Name: Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a usar andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína próximas a lipídios in vitro. Este método permite estudar como lipídios acessórios afetam a dinâmica mitocondrial.

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Os autores gostariam de agradecer o financiamento recebido da American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. Andaime lipossomas Preparação NOTA: Idealmente, as experiências iniciais deve usar um andaime relativamente simples e sem traços característicos (composto de DOPC (1,2-dioleoyl--sn-glicero-3-fosfocolina ou PC) e DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoil - sn-glicero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético) succinil]. (sal de níquel)) edifício fora destas experiências, a carga de lípidos, a flexibilidade, e a curvatura pode ser introduzido como factores individuais com o potencial para alterar as interacções da membrana proximal. Estas alterações podem ser conseguida por adição de quantidades definidas de componentes lípidos específicos, incluindo fosfatidilserina ou cardiolipina (CL), f osf atidiletanolamina (DOPE ou PE), ou galactosil (β) ceramida. <ol><li> Combinar lipidos dissolvidos em clorofórmio em um tubo de ensaio de vidro limpo. Evapora-se o solvente com azoto gasoso seco durante a rotação do tubo de modo a formar uma película fina de lípidos. Remover o solvente residual com uma centrifugal evaporador durante 1 h a 37 ° C. NOTA: As várias formulações lipossomais são usadas nos protocolos descritos abaixo: lipossomas de andaime (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7% molar de DOPC), lipossomas de andaime com cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% molar de cardiolipina / 86,7% molar de DOPC), lipossomas de andaime flexíveis com cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% molar de cardiolipina / 35% molar de DOPE / DOPC 51,7 mol%), e de andaime enriquecido lipossomas (10 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 15% molar de cardiolipina / 35% molar de DOPE / 40% molar de DOPC). </li><li> Adicionar tampão A (25 mM de HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), KCl 150 mM, pH ajustado para 7,5 com KOH) pré-aquecido a 37 ° C, de modo que a concentração final de lípido é de 1 - 2 mm. Incubar 30 min a 37 ° C com agitação em vórtice para ressuspender completamente ocasional da mistura de lípidos (Figura 1a). </li><li> Transferir para um tubo de ensaio de plástico, colocar o tubo em nitrogênio líquido até que esteja completamente congelado (rougHly 30 s), e coloque em uma temperatura de 37 ° C banho de água até estar totalmente descongelado (cerca de 1-2 min). Repetir para um total de 4 ciclos de congelação-descongelação (Figura 1B). </li><li> Prepara-se uma extrusora de lípido por imersão 4 suportes de filtro e um filtro de policarbonato e em tampão de montagem da extrusora de acordo com as instruções do fabricante. Extrudir a solução de lípidos através do filtro 21 vezes. Use pressão suave e constante para assegurar uma distribuição de tamanho homogêneo (Figura 1c). NOTA: Para todas as experiências descritas neste protocolo, um filtro de 1,0 um policarbonato foi usada para a extrusão. Drp1 interacção com lípidos aniónicos pode ser observada com uma variedade de diâmetros de lipossomas variando desde 50 nm a 400 nm, 12 ou maior 13. Por isso, o tamanho do filtro de 1 ^ M foi escolhida para ser ideal, tanto para a actividade de GTPase e por microscopia electrónica. Se outros diâmetros de lipossomas são desejados, preparação de gigantes vesículas unilamelares 14,15 (GUVs) ou pequena unilamellAR vesículas 16 (SUVs) pode ser usado. Dispersão dinâmica de luz pode ser utilizado para avaliar o tamanho do lipossoma heterogeneidade 13. </li><li> Armazenar lipossomas extrudidos a 4 ° C e depois descartá 3-5 d. </li></ol> 2. Uso de andaime lipossomas para Análise de ligação às proteínas <ol><li> Preparação de amostra <ol><li> Incubar marcada com His MffΔTM (5 uM final), com lipossomas de andaime (40 mol% de PC / 35% molar de PE / mole 15% CL / 10% molar de SGD-NTA (Ni 2+), 50 uM final) durante pelo menos 15 min à TA em Tampão a + BME (25 mM de HEPES, 150 mM de KCl, 10 mM de β-mercaptoetanol (BME), pH ajustado para 7,5 com KOH). Para um controle Mff-livre, incubar lipossomas com uma marcada com His proteína de controlo (tal como GFP) para ligar e escudo exposta NTA (Ni 2+). NOTA: MffΔTM foi expressa e purificada como descrito em um estudo prévio 2. GFP foi purificado de uma maneira similar, mas o passo de permuta iónica foi omitido. BME foi necessária para estes experimenTS porque Drp1 é sensível à oxidação, o qual pode alterar as suas propriedades de actividade e de montagem. </li><li> Adicionar Drp1 (2 uM final) e incubar durante 1 h a RT. NOTA: Drp1 foi expressa e purificada como descrito em um estudo prévio 2. Após incubação com Drp1, o efeito de deformação de ligação de membrana de nucleótidos pode ser investigada através da incubação de uma hora adicional com 2 mM de MgCl2 e 1 mM de GTP, quer, 1 mM de GMP-PCP, ou tampão A + BME. </li></ol></li><li> Negativo Stain Transmission Electron Microscopy (EM) Análise <ol><li> Transferência de 5 uL de amostra a uma folha de película de laboratório, e estabelecer uma rede de Cu / Rh revestido-carbono sobre a amostra. Incubar a grade 1 min sobre a amostra, limpar o excesso de líquido em papel de filtro, e transferir para uma queda de 2% de acetato de uranilo. Incubar 1 min, blot excesso de corante em papel de filtro, e transferir para um caixa de grade. Loja sob vácuo O / N para assegurar a dessecação completa. </li><li> amostras de imagem usando um microsc eletrônica de transmissãoope em 18.500 - 30,000X ampliação para observar as alterações ultra-estruturais em proteínas e lipossomas morfologias 17. Nota: As alterações ultra-estruturais podem ser quantificados usando software de análise de imagem, tais como ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). decoração proteína pode ser medido quando comparada com modelos nus lipídicas. Além disso, os diâmetros dos segmentos tubulares pode ser medido a partir da porção mais externa dos conjuntos 13. Uma análise mais detalhada pode ser realizada através de microscopia crio-eletrônico de 17. Este método pode ser utilizado para os conjuntos de proteínas em lípidos nativas imagem em solvente, sem a utilização de manchas de metais pesados ​​que o revestimento da amostra. Desta forma, as características estruturais detalhados não aparentes na coloração negativa, incluindo mudanças na morfologia lipídico subjacente pode ser examinados e quantificados. </li></ol></li></ol> 3. Uso de andaime lipossomas para Ensaio Enzimático Nota: A coloriensaio GTPase métrica 18 foi utilizado para medir a libertação de fosfato por hidrólise GTP. GTPase ensaios alternativos estão disponíveis 19 e pode ser implementado conforme necessário. <ol><li> Incubar marcada com His MffΔTM (QFP), Fis1ΔTM (Fis1), ou GFP (5 uM final para todos) com lipossomas de andaime (150 uM final) durante 15 min à temperatura ambiente em Tampão A + BME (volume = 30 mL). Adicionar Drp1 (500 nM final) e incuba-se um adicional de 15 min à temperatura ambiente (= 80 mL de volume). NOTA: Fis1 foi purificado de uma maneira similar à Mff 2, mas o passo de cromatografia de permuta iónica foi omitido. O propósito de Sua marcado com GFP é para proteger o NTA (Ni 2+) headgroups e evitar interacções de carga não específicas com outras proteínas. Se nenhum efeito é observado na ausência de GFP, então pode não ser necessária este controlo. proteínas alternativos de bloqueio (de tamanho comparável à da proteína de interesse) pode ser utilizado, bem como, mas GFP permite a visualização directa das interacções com SCAFdobre lipossomas. </li><li> Tubos de transferência para um termociclador definido como 37 ° C, e iniciar as reacções por adição de GTP e MgCl2 (1 mM e final de 2 mM, respectivamente; volume = 120 mL). </li><li> Em pontos de tempo desejado (isto é, T = 5, 10, 20, 40, 60 min), a transferência de 20 uL da reacção aos poços de uma placa de microtitulação contendo 5 uL de EDTA 0,5 M para quelar Mg 2+ e parar a reacção. </li><li> Preparar um conjunto de padrões através da diluição de fosfato de KH 2 PO 4 em tampão A + BME para calibrar os resultados. Um conjunto útil de padrões é de 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 0 uM. Adicionar 20 ul de cada uma a poços contendo 5 uL de 0,5 M de EDTA. </li><li> Adicionar 150 uL de reagente de malaquite verde (1 mM de malaquite verde carbinol, 10 mM de molibdato de amónio tetrahidratado, e HCl 1 N) a cada alvéolo, e leu OD650 5 min após a adição. NOTA: GTP é ácido lábil, e irão hidrolisar na presença de reagente de verde de malaquite. Certifique-se que tele o tempo entre a adição do reagente malaquita e leitura é constante para garantir a reprodutibilidade dos resultados. </li><li> Gerar uma curva padrão através da representação gráfica OD 650 dos padrões como uma função da concentração de fosfato. Use de regressão linear para determinar a relação entre a OD 650 e a concentração de fosfato numa amostra. </li><li> Usando a regressão linear, converter a OD 650 das amostras de reacção de fosfato de proteína para uM. Determinar a taxa de geração de fosfato para cada mistura de reacção através da representação gráfica concentração de fosfato como uma função do tempo, e converter a k cat dividindo a taxa pela concentração Drp1 (0,5 uM). NOTA: Apenas a taxa linear inicial deve ser utilizado para determinar a taxa de geração de fosfato, e um mínimo de 3 pontos de dados devem ser usados. Se a velocidade de reacção é suficientemente rápida que os três primeiros pontos de dados não é linear (isto é, o R2 do ajuste linear é inferior a 0,9) um sinalcurso de tempo mais curto ificantly com, pelo menos, 3 pontos de tempo deve ser realizada. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo oferece um método para a investigação das interacções proteína-proteína envolvendo proteínas de membrana integrais. Através da utilização de um lipossoma andaime modular, os investigadores são capazes de avaliar a actividade de uma ou mais proteínas num ambiente de lípido-proximal. Estudos anteriores têm demonstrado um método semelhante por enzimas de receptor da membrana do plasma 24-26. Nós expandimos esse método para incorporar cofatores lipídicos e explorar interações ...

Estudando interações proteína-proteína de membrana-proximal é uma tarefa desafiadora devido à dificuldade de recapitular o ambiente nativo das proteínas de membrana integrais envolvidas 1. Isto é devido à necessidade de solubilização detergente e a orientação inconsistente de proteínas em proteolipossomas. A fim de evitar estes problemas, que têm empregue uma estratégia em que os domínios solúveis de proteínas de membrana integrais são expressos como proteínas de fusão His-tag, e estes fragmentos solúveis estão ancoradas aos lipossomas através de interacções de andaime com NTA (Ni 2+) headgroups no lípido superfície. Usando estes andaimes, as interacções proteína-lipídicos proximal pode ser investigada através de uma gama de composições de lípidos e proteínas. Temos eficazmente aplicado esse método para investigar as interacções proteína-proteína crítica que governam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e examinar interacções lípidos que modulam este processo 2. Durante fissão mitocondrial, uma proteína de remodelação da membrana conservada, chamada proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1) 3, é recrutado para a superfície do mitocondrial externa da membrana (OMM) em resposta a sinais celulares que regulam a homeostase de energia, sinalização apoptótica, e vários outros processos mitocondriais integral. Esta grande GTPase, citosólica é recrutada para a superfície das mitocôndrias através de interacções com proteínas integrais OMM 4 - 8. O papel de uma tal proteína, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), tem sido difícil para elucidar devido a uma interacção fraca aparente com Drp1 in vitro. No entanto, estudos genéticos demonstraram claramente que Mff é essencial para o êxito da fissão 7,8 mitocondrial. O método descrito neste manuscrito foi capaz de superar as deficiências anteriores, introduzindo interações lipídicas simultâneas que promovem interações Drp1-QFP. No geral, este romance REVEA ensaiolevou interações fundamentais que orientam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e forneceu uma nova etapa para estudos estruturais e funcionais em curso desta máquina molecular essencial. Até à data, a análise de interacções entre Drp1 e Mff ter sido complicada pela flexibilidade inerente do Mff 9, a heterogeneidade dos polímeros Drp1 2,10, e a dificuldade de purificação e a reconstituição de comprimento completo Mff com um domínio transmembranar de 11 intacta. Nós abordado esses desafios usando lipossomas NTA (Ni 2+) de andaime para reconstituir marcada com His Mff faltando seu domínio transmembranar (MffΔTM-His 6). Esta estratégia foi vantajoso porque MffΔTM foi extremamente solúvel quando sobre-expresso em E. coli, e esta proteína foi isolado facilmente reconstituída em lipossomas de andaime. Quando preso a estes modelos de lípidos, Mff assumido um, voltados para o exterior orientação idêntica na superfície da membrana.Além destas vantagens, lípidos mitocondriais, tais como a cardiolipina, foram adicionados para estabilizar Mff dobragem e de associação com a membrana 11. A cardiolipina também interage com o domínio variável de 2,12 Drp1 que podem estabilizar esta região desordenada e facilitar a montagem da máquina de fissão. Este método robusto é amplamente aplicável para futuros estudos que visam avaliar as interações proteína de membrana-proximal. Através do uso de interacções amarrar / afinidade adicionais, a sofisticação destes estudos de reconstituição da membrana pode ser aumentada para imitar complexidade adicional encontrado na superfície das membranas dentro das células. Ao mesmo tempo, as composições de lípidos podem ser modificados para mimetizar mais precisamente os ambientes nativas destes complexos macromoleculares. Em resumo, este método proporciona um meio para examinar as contribuições relativas de proteínas e lípidos em moldar a morfologias de membrana durante Proc celulares críticascessos.

<table><tbody><tr><td>Fosfatidilcolina (DOPC)</td><td>Lipídios Polares Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidiletanolamina (DOPE)</td><td>Lipídios Polares Avanti</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni2+)</td><td>Lipídios Polares Avanti</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Cardiolipina Cardíaca Bovina (CL)</td><td>Lipídios Polares Avanti</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrusora de lipossomas</td> 268320010 <td>Avanti Lipídios polares</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>grades de manchas negativas / Rh Ted</td><td>Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microfuga</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de</td> <td>placa de microtitulaçãoThermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Corante Coomassie Azul Instantâneo</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td> de <td>Magnésio Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE</td><td>Gel Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Loading Dye</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL Fisher</td><td>Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malaquita Green Carbinol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de Amônio Tetrahidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Filme de Laboratório</td><td>Parafilme</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Uranila</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Microscópio</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerado CentriVap Concentrador</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Leitor de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína lipid-proximal in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Estudos de proteínas de membrana integrais in vitro são frequentemente complicada pela presença de um domínio transmembranar hidrófobo. complicando ainda mais estes estudos, a reincorporação de proteínas de membrana de detergente-solubilizado em lipossomas é um processo estocástico, onde topologia proteína é impossível de aplicar. Este documento apresenta um método alternativo para estas técnicas difíceis que utiliza uma estrutura de suporte à base de lipossomas. a solubilidade da proteína é aumentada pela supressão do domínio transmembranar, e estes aminoácidos são substituídos com um radical amarrar, tal como uma cauda de His. Este tirante interage com um grupo de ancoragem (Ni2 + coordenado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni 2+)) para proteínas marcadas com His), que executa uma topologia uniforme de proteína na superfície do lipossoma. Um exemplo é apresentado, em que a interacção entre a proteína relacionada com um dinamina (Drp1) com uma proteína de membrana integral, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), foi investigated usando este método scaffold lipossoma. Neste trabalho, nós demonstramos a capacidade de recrutar Mff eficientemente Drp1 solúvel à superfície dos lipossomas, o que estimulou a sua actividade de GTPase. Além disso, foi capaz de Drp1 tubulate o modelo lípido Mff-decorado na presença de lípidos específicos. Este exemplo demonstra a eficácia de lipossomas de andaime usando ensaios estruturais e funcionais e destaca o papel do QFP, a regulação da actividade Drp1.

Embora a interacção entre Drp1 Mff e foi demonstrada ser importante para a fissão mitocondrial, esta interacção tem sido difícil de recapitular in vitro. Nosso objetivo era melhor emular o ambiente celular no qual Drp1 e do QFP interagir. Para este fim, os lipossomas contendo concentrações limitativos de NTA (Ni 2+) headgroups foram preparados através da hidratação de uma película de lípido, tal como descrito acima. A solução de lípido consiste inicialmente em vesícul...

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

O objetivo geral desta técnica é capturar interações lipídico-proteína proximal in vitro. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da dinâmica mitocondrial, como como as interações proteína-proteína na membrana externa mitocondrial podem ser afetadas por lipídios acessórios. A principal vantagem dessa técnica é que a amarração de domínios de proteínas solúveis a modelos lipídicos garante que uma confirmação mais nativa possa ser alcançada.Além disso, interações complexas entre proteínas solúveis e seus parceiros ligados podem ser avaliadas na presença de cofatores lipídicos definidos. Embora usemos esse método para investigar interações proteicas na maquinaria de fissão mitocondrial, ele também pode ser aplicado a outros complexos de proteínas que se localizam em diversos compartimentos de membrana. Demonstrando este procedimento estará Ryan, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.Primeiro, combine soluções de clorofórmio dos lipídios desejados em um tubo de ensaio de vidro limpo. Evapore o solvente com gás nitrogênio seco enquanto gira o tubo para formar uma fina película lipídica. Em seguida, remova o solvente residual com o evaporador centrífugo por uma

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados ​​após eluição dos grânulos.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

Aqui nós apresentamos dois protocolos ultra rápidos para reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes e fusão de tais proteoliposomes com bilayers do lipid alvo para detergente livre entrega destas proteínas de membrana para a BICAMADA postfusion. A combinação dessas abordagens permite montagem rápida e facilmente controlada de sistemas complexos de membrana multi-componentes.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

A fusão biológica da membrana é catalisada por proteínas especializadas da fusão. Medir as propriedades fusogénicas das proteínas pode ser conseguida por ensaios de mistura lipídico. Nós apresentamos um método para purificante o atlastin de recombinação da Drosophila, uma proteína que medese a fusão neutralizantes do er, reconstituindo o aos lipossomas pré-formados, e testando para a capacidade da fusão.

Reconstituição detergente-assistida da Drosophila atlastin recombinante em lipossomas para ensaios de mistura de lipídios

A fusão mitocondrial é uma importante reação homeostática subjacente à dinâmica mitocondrial. Descrito aqui é um sistema de reconstituição in vitro para estudar a fusão mitocondrial de membrana interna que pode resolver amarração de membrana, acoplamento, hemifusão e abertura de poros. Discute-se a versatilidade dessa abordagem na exploração de sistemas de membrana celular.

Uma plataforma de membrana modelo para reconstituir a dinâmica da membrana mitocondrial

Este protocolo descreve um método eficiente livre de células para a produção de proteolipossomo de alta qualidade pelo método de diálise de duas camadas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. Este método fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

Este artigo apresenta uma reconstituição simples de redes do citoesqueleto dentro de vesículas gigantes separadas por fase. O método pode ser generalizado e aplicado ao encapsulamento ou confinamento de uma ampla gama de biomoléculas.

In vitro Reconstituição de Redes Citoesqueléticas no Interior de Vesículas Unilamelares Gigantes Separadas por Fase (GUVs)

Aprenda a usar andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína próximas a lipídios in vitro. Este método permite estudar como lipídios acessórios afetam a dinâmica mitocondrial.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

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