Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

O objetivo geral deste procedimento é induzir a diferenciação condrogênica de ASCs para reparo defeituoso da cartilagem. Este método é induzir a diferenciação pré-condrogênica de ASC usando a força da gravidade centrífuga. Embora este método possa fornecer informações sobre a diferenciação condrogênica de ASCs, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como diferenciação osteogênica e fibrogênica.

A principal vantagem dessa técnica é que a diferenciação condrogênica pode ser facilmente induzida a partir de células-tronco sem tratar nenhuma citocina. Demonstrando o procedimento estarão Yeri Alice Rim e Yoojun Nam do meu laboratório. Comece colhendo células-tronco derivadas de tecido adiposo 80% confluentes de uma placa de cultura de 100 mililitros, descartando o meio e lavando com cinco mililitros de PBS.

Em seguida, adicione um mililitro de PBS contendo um EDTA milimolar e incube por dois minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada contendo 5% de dióxido de carbono. Após dois minutos, bata suavemente na placa de cultura, adicione quatro mililitros de meio fresco e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar as pilhas a 250 vezes g durante dois minutos à temperatura ambiente.

Após centrifugação, remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio. Conte as células usando um hemocitômetro.

Para carga centrífuga por gravidade, transfira 2,5 vezes dez para a quinta célula para um novo tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 2400 vezes g por 15 minutos. Após a centrifugação, proceder à cultura de pellets ou de micromassa. Imediatamente após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e a 500 microlitros de meio de diferenciação condrogénica, ou MDL, e 50 microgramas por mililitro de ácido L-ascórbico 2-fosfato recém-preparado para o sedimento.

Um controle positivo, induz a diferenciação condrogênica e coleta suas células adicionando MDL contendo 10 nanogramas por mililitro de TGF-beta-1. Tampe frouxamente os tubos e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada contendo 5% de dióxido de carbono por três semanas. Imediatamente após a centrifugação por gravidade, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 microlitros de MDL.

Para formar uma micromassa, pipete as células ressuspensas no centro de um poço de uma placa de 24 poços e, em seguida, coloque a placa na incubadora. Após duas horas, adicione cuidadosamente 500 microlitros de MDL ao poço, pipetando contra a parede da placa para evitar a ruptura da micromassa. Como controle positivo, realizar uma cultura de micromassa com células não centrifugadas adicionando MDL contendo 10 nanogramas por mililitro de TGF-beta-1.

Incubar a micromassa por três semanas. No dia 21 após a formação da micromassa, use uma pipeta para colher os pellets esferóides e, em seguida, lave com 1X PBS. Fixe os grânulos esferóides por imersão em 4% de paraformaldeído por 24 horas.

No dia seguinte, descarte o fixador e enxágue os pellets celulares com água deionizada. Coloque uma camada de gaze no de tecido e transfira os grânulos esferóides fixos usando uma pipeta. Cubra o pellet dobrando a gaze e feche a tampa do.

Em seguida, desidrate os pellets esferóides por imersão em etanol a 70% por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, continue com uma série de concentrações de etanol por cinco minutos cada. Em seguida, mergulhe os pellets em xileno 100% por 15 minutos.

Mergulhe os grânulos esferóides em parafina a 56 graus Celsius para incorporação. Em seguida, corte seções de cinco mícrons de espessura do pellet de célula embebido em parafina usando um micrótomo rotativo. Flutue as seções em etanol a 50% e, em seguida, transfira-as para um banho-maria a 50 graus Celsius.

Monte as seções flutuantes em lâminas e, em seguida, prossiga para safranina o e azul de alcian para coloração imunofluorescente. Para determinar uma força de gravidade centrífuga adequada, os ASCs foram girados em gravidade centrífuga de zero, 300, 600, 1, 200 e 2, 400 vezes g por quinze minutos. A expressão de mRNA de SOX9 foi avaliada 24 horas após a estimulação do CG.

Um CG de 2.400 vezes g induziu significativamente a expressão de mRNA de SOX9. Para avaliar a expressão de genes relacionados à condrogênese, o RNA total foi extraído de ASC não estimulados, ASCs que foram centrifugados ou tratados com TGF-beta-ona. Como visto aqui, a estimulação do CG induz a expressão de colágeno tipo 2 e agrecan.

a superexpressão de colágeno tipo 2 em ASCs tratados com CG foi confirmada por imunofluorescência usando um anticorpo contra colágeno tipo 2 em um anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 594. Para determinar o efeito do CG na superexpressão de ECM relacionada à condrogênese, os ASCs foram tratados com TGF-beta-ona como controle positivo. O controle negativo foi uma cultura de pellets não submetida ao carregamento de CG, ou tratamento com TGF-beta-ona.

A superexpressão de ECM relacionada à condrogênese foi avaliada em pellets esferóides constituídos por ASC centrifugados por meio do uso de safranina o e coloração de azul de alcian. O glicosaminoglicano, um dos principais componentes da cartilagem articular, foi corado de azul por azul de alciano ou de laranja por safranina o. Após 14 dias de cultivo de micromassas, a condensação de condrócitos foi avaliada pelo tamanho dos agregados.

O tamanho de cada agregado, gerado pelo CG, foi de cerca de 0,5 milímetros. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos, se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a diferenciação condogênica de células-tronco usando a força da gravidade centrífuga.