Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

O objetivo geral desta técnica é capturar interações lipídico-proteína proximal in vitro. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da dinâmica mitocondrial, como como as interações proteína-proteína na membrana externa mitocondrial podem ser afetadas por lipídios acessórios. A principal vantagem dessa técnica é que a amarração de domínios de proteínas solúveis a modelos lipídicos garante que uma confirmação mais nativa possa ser alcançada.

Além disso, interações complexas entre proteínas solúveis e seus parceiros ligados podem ser avaliadas na presença de cofatores lipídicos definidos. Embora usemos esse método para investigar interações proteicas na maquinaria de fissão mitocondrial, ele também pode ser aplicado a outros complexos de proteínas que se localizam em diversos compartimentos de membrana. Demonstrando este procedimento estará Ryan, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Primeiro, combine soluções de clorofórmio dos lipídios desejados em um tubo de ensaio de vidro limpo. Evapore o solvente com gás nitrogênio seco enquanto gira o tubo para formar uma fina película lipídica. Em seguida, remova o solvente residual com o evaporador centrífugo por uma hora a 37 graus Celsius.

Em seguida, adicione o tampão A pré-aquecido para obter uma concentração lipídica final de um a dois milimolares. Incube por 30 minutos a 37 graus Celsius com vórtice ocasional para ressuspender totalmente a mistura lipídica. Após a incubação, transfira a mistura lipídica para um tubo de ensaio de plástico e coloque o tubo em nitrogênio líquido por aproximadamente 30 segundos até congelar completamente.

Em seguida, coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por um a dois minutos até descongelar completamente. Em seguida, prepare uma extrusora de lipídios embebendo quatro suportes de filtro e um filtro de policarbonato no tampão A e montando a extrusora de acordo com as instruções do fabricante. Extrudir a solução lipídica através do filtro 21 vezes usando uma pressão constante suave para garantir uma distribuição de tamanho homogênea.

Durante a extrusão, use pressão constante lenta para garantir a homogeneidade do tamanho do lipossomo. Com um filtro de um mícron, isso é menos importante. Mas com tamanhos de filtro menores, pode introduzir uma heterogeneidade mais aparente.

Armazene os lipossomas extrudados a quatro graus Celsius. Incubar o fator de fissão mitocondrial marcado com His ou Mff com lipossomas de andaime por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente no tampão A e BME. Para um controle livre de Mff, incube os lipossomas com uma proteína de controle marcada com His, como GFP, para ligar e proteger o níquel-NTA exposto.

Adicione a proteína um relacionada à dinamina ou Drp1 à mistura de lipossomas e incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, transfira cinco microlitros da amostra para uma folha de filme de laboratório e coloque uma grade de cobre-ródio revestida de carbono em cima da amostra. Após incubação por um minuto, remova o excesso de líquido com papel de filtro e adicione uma gota de acetato de uranila a 2%.

Depois de incubar por mais um minuto, remova o excesso de mancha com papel de filtro e transfira a amostra para uma caixa de grade. No dia seguinte, faça imagens das amostras usando um microscópio eletrônico de transmissão com ampliação de 18.500 a 30.000X para observar mudanças ultraestruturais nas morfologias de proteínas e lipossomas. Incube Mff e Fis1 marcados com His com os lipossomas de andaime por 15 minutos em temperatura ambiente no tampão A e BME.

Adicione Drp1 e incube cada mistura por mais 15 minutos em temperatura ambiente. Transfira os tubos para o termociclador ajustado para 37 graus Celsius e inicie as reações adicionando GTP e cloreto de magnésio. Nos pontos de tempo desejados, transfira 20 microlitros de cada mistura de reação para poços de uma placa de microtitulação contendo cinco microlitros de EDTA 0,5 molar para quelar o magnésio e interromper a reação.

Em seguida, prepare um conjunto de padrões de fosfato diluindo o fosfato de potássio no tampão A e no BME para calibrar os resultados. Adicione 20 microlitros de cada padrão aos poços contendo cinco microlitros de EDTA 0,5 molar. Adicione 150 microlitros de reagente verde malaquita a cada poço.

Por fim, leia o OD 650 cinco minutos após cada adição. O GTP hidrolisará lentamente na presença do reagente verde de malaquita ácido. Portanto, este reagente deve ser adicionado a todos os poços de amostra dentro de 10 minutos após a medição da absorbância para maximizar a relação sinal-ruído.

Na ausência em Drp1, nem Mff nem GFP resultaram em deformação da membrana. E apenas lipossomas sem características foram observados para lipossomas de andaimes enriquecidos decorados com GFP ou ESL. No entanto, quando o Drp1 foi adicionado aos modelos de ESL decorados com Mff, a remodelação dos lipossomas ficou evidente.

Decoração do SL com atividade GTPase aprimorada por MFF. Por outro lado, quando os grupos de cabeça NTA expostos foram bloqueados com GFP marcado com His, essa atividade aumentada de GTPase foi ablacionada. A amarração de Fis1 sem seu domínio transmembrana para o SL também não conseguiu provocar uma estimulação da atividade GTPase de Drp1.

Semelhante ao SL, a adição de SL / Cl ao Drp1 resultou em uma ligeira estimulação da atividade da GTPase que foi revertida pela amarração de Fis1 ou GFP marcada com His aos lipossomas. Uma sinergia entre Mff e cardiolipina foi observada quando a atividade GTPase de Drp1 foi estimulada 2,6 vezes quando incubada com SL / CL decorada com Mff. Quando os modelos SL/PE/CL foram decorados com Mff, a atividade Drp1 foi aprimorada.

A capacidade de Drp1 de remodelar lipossomas em túbulos lipídicos foi aumentada pela adição de PE aos lipossomas de andaime. Uma vez dominados, esses andaimes podem ser preparados e usados em horas se o procedimento for realizado corretamente. Após este procedimento, outros métodos de interação de proteínas e lipídios, como ensaios de sedimentação e espalhamento de luz, podem ser realizados para caracterizar as interações funcionais.

A aplicação dessa técnica permite que as pessoas que examinam a translocação de proteínas para uma membrana biológica definida explorem interações transitórias de proteínas e o impacto de cofatores lipídicos específicos na formação e estabilização de conjuntos celulares essenciais.