Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

O objetivo geral deste experimento é entender como as células imunes respondem à reperfusão de isquemia por meio de imagens multifotônicas intravitais da pele da orelha de camundongo. Este método pode ajudar a abordar algumas das questões muito importantes no campo da Imunologia e Dermatologia para entender o comportamento dinâmico da célula imune. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um modelo de imagem robusto para estudar as atividades celulares na pele em estado inflamado ou em repouso.

Embora esse método possa fornecer informações sobre lesões de reperfusão isquêmica, isso também pode ser aplicado a outros sistemas, como reações de hipersensibilidade e infecções. Para iniciar este procedimento, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius durante todo o procedimento de preparação. Confirme a profundidade da anestesia pela ausência de reflexo de pinça do dedo do pé.

Em seguida, aplique lubrificante oftálmico nos olhos do animal para evitar o ressecamento durante a anestesia. Depois, aplique cuidadosamente o creme depilatório nos dois terços superiores da orelha dorsal e aguarde dois a três minutos. Em seguida, remova o creme usando aplicadores de ponta de algodão úmidos de maneira completa, mas suave.

Agora, induza a isquemia na pele da orelha do camundongo usando os ímãs de neodímio. Para fazer isso, primeiro encaixe os ímãs em suas guias plásticas individuais. Posicione um ímã de forma que apenas a borda entre em contato com um segundo ímã ventral, que deve ser colocado abaixo do lado ventral da orelha com a orelha apoiada no ímã.

Quando estiver pronto, deixe cuidadosamente os ímãs se juntarem. Após 1,5 horas de isquemia, remova os ímãs torcendo-os um para longe do outro usando as guias plásticas, permitindo que a reperfusão ocorra. Imediatamente após a remoção do ímã, administre Evans Blue ou outro agente de marcação de vasos sanguíneos de sua escolha por via intravenosa.

Nesta etapa, corte dois pedaços de fita adesiva. Deixe os lados adesivos grudarem, deixando cerca de um milímetro de adesivo ao longo de sua largura. Em seguida, corte a fita adesiva em duas para acomodar sua colocação dentro da fenda na plataforma da orelha.

Insira esta fita adesiva na metade da fenda, de modo que o lado adesivo fique voltado para cima. Depois disso, posicione o mouse na almofada de aquecimento de forma que a orelha a ser fotografada fique ao lado da tira de fita adesiva. Usando dois aplicadores de ponta de algodão umedecidos PBS, pressione suavemente a orelha contra a fita adesiva.

Usando a tira como guia, traga a orelha do mouse pela fenda enquanto ajusta o mouse mais perto do palco. Como a pele da orelha é muito frágil, esta etapa deve ser feita com muito cuidado para evitar lesões induzidas pelo preparo. Para remover a fita adesiva, primeiro adicione uma gota de PBS para reduzir a adesividade da fita.

Em seguida, separe a orelha do rato da fita adesiva o mais suavemente possível usando um pincel fino. Achate a orelha contra a plataforma da orelha rolando suavemente um aplicador de ponta de algodão úmido sobre a orelha. Em seguida, coloque uma gota de PBS embaixo da lamínula e coloque-a suavemente sobre a orelha.

Em seguida, insira a sonda de temperatura retal e conecte os fios ao sistema de aquecimento de acordo com as instruções do fabricante. Para adquirir imagens, coloque o animal sob o microscópio multifotônico. Comece com uma região de imagem que esteja próxima à borda da isquemia caracterizada por vazamento maciço de Azul de Evans.

O diagrama esquemático aqui mostra o posicionamento dos ímãs. Essas duas fotos mostram uma orelha pré-isquêmica e uma pós-isquêmica após o clampeamento do ímã. Neste esquema da orelha indica a região fotografada em relação ao local onde o ímã foi colocado.

Esta sequência de lapso de tempo de projeção máxima, mostra a infiltração de neutrófilos em resposta à reperfusão na pele da orelha de camundongo albino LysM-eGFPM após 1,5 horas de isquemia. Em momentos anteriores, a falta do sinal azul de Evans indica oclusão temporária do vaso após isquemia. Uma vez dominado, os preparativos para a orelha reperfundida isquêmica para imagens podem ser feitos em menos de 30 minutos se forem realizados corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante verificar constantemente a profundidade da anestesia e a temperatura do mouse. Após este procedimento, outro método, como a coloração de toda a pele da orelha do camundongo, pode ser realizado para ter uma visão global das localizações celulares. Após o desenvolvimento deste protocolo, abriu caminho para pesquisadores na área de Imunologia e Dermatologia explorarem a imunidade inata na pele da orelha de camundongo.

Depois de assistir a esses vídeos, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer um modelo de imagem da pele da orelha de camundongo para estudar a lesão de reperfusão isquêmica. Não se esqueça de que trabalhar com microscópio multifoto pode ser perigoso. E precauções como treinamento de segurança a laser devem ser tomadas.