta para transferir os peletes esferoidais para um novo tubo de 1,5 mL e lavá-las em PBS 1x. </li><li> Extrai-se a ARN total a partir dos peletes utilizando o tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio método de extracção 9. </li><li> Sintetizar ADNc a partir de 2 ug de ARN total utilizando a transcriptase reversa de acordo com o protocolo do fabricante (incubar a 42 ° C durante 1 h e, em seguida, desactivar a enzima a 70 ° C durante 5 min). </li><li> Executar PCR com primers específicos para os marcadores de diferenciação condrogênicas 10. </li></ol> 3. Coloração para detectar a sobre-expressão de condrogênica Diferenciação marcador Proteínas <ol><li> peletes de células-parafina <ol><li> No dia 21,usar uma pipeta para colher os granulados esferóides e lavá-los com PBS 1x. </li><li> Fixar os peletes esferoidais por imersão em paraformaldeído a 4% durante 24 h. Cuidado: O paraformaldeído é altamente tóxico. Evitar o contacto com os olhos, pele ou membranas mucosas. Minimizar a exposição e evitar a inalação durante a preparação. Use equipamento de proteção pessoal apropriado. </li><li> Descartar o fixador e lavar os sedimentos celulares com água desionizada (DW). </li><li> Coloque uma camada de gaze para a cassete e transferir os peletes fixos utilizando uma pipeta. Cobrir o sedimento por dobragem a gaze e fechar a tampa do estojo. </li><li> Desidratar os peletes. <ol><li> Mergulhar as pelotas em 70% de etanol (EtOH) durante 5 min à TA. </li><li> Mergulhar as pelotas em 80% de EtOH durante 5 min à TA. </li><li> Mergulhar os peletes em EtOH a 95% durante 5 min à TA. </li><li> Mergulhar os peletes em EtOH a 100% durante 5 min à TA. Repita duas vezes. </li><li> Mergulhar as pelotas em 100% de xileno durante 15 min à TA. Repita twice. </li></ol></li><li> Incorporar as pelotas de células fixadas em parafina a 56 ° C num molde; as pelotas podem ser embutidos em parafina utilizando sistemas de processamento de tecido automatizados especializados. </li><li> Cortar secções de 5 um de espessura a partir do sedimento de células embebidas em parafina utilizando um micrótomo rotativo. </li><li> Flutuar as seções em 50% EtOH e depois transferi-los para um banho de água a 50 ° C usando um slide. </li><li> Coloque as seções flutuantes em lâminas. </li></ol></li><li> Safranina O e coloração azul Alcian <ol><li> Reidratar os cortes de parafina. <ol><li> Imergir as lâminas em xileno durante 15 min. Repita duas vezes. </li><li> Imergir as lâminas em EtOH a 100% durante 5 min. Repita duas vezes. </li><li> Imergir as lâminas em 90% EtOH durante 5 min. </li><li> Imergir as lâminas em 80% EtOH durante 5 min. </li><li> Imergir as lâminas em etanol 70% para 5 min, e em seguida lavá-los em 1x PBS. </li></ol></li><li> Manchar as seções reidratadas com solução de safranina O 1% e 3% de azul Alcian para30 minutos. </li><li> Descartar a solução de coloração e enxaguar as seções com DW. </li><li> Corar as secções com solução Hematoxilina / Eosina (counterstain) durante 1 min. </li><li> Descartar a solução de coloração e enxaguar as seções com DW. </li><li> Colocar uma gota de meio de montagem sobre uma lamela após a remoção de qualquer água residual. Com cuidado, coloque o slide (celular voltado para baixo) sobre a lamela contendo o meio de montagem. </li><li> Permitir que as lâminas secar durante 2-3 h à TA. </li><li> Capturar imagens usando um microscópio de campo brilhante (microscópio vertical automatizado, 50X e 200X). </li></ol></li><li> imunofluorescência <ol><li> Reidratar as seções como descrito no ponto 3.2.1. </li><li> Mergulhar as lâminas em tampão de citrato de sódio (citrato de sódio 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) e, em seguida, mantê-los a uma temperatura sub-ebulição durante 10 min, utilizando um microondas. </li><li> Arrefecer as lâminas durante 20 minutos a TA e, em seguida, lavá-las com água da torneira. </li><li> Incubar as lâminas em 3%H 2 O 2 (em 1x PBS) durante 15 min, e em seguida, lavá-las com água da torneira durante 15 min, 11. </li><li> Bloquear as lâminas com tampão (soro de cabra normal a 10% em PBS) de bloqueio, durante 1 h. </li><li> Aspirar a solução de bloqueio, e, em seguida, aplicar um anticorpo primário diluído com soro de cabra normal a 5% para as lâminas. </li><li> Incubar as lâminas durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 minutos cada. </li><li> Incubar as lâminas em anticorpo secundário conjugado com fluorocromo diluiu-se com soro de cabra normal a 5% durante 1 h à TA no escuro. </li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min cada, no escuro. </li><li> Incubar as lâminas com DAPI (1 ug / ml) durante 10 min, e em seguida, lavá-los duas vezes em 1X PBS durante 5 minutos cada. </li><li> Colocar uma gota de meio de montagem sobre uma lamela após a remoção de qualquer água residual. Com cuidado, coloque o slide (celular voltado para baixo) no meio de montagem. </li><li> Permitir que os slides para secar por 2-3h no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Visualizar os slides usando microscopia de fluorescência (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X e ampliação de 200X) 12. </li></ol></li></ol>

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<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+for+clinical+application+to+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+regeneration+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+in+vivo+using+MSCs+induced+by+a+spatially+controlled+gene+delivery+system+in+bilayered+integrated+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).</li>
<li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li>
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Declaramos que não temos conflitos de interesse associados a este trabalho.

O estado stemness de células é muito importante para a superexpressão induzida por CG de SOX9. Em nosso estudo, a expressão SOX9 poderia ser induzida por CG na ASC cedo-passagem (2-3), mas não no ASC depois-passagem. Tem sido relatado que, durante o cultivo, ASC conter células CD34 + 3 até 16 passagens. ASC tendem a perder a expressão de CD34 como as células são passadas, resultando em uma baixa resposta de CG. Com força da gravidade centrífugo, a pressão hidrostática...

Defeitos na cartilagem articular não curam naturalmente. Consequentemente, transplante de células estaminais tem sido proposto como uma abordagem promissora para a reparação de cartilagem deficiente. No entanto, este método requer a aquisição de um número suficiente de células estaminais e a indução destas células para sofrerem diferenciação condrogénica. medula óssea (MO) tem sido amplamente utilizado como uma fonte de células estaminais, mas o isolamento de células a partir de BM tem duas grandes desvantagens: a invasividade e rendimento insuficiente. Devido à sua facilidade de aquisição, o tecido adiposo é uma fonte preferida de células estaminais. Estudos anteriores demonstraram a possibilidade de isolar as células estaminais a partir de tecido adiposo e indução da diferenciação condrogénica nestas células utilizando citoquinas, tais como TGF-β1 1, 2. Esses métodos são eficazes, mas caro. Como uma alternativa de baixo custo para as citocinas, a tensão mecânica pode ser usado parainduzir a diferenciação condrogênica. Carga mecânica desempenha um papel crítico na manutenção da saúde da cartilagem articular 3, e pode induzir fenótipos condrogênicos em várias células. Por exemplo, a pressão hidrostática induz fenótipos condrogênicos em células progenitoras derivadas de sinóvia por meio da via da MAP-cinase / JNK 4, e a compressão mecânica induz condrogénese em células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) por regulação positiva de genes condrocítico 5. Além disso, a tensão de cisalhamento contribui para a expressão de matriz extracelular relacionada com a condrogénese (ECM) em 6 MSCs humanas. Centrífuga gravidade (CG), um stress mecânico controlado facilmente aplicada e gerado por centrifugação, pode induzir a expressão diferencial de genes em células de 7. Por exemplo, em células de carcinoma epitelial de pulmão, a expressão de interleucina (IL) -1-B é regulado positivamente por centrifugação 8. Tor conseguinte, como um stress mecânico experimentalmente indutível, CG pode ser utilizado para induzir a expressão de genes em células estaminais condrocítico. No entanto, não fica claro se CG pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco. Neste estudo, descobrimos que CG induziu a regulação positiva de SOX9, um regulador mestre da chondrogenesis, no ASC humanos, resultando na superexpressão de genes condrocítico. Além disso, comparou-se os efeitos de CG em condrogénese com aqueles de TGF-β1, o factor de crescimento mais comumente usado para induzir a condrogénese in vitro em células estaminais.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Prato</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Prato</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Cornical</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo Cornical</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta Descartável</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta Descartável</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ASC Culture Media Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Baixa glicose</td><td>Life Technologies</td><td>11885-084</td><td>meio de base de crescimento</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>10%</td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chondrogenic Differentiation Media Materials</td></tr><tr><td>DMEM High glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td>condrogenic differentiation base media</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1%</td></tr><tr><td>Ascorbato-2-fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td></td> 354352 <td>1%</td></tr><tr><td>TGF&beta humano; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materiais</td></tr><tr><td>18 mm Vidro de cobertura</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Inovação</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr>Laboratório <td>de Vetor</td> de<td>Albumina de Soro Bovino</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Colágeno II</td><td>anticorpo abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de cabra, Alexa Sonda molecular conjugada Fluor 594</td><td></td><td>A-11037</td><td>1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sonda molecular</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolongar o reagente antidesbotamento de ouro</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de corrediça, revestido</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polimerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>estrela de carregamento</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) marcador de escada de DNA</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (ASCs)</td> <td>Células</td><td></td><td></td> católicas MASTER</tr></tbody></table>

condrogênica diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

A cartilagem prejudicada não pode cicatrizar naturalmente. Atualmente, a terapia mais avançada para defeitos na cartilagem é o transplante de condrócitos diferenciados de células-tronco por meio de citocinas. Infelizmente, a diferenciação condrogênica induzida por citocinas é cara, demorada e associada a um alto risco de contaminação durante a diferenciação in vitro. No entanto, os estímulos biomecânicos também servem como fatores reguladores cruciais para a condrogênese. Por exemplo, o estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, sugerindo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Neste estudo, demonstramos que a gravidade centrífuga (CG, 2.400 × g), um estresse mecânico facilmente aplicado por centrifugação, induziu a regulação positiva da região determinante do sexo Y (SRY)-box 9 (SOX9) em células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs), fazendo com que expressassem fenótipos condrogênicos. As ASCs centrifugadas expressaram níveis mais altos de marcadores de diferenciação condrogênica, como agrecan (ACAN), colágeno tipo 2 alfa 1 (COL2A1) e colágeno tipo 1 (COL1), mas níveis mais baixos de colágeno tipo 10 (COL10), um marcador de condrócitos hipertróficos. Além disso, a formação de agregados condrogênicos, um pré-requisito para a condrogênese, foi observada em ASCs centrifugados.

gravidade centrífuga induz a superexpressão de marcadores de diferenciação condrogênicas em células-tronco derivadas de tecido adiposo. Para determinar o grau de força da gravidade centrífuga que é adequado para induzir a diferenciação condrogénica, ASC foram estimuladas com diferentes graus de CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) durante 15 min. Após a estimulação, as ASC foram re-semeadas em placas de cultura e cultivadas duran...

O estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, fornecendo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Apresentamos um protocolo para induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) usando gravidade centrífuga (CG). A regulação positiva de SOX9 induzida por CG resulta no desenvolvimento de fenótipos condrogênicos.

Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir a diferenciação condrogênica de ASCs para reparo defeituoso da cartilagem. Este método é induzir a diferenciação pré-condrogênica de ASC usando a força da gravidade centrífuga. Embora este método possa fornecer informações sobre a diferenciação condrogênica de ASCs, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como diferenciação osteogênica e fibrogênica.A principal vantagem dessa técnica é que a diferenciação condrogênica pode ser facilmente induzida a partir de células-tronco sem tratar nenhuma citocina. Demonstrando o procedimento estarão Yeri Alice Rim e Yoojun Nam do meu laboratório. Comece colhendo células-tronco derivadas de tecido adiposo 80% confluentes de uma placa de cultura de 100 mililitros, descartando o meio e lavando com cinco mililitros de PBS.Em seguida, adicione um mililitro de PBS contendo um EDTA milimolar e incube por dois minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada contendo 5% de dióxido de carbono. Após dois minutos, bata suavemente na placa de cultura, adicione quatro mililitros de meio fresco e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar as pilhas a 250 vezes g durante dois minutos à temperatura ambiente.Após centrifugação, remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio. Conte as células usando um hemocitômetro.Para carga centrífuga por gravidade, transfira 2,5 vezes dez para a quinta célula para um novo tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 2400 vezes g por 15 minutos. Após a centrifugação, proceder à cultura de pellets ou de micromassa. Imediatamente após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e a 500 microlitros de meio de diferenciação condrogénica, ou MDL, e 50 microgramas por mililitro de ácido L-ascórbico 2-fosfato recém-preparado para o sedimento.Um controle positivo, induz a diferenciação condrogênica e coleta suas células adicionando MDL contendo 10 nanogramas por mililitro de TGF-beta-1. Tampe frouxamente os tubos e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada contendo 5% de dióxido de carbono por três semanas. Imediatamente após a centrifugação por gravidade, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 microlitros de MDL.Para formar uma micromassa, pipete as células ressuspensas no centro de um poço de uma placa de 24 poços e, em seguida, coloque a placa na incubadora. Após duas horas, adicione cuidadosamente 500 microlitros de MDL ao poço, pipetando contra a parede da placa para evitar a ruptura da micromassa. Como controle positivo, realizar uma cultura de micromassa com células não centrifugadas adicionando MDL contendo 10 nanogramas por mililitro de TGF-beta-1.Incubar a micromassa por três semanas. No dia 21 após a formação da micromassa, use uma pipeta para colher os pellets esferóides e, em seguida, lave com 1X PBS. Fixe os grânulos esferóides por imersão em 4% de paraformaldeído por 24 horas.No dia seguinte, descarte o fixador e enxágue os pellets celulares com água deionizada. Coloque uma camada de gaze no de tecido e transfira os grânulos esferóides fixos usando uma pipeta. Cubra o pellet dobrando a gaze e feche a tampa do.Em seguida, desidrate os pellets esferóides por imersão em etanol a 70% por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, continue com uma série de concentrações de etanol por cinco minutos cada. Em seguida, mergulhe os pellets em xileno 100% por 15 minutos.Mergulhe os grânulos esferóides em parafina a 56 graus Celsius para incorporação. Em seguida, corte seções de cinco mícrons de espessura do pellet de célula embebido em parafina usando um micrótomo rotativo. Flutue as seções em etanol a 50% e, em seguida, transfira-as para um banho-maria a 50 graus Celsius.Monte as seções flutuantes em lâminas e, em seguida, prossiga para safranina o e azul de alcian para coloração imunofluorescente. Para determinar uma força de gravidade centrífuga adequada, os ASCs foram girados em gravidade centrífuga de zero, 300, 600, 1, 200 e 2, 400 vezes g por quinze minutos. A expressão de mRNA de SOX9 foi avaliada 24 horas após a estimulação do CG.Um CG de 2.400 vezes g induziu significativamente a expressão de mRNA de SOX9. Para avaliar a expressão de genes relacionados à condrogênese, o RNA total foi extraído de ASC não estimulados, ASCs que foram centrifugados ou tratados com TGF-beta-ona. Como visto aqui, a estimulação do CG induz a expressão de colágeno tipo 2 e agrecan.a superexpressão de colágeno tipo 2 em ASCs tratados com CG foi confirmada por imunofluorescência usando um anticorpo contra colágeno tipo 2 em um anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 594. Para determinar o efeito do CG na superexpressão de ECM relacionada à condrogênese, os ASCs foram tratados com TGF-beta-ona como controle positivo. O controle negativo foi uma cultura de pellets não submetida ao carregamento de CG, ou tratamento com TGF-beta-ona.A superexpressão de ECM relacionada à condrogênese foi avaliada em pellets esferóides constituídos por ASC centrifugados por meio do uso de safranina o e coloração de azul de alcian. O glicosaminoglicano, um dos principais componentes da cartilagem articular, foi corado de azul por azul de alciano ou de laranja por safranina o. Após 14 dias de cultivo de micromassas, a condensação de condrócitos foi avaliada pelo tamanho dos agregados.O tamanho de cada agregado, gerado pelo CG, foi de cerca de 0,5 milímetros. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos, se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a diferenciação condogênica de células-tronco usando a força da gravidade centrífuga.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo de porco (pADSC) de tecidos adiposos subcutâneos com exame de multipotência. O pADSC multipotente é usado para delinear processos de diferenciação de adipócitos e estudar a transdiferenciação em múltiplas linhagens celulares de mesênquima mesodérmico ou outras linhagens de ectoderma e endoderme para estudos regenerativos.

Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

Apresentamos um protocolo para gerar uma linhagem condrogênica de sangue periférico humano (PB) através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um método livre de integração, que inclui a formação de corpo embrionóide (EB), expansão de células fibroblásticas e indução condrogênica.

Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

Aqui, propomos um protocolo para a diferenciação condrogênica das células-tronco pluripotentes induzidas por células derivadas de células mononucleares do sangue do cordão umbilical.

Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Um método para obter a nanopatterns baseada em dendrímeros irregulares que permitem o controle de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico ácido (RGD) densidade de superfície é descrito e aplicado para o estudo da diferenciação celular de adesão e chondrogenic.

Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

O objetivo do presente protocolo é testar a capacidade de células progenitoras derivadas de tecido adiposo de perivascular humana de se diferenciar em várias linhagens de célula. Diferenciação foi comparada com as células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea humana, que é conhecida por se diferenciar em adipócitos, osteócito e linhagens de condrócitos.

Capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana Perivascular adiposo

Apresentamos um protocolo para o isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco derivadas de adipose derivados da crista neural (NCADSCs) do tecido periártico adiposo de Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Os NCADSCs podem ser uma fonte de ADSCs facilmente acessível para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro.

Isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco originais de adipose da crista neural do tecido adipogênico periaorótico

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

Este estudo descreve um método para produzir esferoides condrocíticos agregando células em esferoides sob condições de baixa adesão usando gravidade, seguido de cultura dos esferoides resultantes em mini-biorreatores.

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

Aprenda a induzir diferenciação condrogênica em células-tronco derivadas de tecido adiposo usando gravidade centrífuga. Este método sem citocinas promove a expressão de SOX9 para reparo de cartilagem.

Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

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