Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

Narrador}O objetivo geral deste protocolo é facilitar um método estruturado e reprodutível para processamento 3D de tecido cardíaco total que possa ser usado para avaliar a precisão do direcionamento de injeções intramiocárdicas na zona de borda do infarto. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina cardioregenerativa, como o desenvolvimento da prática e a otimização das técnicas de injeção. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece um método padronizado e reprodutível para processamento 3D de tecido cardíaco inteiro.

As implicações desta técnica se estendem ao desenvolvimento de terapias regenerativas cardíacas e à validação da precisão da injeção de técnicas normais de administração. O objetivo desta terapia com células-tronco cardíacas é injetar células na zona da borda do infarto para estimulação da vasculogênese local e proteção dos cardiomiócitos. Capturar o coração na fase diastólica final requer prática e paciência.

Uma demonstração visual dessas etapas é fundamental. Comece separando o pericárdio do coração injetado com microesferas, mantendo os átrios e ventrículos intactos. Quando todo o tecido tiver sido removido, use uma tesoura de Klinkenberg para dissecar a aorta ascendente cerca de um centímetro acima da válvula aórtica e corte as veias cava inferior e pulmonar a cerca de um centímetro do átrio.

Depois de fixar o ápice do coração no fundo do recipiente de plástico para evitar a flutuação, coloque suturas 2-0 através da parte restante da aorta até as bordas do recipiente e fixe o coração. Tome cuidado para que o coração esteja centralizado e não toque as paredes do recipiente. Quando o órgão estiver preso em uma geometria diastólica final, use pinças de mosquito para segurar a veia cava inferior e use uma seringa de 50 mililitros para injetar lentamente ágar 50 a 60 graus Celsius recém-preparado no átrio direito através da veia cava superior até que o átrio e o ventrículo direito estejam completamente preenchidos.

Para obter um coração embutido que se assemelhe à geometria diastólica final o mais próximo possível, fixe o ápice do ventrículo esquerdo no fundo do recipiente e encha o ventrículo direito com ágar enquanto as veias pulmonares são pinçadas. Em seguida, coloque uma pinça de mosquito nas veias pulmonares e passe suavemente uma nova seringa de 50 mililitros cheia de ágar na direção retrógrada através das válvulas aórticas. Injete lentamente a solução no ventrículo esquerdo até que o ventrículo e o átrio esquerdo estejam completamente cheios, apertando a aorta assim que o ventrículo esquerdo estiver cheio.

Agora, despeje o ágar restante no recipiente até que o coração esteja totalmente coberto e coloque dois tubos de plástico rígido dentro do recipiente de incorporação para servir como estruturas de referência durante o registro da imagem. Em seguida, coloque o coração a dois a sete graus Celsius por pelo menos quatro horas para solidificar o ágar. Após a ressonância magnética, vire o recipiente de cabeça para baixo e deixe o ar entre o ágar e as laterais do recipiente remover a solução sólida de ágar e o coração do recipiente.

Remova as hastes de plástico. Em seguida, use um cortador de carne para seccionar o bloco de ágar e o coração em fatias de cinco milímetros do ápice até a base do coração, cortando paralelamente ao fundo do bloco de ágar para manter a angulação das fatias igual à das imagens de ressonância magnética adquiridas. Quando todas as fatias tiverem sido obtidas, corar as amostras de tecido no TTC.

Após 15 minutos, fotografe as fatias de ambos os lados em um ângulo perpendicular e, em seguida, enxágue cuidadosamente as seções em solução salina a 0,9%. Para obter imagens das amostras por microscopia de fluorescência, selecione a imagem de modo de fluorescência no scanner de modo variável e defina o tamanho do pixel para 100 por 100 mícrons. Para o primeiro bloco de filtro, selecione um filtro passa-banda que se sobreponha ao comprimento de onda de emissão da fluorescência do cordão no canal um e, em seguida, para o filtro passa-banda para o segundo bloco de filtro fora do comprimento de onda de emissão no canal dois.

Em seguida, selecione o bloco de filtro apropriado, ajuste o tubo fotomultiplicador para a tensão apropriada e o laser de excitação para o comprimento de onda de excitação mais próximo do das microesferas injetadas. Após a obtenção de todas as imagens, no software de pós-processamento apropriado, segmentar as bordas do miocárdio e do endoventrículo esquerdo e epicárdico nas imagens de ressonância magnética, seguido de uma segmentação semelhante do miocárdio e dos locais de injeção nas imagens de fluorescência. Em seguida, interpole linearmente os segmentos registrados da imagem de ambos os lados das fatias para reconstruir a espessura da amostra original e criar um modelo 3D dos dados.

Com o coração preso em uma geometria diastólica final, como acabamos de demonstrar, neste experimento representativo, o ágar aderiu com sucesso ao tecido cardíaco, permitindo que o tecido fosse cortado na angulação desejada com espessuras de corte iguais. Nas imagens de fluorescência 2D e ressonância magnética, os locais da cicatriz e da injeção são claramente distintos. O tecido corado com TTC e as imagens de ressonância magnética com gadolínio tardio fornecem um controle para a avaliação da cicatriz na imagem de fluorescência.

O pós-processamento de imagens permite a reconstrução da geometria 3D do coração ex vivo com base nas segmentações e imagens de fluorescência, permitindo a avaliação da precisão da injeção 3D. Neste estudo, as deposições de injeção e a zona de borda do infarto foram protegidas na parede endocárdica, e as distâncias entre as projeções na superfície endocárdica foram medidas. Após este procedimento, outros métodos, como avaliação cirúrgica, quantificação do tamanho do infarto ou validação de outras modalidades de imagem tridimensionais, podem ser realizados.

Usamos essa técnica para avaliar a precisão da injeção na zona de fronteira do infarto. Esta pesquisa foi realizada para melhorar a terapia cardioregenerativa para insuficiência cardíaca. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar o coração, como incorporar e processar tecido cardíaco e como realizar imagens de fluorescência de amostras de tecido cardíaco.