Name: Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir In Vivo Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a medir a capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial em músculo esquelético humano usando espectroscopia por ressonância magnética de fósforo-31. Este método não invasivo padronizado facilita o desenvolvimento de terapias direcionadas.

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Este trabalho foi apoiado em parte por um Prêmio Trifit do Davis Heart and Lung Research Institute, bem como pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH National Institute on Aging.

Este protocolo é aprovado pelo e segue as diretrizes da Ohio State University Institutional Review Board para a investigação seres humanos. É extremamente importante que todos os procedimentos que envolvem equipamentos MR são realizadas por pessoal com formação adequada que aderiram aos mais altos padrões de segurança MR 59. 1. Materiais e Preparação <ol><li> Certifique-se de que todos os materiais necessários estão disponíveis antes do experimento (Figura 2). </li><li> Ligue a bobina 31 P no conector bobina em-quadro no fim da mesa de exame mais próximo para o orifício. Coloque uma grande almofada de espuma triângulo perto da cabeceira da mesa de exames do MR, mas não diretamente sobre a bobina 31 P. Coloque um descanso de cabeça na outra extremidade da mesa de exame MR, mais distante do furo, para o conforto do sujeito. </li></ol> 2. Objecto de posicionamento (Figura 3a) <ol><li> Instrua o assunto mentir supino, pésprimeiro na mesa do MR. Coloque uma almofada de espuma sob os joelhos para apoiar a perna numa posição parcialmente flectida. </li><li> Posicione o motivo perto do lado direito da tabela (o direito do sujeito), a fim de centralizar a coxa esquerda tão de perto ao isocentro ímã possível, garantindo, assim, a homogeneidade B0 ideal no músculo da coxa em exame. Fornecer o assunto com tampões de ouvido e / ou fones de ouvido. </li><li> Posicione a bobina RF 31 P no quadríceps esquerdo aproximadamente no ponto médio entre a patela ea cabeça femoral, e segura para a perna utilizando cintas. Coloque a bobina ao longo da porção lateral da perna, acima do vasto lateral. </li><li> Fixar o óleo para bebé para o aspecto medial da coxa com as mesmas tiras utilizadas para fixar a bobina para a perna. Isso facilita a localização de digitalização. </li><li> Ligam-se as pernas do sujeito em conjunto com uma cinta colocada abaixo da bobina e acima do joelho. Fixe as pernas do sujeito para a mesa de RM com stra adicionalps, um acima do joelho e um meio caminho entre o joelho eo tornozelo. </li><li> Use o guia de luz laser para delinear o centro da bobina e mover a tabela para o isocentro ímã usando este centragem marco. </li></ol> Protocolo 3. Exercício <ol><li> Explique ao assunto que o protocolo de exercício consiste em três fases: uma fase inicial, linha de base; um curto, fase de exercício intenso; e uma fase de recuperação. </li><li> Instrua o assunto para permanecer imóvel e relaxar seus músculos da perna durante a linha de base e recuperação fases da aquisição espectroscopia, a fim de minimizar artefatos de movimento. </li><li> Fornecer uma contagem regressiva para o assunto indicando o início do exercício. Neste ponto, tem o objecto iniciar joelho flexão / extensão tão vigorosamente e tão rapidamente quanto possível contra a resistência das tiras. NOTA: Os músculos do quadríceps são usados ​​para mover a perna esquerda para cima e para baixo, até que seja instruído a parar. </li><li> Terminar o exercício depois de uma queda de 30%na altura do pico de PCR. <ol><li> Observe a altura do pico PCr na janela do visualizador de aquisição, e também visualizá-lo após a conclusão da sequência de exercícios. NOTA: A orientação geral é que uma queda de aproximadamente 30% em PCR altura do pico corresponde a um pico Pi que é 50% da altura do pico de PCR. Se o esgotamento PCr não está ocorrendo rapidamente o suficiente para atingir uma queda de 30% durante a fase de exercício do exame, incentivar o assunto para chutar mais difícil ou mais rápido durante o exercício. NOTA: Cessação de exercício é determinado pelo monitoramento da altura do pico PCr e duração do exercício. Isso pode resultar em um pouco diferentes durações de exercício em pacientes diferentes e pode ser contabilizado na análise. </li></ol></li></ol> 4. Protocolo de digitalização <ol><li> Adquirir um localizador tri-plano para verificar o posicionamento assunto apropriado e identificar a localização da bobina 31 P. NOTA: A sequência de localizador inicia-se automaticamente e centraliza no Índicoposição ated usando o guia de luz laser (passo 2.9) </li><li> Adquirir um segundo localizador tri-avião. <ol><li> Abra a vista fatia nas primeiras imagens localizador Tri plano. NOTA: Este processo pode ser diferente para diferentes sistemas de software e hardware. </li><li> Center e girar a orientação fatia clicando com o botão esquerdo e segurando o grupo fatia. Rode o grupo fatia. Assegure-se que a orientação final de fatias coincide com a posição do óleo para bebé. </li><li> Na janela de rotina a sequência, aumentar o número de fatias para cobrir toda a perna na axial e imagens sagital (Figura 3B). </li></ol></li><li> 31 P espectroscopia sequência: <ol><li> Utilize os seguintes parâmetros de sequência não localizadas pulse-Adquirir: TR: 1000 ms; TE: 0,34 mseg; largura espectral: 2.000 Hz; flip ângulo: 90 graus; pontos de dados adquiridos: 1.024; 4 médias resultantes em uma resolução de tempo de um espectro de cada 6 segundos. </li></ol></li><li> 31 P calço box colocação: <ol><li> Usando um mouse, arrastar o segundo imagens triplane localizador na janela de visualização na parte superior da tela. Arraste a sequência de espectroscopia na janela de protocolo e clique duas vezes para abrir. </li><li> Use a barra de ferramenta de posição para visualizar a voxel calço (selecione o retângulo preto com linhas horizontais). Depois de selecionar essa opção, observar uma caixa verde nas imagens localizador. NOTA: Este é o voxel calço. </li><li> Mova o voxel clicando com o botão esquerdo e segurando o voxel no centro. Alterar o tamanho e rodar a orientação do voxel clicando com o botão esquerdo e segurando o voxel no canto da caixa. Coloque a caixa de calço, de modo a garantir a homogeneidade campo B0 directamente abaixo da bobina e paralela ao plano dos quadríceps. NOTA: Este é adequada para garantir calços dentro da região sensível sob a bobina, a qual é o volume de tecido directamente abaixo do centro da bobina. </li><li> Use as imagens tri-plano localizador para identificar o sensitive região da bobina e ajustar a caixa de calço para englobar esta região dentro do músculo quadriceps. NOTA: A caixa de calço pode ser maior do que a verdadeira cobertura da bobina de superfície, a fim de garantir a homogeneidade B0 dentro da aquisição de dados voxel (Figura 3c). </li><li> Aquisição de teste 31 P: <ol><li> Abra a janela do visualizador de aquisição e selecione o ícone de cabeça na barra de ferramentas de aquisição. Isto irá permitir a visualização da aquisição espectroscopia em tempo real. </li><li> Após a colocação do calço voxel 31P, executar a seqüência para obter um único espectro, clicando no botão "Run" na parte superior da janela do protocolo. </li><li> Examinar a qualidade de calços B0. Observar o espectro resultante na janela de aquisição. Observar um pico de PCr proeminente centrado em 0 ppm e nenhum ruído significativa (Figura 4a, à esquerda). NOTA: Solução de problemas: Se o espectro parece ter ruído, verifique se a caixa de calço é colocado dentro do músculo. de Anúnciosapenas o tamanho e a posição da caixa de calço para melhorar a relação sinal-ruído. Repetir o teste de aquisição, conforme necessário. </li><li> A fim de ver a altura do pico PCr, abrir o espectro na ferramenta de espectroscopia ( "Aplicações" → "Espectroscopia"). Abra a pasta do paciente (ícone da árvore de pastas), selecione a verificação adequada, e clique duas vezes para carregar o espectro. </li></ol></li></ol></li><li> imagem T1 pré-exercício: <ol><li> Obter uma imagem em T1 axial de corte único, no centro de uma bobina. </li></ol></li><li> 31 P aquisição pré-exercício: <ol><li> Copie a sequência do passo 4.4 (que produziu a melhor qualidade espectral) clicando com o botão esquerdo e arrastando a sequência na janela do protocolo. Use esta sequência para todas as medições posteriores. </li><li> Na janela de rotina a sequência, aumentar o número de medições de 1 a 10. selecione Executar para adquirir 10 medições enquanto o assunto está em repouso. </li></ol></li><li> 31 &lt;/ Sup&gt; P aquisição de exercício: NOTA: Tome nota cuidadosa dos horários de início e de exercício final, como isso vai ser importante para a análise. <ol><li> Resto: Aplicar as configurações de calços da verificação anterior e definir a sequência de adquirir 20 medições. Instrua o assunto para começar a retroceder após uma contagem regressiva. Instrua o assunto a permanecer em repouso por 2 medições. </li><li> Exercício: Peça ao sujeito para realizar o exercício de extensão do joelho para ~ 30 segundos (ou o tempo necessário para atingir uma diminuição de 30% no pico de amplitude PCr). Após o sujeito consegue esgotamento PCr suficiente, pedir-lhes para descansar. </li></ol></li><li> 31 P pós-exercício aquisições: <ol><li> Adquirir um adicional de 20 medições em repouso. Certifique-se de que as aquisições pós-exercício começará imediatamente após a sequência de exercícios, sem pausa ou calços (Figura 4a, à direita). NOTA: A subdivisão deste período de recuperação em duas aquisições separadas permite a análise do initial 20 espectros dinâmica durante a aquisição do espectros de segunda 20 dinâmico, permitindo que o operador evite aquisição do período de recuperação completa se o exercício necessita de ser repetida. </li></ol></li><li> Assegurar a qualidade do exercício: <ol><li> Comparar as alturas de pico de PCr no início e no final do exercício. sessões de exercícios de alta qualidade resultar em uma diminuição ~ 30% na concentração de PCR. </li><li> Verificar que a altura do pico de PCR é a mesma no início do repouso e no final de recuperação (tipicamente, &lt;é desejada diferença de 10%). Isto assegura que não havia perda desprezível de homogeneidade campo durante a aquisição. NOTA: Se a repartição PCr é insuficiente, ou se houve uma perda de homogeneidade campo, em seguida, repita a parte de exercícios / recuperação do exame (tendo o cuidado de evitar a fadiga), certifique-se de que a bobina e alças estão bem presos, e estender a duração do exercício e / ou incentivar o exercício mais vigoroso (Figura 4b). NÃOE: Uma comparação das imagens obtidas nas etapas 6 e 11 permite um passo de controle de qualidade adicional para visualizar qualquer deslocamento da coxa e bobina em função do exercício, garantindo assim que o movimento mínima ocorreu durante o protocolo, o que poderia afetar de forma significativa os dados adquiridos . </li></ol></li><li> Seguindo pós-exercício de imagens T1, repita o pré-exercício axial imagem T1 (passo 4.5) usando os mesmos parâmetros de aquisição. <ol><li> Em adição à depleção suficiente de PCr, medir o pH exercício final para garantir que o exercício não induziu a acidose do músculo. </li><li> Executar esta medindo a mudança química entre Pi e PCR (õP i) e usando a seguinte equação 60: pH = 6,77 + log [(õP i -3,29) / (5,68-õP i)] NOTA: O pH deve permanecer superior a 6,8 61. Se a desagregação de PCR é suficiente, mas o pH é demasiado baixo, repetir a sessão de exercício por um curtoer duração e / ou com uma intensidade diminuiu. </li></ol></li><li> Salvando dados: <ol><li> Salve todos os espectros adquiridos como arquivos DICOM e exportá-los para processamento usando JMRUI. </li><li> Se estiver usando um scanner, selecione todas as aquisições de espectroscopia na janela "Navigator". </li><li> Em "Aplicações", selecione "Ferramentas Dicom" → "Export MR espectroscopia," e salvar os arquivos DICOM (* .dcm) para C: / user / MedCom / temp / CDROFFLINE (A ferramenta escolhe automaticamente a localização). </li><li> Em "Transferência", selecione "Exportar para Off-line." Guardar para o local desejado. </li></ol></li></ol> 5. Processamento e Análise de Dados 62 <ol><li> Analisar o MR espectros com software JMRUI livremente disponível (versão 5.2; http://www.jmrui.eu/). </li><li> Apodize e fase de deslocar o espectro de assegurar a uniformidade sobre todos os pontos de tempo adquiridas (Figura 5). O pico PCr será centrado umt 0 ppm no espectro. </li><li> Usar o algoritmo AMARES incorporada para quantificar a amplitude do pico de PCR, em cada espectro adquirido. A amplitude de pico representa a concentração da PCR dentro da região sensível da bobina de superfície nesse ponto de tempo particular. </li><li> No software computacional, traçar as concentrações de PCR como uma função do tempo de aquisição. Usando o built-in ferramenta de ajuste de curva software computacional, ajustar os dados do período de recuperação de PCR para a seguinte equação 52, 63: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq1.jpg"></li><li> Grave os valores da PCr linha de base ( <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq2.jpg"> ), O menor PCR ( <img alt="equação 3" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq3.jpg"> ), E o tempo de recuperação ( <img alt="equação 4" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq4.jpg"> . </li><li> Assegurar que as condições apropriadas forem atendidas durante o exercise sessão através do cálculo da depleção de PCR, a diferença percentual entre a linha de base de PCr e o menor PCR. sessões de exercício ideais resultar numa 20 - esgotamento de 50%. NOTA: A qualidade do ajustamento de curva pode ser assegurada por meio da verificação de que o valor de R2 é maior do que 0,75. Valores de R 2 são calculados automaticamente pelo software de adaptação. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este documento descreve um protocolo padrão para 31 PMRS exame que permite a medição de série e não-invasivo in vivo da função mitocondrial do músculo esquelético. O protocolo mantém apelo considerável quando se considera a amplitude das investigações que visam a crescente carga de síndrome metabólica e sua morbidade e mortalidade resultante. Este protocolo 31 PMRS requer uma quantidade mínima de tempo scanner e pode ser incorporado em investigações metabólicas abrangentes em indivíduos em...

O objetivo deste trabalho é apresentar um método reprodutível para medir de forma não invasiva in vivo a função mitocondrial do músculo esquelético em indivíduos que possuem uma ampla gama de habilidades. disfunção mitocondrial aberrante é uma indicação de uma ampla gama de síndromes metabólicas e doenças genéticas, a partir de condições comuns, tais como o envelhecimento e a diabetes de doenças raras tais como a ataxia de Friedreich. Síndrome metabólica e disfunção mitocondrial A síndrome metabólica foi mostrado para interromper a função mitocondrial, deprimir OXPHOS músculo esquelético, e levar ao armazenamento de lípidos ectópica em músculos esqueléticos 1, 2. Organelas tão crítica que regulam a homeostase metabólica e energia, as mitocôndrias são implicados na fisiopatologia da obesidade 3, 4, 5 resistência à insulina </sup&gt;, Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 6, 7, relacionada com a diabetes micro- 8, 9, 10, 11 e complicações macrovasculares 12, 13 e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) 14, 15, 16, entre outros .Insulin resistência é caracterizada por profundas mudanças na atividade mitocondrial do músculo esquelético, incluindo diminuição da taxa mitocondrial do ácido tricarboxílico (TCA) de fluxo, taxa de síntese de ATP e citrato sintase e NADH: O 2 actividade de oxidoredutase 5. Uma hipótese é que estas alterações pode ser devido à acumulação de ácidos gordos livres (FFA) metabólitos no músculo, que são marcadamente aumentada durante a obesidade e outras obesidade-rdoenças exaltados 2, 17. A exposição de músculo de FFAs elevados e intermediários lipídicos podem diminuir a expressão de genes na via oxidativa lipídica, bem como o ciclo de TCA e de electrões da cadeia de transporte de carga (ETC) 18. Esta redução de capacidade OXPHOS músculo esquelético mitocondrial na definição de uma sobrecarga lipídica é acompanhado por um declínio no quantitativa (conteúdo e biogênese das mitocôndrias) 19 e função qualitativa das mitocôndrias do músculo esquelético 20. Expondo o músculo esquelético e os miócitos para FFAs conduz a resistência severa à insulina, e aumento da absorção de FFA no músculo é associado à resistência à insulina em humanos e roedores 21. A ceramida intermediários lipídicos e diacilglicerol (DAG) foram mostrados para inibir directamente a via de sinalização de insulina, alterando a actividade de cinases, tais como a proteína-quinase C e Protein quinase B 21. Consequentemente, as moléculas derivadas de lípidos parecem desempenhar um papel importante no desenvolvimento de resistência à insulina muscular esquelético e DMT2. No entanto, ainda não está claro se as mudanças na capacidade mitocondrial são uma causa ou uma consequência da resistência à insulina 22. Ataxia e Disfunção Mitocondrial de Friedrich Diminuição OXPHOS também podem surgir de defeitos genéticos. Ataxia de Friedrich (FA), a forma mais comum de ataxia hereditária, é uma desordem genética causada por uma mutação no frataxin gene (FXN), resultando na acumulação de ferro intra-mitocondrial, a produção de espécies de oxigénio reactivo, e anomalias da fosforilação oxidativa 23, 24, 25, 26. Esta importante descoberta conduziu ao desenvolvimento de terapias específicas, which objectivo de melhorar a função mitocondrial ao nível sub-celular. Apesar deste conhecimento, tem havido desenvolvimento limitada in vivo, os biomarcadores reprodutíveis para FA investigação clínica. Na verdade, uma barreira crítica na avaliação eficaz de terapias-alvo em FA é a incapacidade de acompanhar as mudanças na função mitocondrial. medidas funcionais atuais, por exemplo, pode identificar diminuição do débito cardíaco; no entanto, eles são incapazes de determinar o nível em que a disfunção ocorre (Figura 1). O desenvolvimento de um marcador fiável da função mitocondrial que pode ser utilizado para identificar e avaliar a progressão da doença na ataxia de Friedrich é crucial para avaliar o impacto mecânico relevante de terapias específicas. OXPHOS prejudicada e disfunção cardíaca função mitocondrial aberrante, adquirida ou genética, pode contribuir para o desenvolvimento ou progressão de cardidisfunção AC. Nas condições de sobrecarga de pressão e a insuficiência cardíaca, a energia primária preferência substrato interruptores de FFA em glicose. Isto é associado com diminuição da atividade ETC e fosforilação oxidativa 27. A fisiopatologia do bioenergética mitocondrial na disfunção cardíaca pode ser diferente, consoante a origem primária da lesão mitocondrial. Diabetes e síndrome metabólica resulta em anormalidades mitocondriais em miocárdio, tais como biogênese prejudicada e metabolismo de ácidos graxos, que levam a flexibilidade reduzida substrato, a eficiência energética, e, eventualmente, disfunção diastólica 28, 29. Em FA, por outro lado, uma deficiência resulta em acumulação frataxin ferro mitocondrial significativa em cardiomiócitos 30, 31. Acumulação de ferro conduz à produção de radicais livres através da reacção de Fenton 32 &lt;/ Sup&gt; e aumenta a chance de danos livre de cardiomiócitos induzida por radicais. Acúmulo de ferro intra-mitocondrial está também associada a um aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo e uma capacidade oxidativa reduzida 30, 31. Acúmulo de ferro e subsequente função mitocondrial aberrante, devido à deficiência de frataxina, pode, portanto, ser responsável por a energética cardíaca comprometida e cardiomiopatia observadas na FA 33, 34. É também interessante notar que a capacidade oxidativa reduzida em mitocôndrias do músculo esquelético é paralela à intolerância ao exercício e a redução da capacidade metabólica na insuficiência cardíaca (HF) 35. Medição da capacidade OXPHOS músculo esquelético, tal como aqui descrito, é facilmente implementável e robusto; juntamente com o significado da OXPHOS músculo esquelético em HF, estas características fazem dele um biomarcador atraente em estudos abrangentes de ouvirdoença de t 36. OXPHOS prejudicada ea disfunção cardíaca que o acompanha não é um aspecto inconsequente de metabólica e doença mitocondrial. Indivíduos com diabetes e doença metabólica estão em maior risco de desenvolver doença cardiovascular e têm excesso de mortalidade após infarto do miocárdio (MI) 37, 38, 39, 40, 41; mais da metade dos indivíduos FA tem cardiomiopatia, e muitos morrem de arritmia cardíaca ou insuficiência cardíaca 42. Assim, a quantificação de OXPHOS reduzida não só poderia permitir a detecção e tratamento da disfunção cardíaca precoce, mas ele também pode aliviar um fardo clínico importante nestas doenças. terapias direcionadas para aumentar diretamente a capacidade OXPHOS é uma área promissora para melhorar o tratamento de assuntos, wheterap a causa de disfunção metabólica é genética ou adquirida. Actualmente, o desenvolvimento de novas drogas que aliviam tanto a função mitocondrial anormal 43 ou corrigir o defeito genético primário 44 pode melhorar a característica bioenergética demente de FA alvo. No caso de disfunção mitocondrial adquirida, o aumento da actividade física pode melhorar a função mitocondrial 45, 46, 47. 31 Fósforo espectroscopia de ressonância magnética como biomarcador não invasivo da função mitocondrial Independentemente da terapia testada, uma integrada na avaliação in vivo da bioenergética do músculo esquelético é uma ferramenta fundamental para avaliar o impacto das intervenções dirigidas, especialmente em indivíduos com intolerância ao exercício grave ou incapacidade de se submeter metabo convencionaltestes lic. Espectroscopia de ressonância magnética sintonizado de fósforo (31 PMRS), um núcleo endógena encontrado em vários substratos de alta energia no interior das células em todo o corpo, tem sido utilizada para quantificar a capacidade oxidativa mitocondrial usando uma variedade de abordagens, incluindo em-íman protocolos de exercício de recuperação e estimulação muscular protocolos 48. Os protocolos de exercícios de recuperação dependem de uma variedade de aparelhos que variam em complexidade de ergômetros MRI-compatíveis que regulam e medir carga de trabalho para simples configurações de correias e almofadas permitindo tipo explosão resistiva e exercício quase estático. Um dos principais objetivos de qualquer um destes protocolos é produzir um desequilíbrio de energia para os quais a demanda por trifosfato de adenosina (ATP) é inicialmente recebida através da quebra enzimática da fosfocreatina (PCr), através da creatina quinase reacção 49. Após interrupção do exercício, a taxa de produção de ATP é dominado por Pho oxidativosphorylation e representa o máximo de capacidade in vivo das mitocôndrias 50. Além disso, OXPHOS durante a recuperação pós-exercício pode ser descrita por uma reação velocidade de primeira ordem 51. A recuperação pós-exercício da PCr pode, portanto, ser quantificada pela instalação de uma constante de tempo exponencial (τ PCr), com menores valores de τ PCr representando maior capacidade para a síntese de ATP oxidativo. Esforços significativos foram feitos para validar 31 PMRS contra ex vivo e medidas mais diretas de OXPHOS e demonstrar o potencial de aplicabilidade clínica desta técnica 52, 53, 54, 55. Notavelmente, o protocolo descrito no presente trabalho pode ser implementado em scanners clinicamente disponíveis, e isto tem sido amplamente validado como um biomarcador não invasivo Ofunção mitocondrial f 56. No entanto, um protocolo PMRS exercício 31 otimizado para aplicação em indivíduos com diferentes gravidades do comprometimento neuromuscular ou mobilidade não tem sido bem estabelecida 57. Um bem definida, protocolo de exercício amplamente aplicável e 31 PMRS técnica seria particularmente útil na avaliação de doenças com alterações fundamentais na função mitocondrial. Vários estudos anteriores têm explorado as aplicações de técnicas não invasivas para quantificar a função mitocondrial em indivíduos. Por exemplo, estas técnicas têm mostrado OXPHOS alterada em indivíduos com diabetes tipo 2 36. Lodi et ai. primeiro testada a viabilidade das técnicas PMRs em indivíduos com FA e verificou que 1) o defeito genético fundamental na FA prejudica OXPHOS músculo esquelético e 2) o número de tripleto GAA repete é inversamente proporcional ao músculo esquelético óXPHOS 33. Mais recentemente, Nachbauer et ai. PMRS usado como uma medida de desfecho secundário em um teste de drogas FA com 7 indivíduos. PCr tempos de recuperação foram significativamente mais longa em indivíduos em relação aos controles, reafirmando trabalho anterior de Lodi e indicando que os efeitos da expressão aberrante frataxin em FA pode resultar em um declínio na capacidade mitocondrial que é detectável através de técnicas PMRs 58. Métodos confiáveis para definir adequadamente em função do músculo esquelético vivo em um, o custo-benefício, e de maneira reprodutível viável são fundamentais para melhorar os resultados dos pacientes em uma série de doenças que afetam a função mitocondrial. Este trabalho descreve um procedimento robusto para a obtenção da capacidade oxidativa máxima vivo do músculo esquelético usando 31 PMRS. O protocolo de exercício de imã em é bem tolerado por indivíduos que abrangem uma ampla gama de física e functional habilidades e oferece uma configuração simplificada assunto usando o equipamento barato e amplamente disponível.

<table><tbody><tr><td>1.5 T MR Scanner</td><td>Siemens</td><td></td><td>fabricante não afetará os resultados</td></tr><tr><td>10 cm 31P bobina de transmissão-recepção, 1.5T compatível</td><td>PulseTeq</td><td></td><td>fabricante não afetará os resultados</td></tr><tr><td>3 fl oz Baby Oil</td><td>Johnson & O fabricante Johnson</td><td></td><td>não afetará os resultados</td></tr><tr><td>Almofada triangular de espuma (joelho)</td> <td>O fabricante Siemens</td><td></td><td>não afetará os resultados</td></tr> <tr><td>(3) correias resistivas de fivela de plástico; o</td> fabricante <td>Siemens</td><td></td><td>de mesa a mesa não afetará os resultados</td></tr> <tr><td>(1) alça resistiva de fivela de plástico; Siemens auto-conectada</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fósforo-31 magnetic resonance spectroscopy: uma ferramenta para medir in vivo capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

A capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial do músculo esquelético (OXPHOS), que é extremamente importante na saúde e na doença, pode ser medida in vivo e de forma não invasiva em humanos por meio de espectroscopia de ressonância magnética de fósforo-31 (31PMRS). No entanto, a abordagem não tem sido amplamente adotada na pesquisa translacional e clínica, com variações na metodologia e orientação limitada da literatura. O aumento da otimização, padronização e disseminação de métodos para 31PMRS in vivo facilitaria o desenvolvimento de terapias direcionadas para melhorar a capacidade do OXPHOS e poderia, em última análise, impactar favoravelmente a saúde cardiovascular. 31O PMRS produz uma medida não invasiva e in vivo da capacidade de OXPHOS no músculo esquelético humano, em oposição a medidas alternativas obtidas de mitocôndrias explantadas e potencialmente alteradas por meio de biópsia muscular. Ele depende apenas de instrumentação adicional modesta além do que já existe nos scanners de ressonância magnética disponíveis para pesquisa clínica e translacional na maioria das instituições. Neste trabalho, descrevemos um método para medir o músculo esquelético in vivo OXPHOS. A técnica é demonstrada usando um scanner de RM de corpo inteiro de 1,5 Tesla equipado com o hardware e software adequados para 31PMRS, e explicamos um protocolo simples e robusto para exercícios resistidos no ímã para fadiga rápida do músculo quadríceps. A reprodutibilidade e a viabilidade são demonstradas em voluntários, bem como em indivíduos em uma ampla gama de capacidades funcionais.

Estudo reprodutibilidade Seis voluntários (4 homens e 2 mulheres, idade média: 24,5 ± 6,2 anos) com nenhum coração auto-reportados, metabólica ou doença mitocondrial foram submetidos a sessões do exercício técnica e de imagem 31 PMRS descrito em 2 dias diferentes dentro de 1 semana para avaliar técnica reprodutibilidade (Figura 6a). Os estudos realizados em voluntários normais confi...

Este trabalho demonstra a viabilidade de uma técnica de espectroscopia de ressonância magnética de fósforo-31 in vivo (31PMRS) para quantificar a capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) no músculo esquelético humano.

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir In Vivo Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

O objetivo geral desta técnica de ressonância magnética In Vivo e protocolo de exercício é estabelecer um método robusto e padronizado para a medição não invasiva da capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial. A capacidade de fosforilação oxidativa mitocondrial do músculo esquelético pode ser medida de forma não invasiva com espectroscopia de ressonância magnética In Vivo phosphorous 31. Esta técnica padronizada facilitará o desenvolvimento de terapias direcionadas para melhorar a capacidade de fosforilação oxidativa.As principais vantagens dessa técnica são que ela não é invasiva, permitindo investigação em série, e que é bem tolerada por indivíduos que abrangem uma ampla gama de capacidades funcionais. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a configuração do equipamento e o posicionamento do sujeito são tecnicamente intensivos e crucialmente importantes para obter bons resultados. Antes da imagem, primeiro obtenha o consentimento por escrito e informado do sujeito e examine-o minuciosamente quanto à segurança da ressonância magnética.Em seguida, prepare-se para o experimento. Este protocolo é demonstrado usando um sistema Siemens Avanto 1.5 Tesla. Comece a se preparar para a imagem conectando primeiro a bobina de fósforo 31 no conector da bobina da mesa mais próximo do furo.Em seguida, coloque uma grande almofada de espuma triangular perto da outra extremidade da mesa de exame do scanner, mas não diretamente na bobina. Além disso, coloque um travesseiro de cabeça na mesa de exame de RM mais distante do furo e, em seguida, instrua o sujeito a deitar em decúbito dorsal com os pés primeiro na mesa de RM. Coloque uma almofada de espuma sob os joelhos para apoiar a perna em uma posição parcialmente flexionada.Certifique-se de posicionar o assunto próximo ao lado direito da mesa para centralizar a coxa esquerda o mais próximo possível do isocentro do ímã para garantir a homogeneidade ideal de B0. Em seguida, forneça ao sujeito tampões de ouvido ou fones de ouvido para proteção auditiva. Posicione a bobina de fósforo 31 no quadríceps esquerdo do sujeito aproximadamente no ponto médio entre a patela e a cabeça femoral.Em seguida, prenda-o à perna usando tiras. A bobina deve estar sobre a porção lateral da perna, acima do vasto lateral. Prenda uma garrafa de óleo de bebê na parte medial da coxa com as mesmas tiras usadas para prender a bobina à perna e, em seguida, amarre as pernas do sujeito com uma alça colocada abaixo da bobina e acima do joelho.Prenda as pernas do sujeito à mesa de RM com tiras adicionais, uma acima do joelho e outra a meio caminho entre o joelho e o tornozelo. Permita que o sujeito pratique o exercício isométrico para garantir que as tiras forneçam resistência suficiente. Então, quando o assunto estiver confortável, use o guia de luz laser para marcar o centro da bobina e mova a mesa para o isocentro do ímã usando o ponto de referência de centralização.Para a fase inicial da aquisição da espectroscopia, instrua o sujeito a ficar quieto e relaxar os músculos das pernas para minimizar os artefatos de movimento. Comece adquirindo um localizador de triplano para verificar o posicionamento e identificar a localização da bobina. Além disso, adquira um segundo localizador, mas abra a visualização de fatia no primeiro localizador de triplano.Em seguida, configure a sequência de espectroscopia de fósforo 31 com parâmetros de sequência adquirida de pulso não localizados, como visto aqui. Centralize e gire a orientação da fatia clicando com o botão esquerdo e segurando o grupo de fatias e combine a orientação final das fatias com a posição da garrafa de óleo. Agora, coloque a caixa de calços arrastando o segundo localizador de triplano para a janela de visualização, arraste a sequência de espectroscopia para a janela de protocolo e clique duas vezes para abrir.Use a barra de ferramentas de posição para visualizar o voxel de correção que aparecerá nas imagens do localizador. O voxel pode ser movido clicando com o botão esquerdo e segurando-o no centro da caixa, e seu tamanho e rotação podem ser alterados clicando com o botão esquerdo e segurando-o no canto da caixa. Coloque a caixa de calços diretamente abaixo da bobina e paralela ao plano do quadríceps para garantir a homogeneidade do campo B0.Use as imagens do localizador para identificar a região sensível da bobina e ajuste a caixa de calços para abranger essa região dentro do músculo. Abra a janela do visualizador de aquisição e selecione o ícone de cabeça na barra de ferramentas para permitir a visualização da aquisição da espectroscopia em tempo real e, em seguida, execute a sequência para obter um único espectro de teste. Em seguida, observe o espectro resultante e examine a qualidade do calço B0.Procure um pico proeminente de fosfocreatina centrado em zero partes por milhão sem ruído significativo. Se o espectro parecer ruidoso, reposicione a caixa de calços e readquira novamente. Copie a sequência de espectroscopia de teste com a melhor qualidade espectral e use-a para todas as medições subsequentes.Aumente o número de medições de um para 10 e, em seguida, adquira enquanto o assunto está em repouso. Em seguida, para aquisição de exercícios, aplique as configurações de calços da varredura anterior e defina a sequência para adquirir 20 medições. Instrua o sujeito a primeiro permanecer em repouso por duas medições e, em seguida, forneça ao sujeito uma contagem regressiva para indicar quando iniciar o exercício.Neste ponto, o sujeito deve iniciar a flexão de extensão do joelho com a maior força e rapidez possível contra a resistência das tiras por aproximadamente 30 segundos. Após uma queda de 30% na altura do pico de PCR, instrua o sujeito a encerrar o exercício e descansar. Em seguida, adquira 20 medições adicionais pós-exercício imediatamente, sem pausa ou calço.Após a conclusão das aquisições, garanta a qualidade do exercício comparando as alturas dos picos de fosfocreatina no início e no final do exercício. Este gráfico mostra a recuperação da concentração de fosfocreatina após sua depleção com o exercício rápido de extensão do joelho quase estático. A linha representa o ajuste da função de recuperação exponencial.Uma análise de Bland-Altman do tempo de recuperação da fosfocreatina demonstra uma diferença média e desvio padrão de 1,03 mais ou menos 4,83 segundos, e um coeficiente de variação entre tentativas de 4,66. Aqui é mostrada uma curva de recuperação de fosfocreatina representativa do exame de um indivíduo não deambulatorial. Observe que uma depleção de fosfocreatina de 64% foi alcançada com este protocolo de exercícios.Finalmente, esta comparação dos tempos de recuperação da fosfocreatina demonstra capacidade oxidativa mitocondrial sequencialmente mais pobre em indivíduos controle, não diabéticos e diabéticos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 20 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar se o espectro tem sinal suficiente antes do exercício e garantir que o exercício resulte em uma depleção de fosfocreatina de pelo menos 30%Após este procedimento, outros métodos, como imagem de quantificação do músculo gorduroso, podem ser realizados para calcular a massa muscular e o teor de gordura, que também são importantes para a função geral do músculo esquelético.Essa técnica pode ser usada para investigar muitas doenças, incluindo a ataxia de Friedreich, onde permitiu aos pesquisadores correlacionar marcadores genéticos da gravidade da doença na capacidade oxidativa mitocondrial. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma varredura de espectroscopia de ressonância magnética In Vivo fosforoso 31 e protocolo de exercícios. Não se esqueça de que trabalhar com scanners de ressonância magnética requer medidas de segurança rigorosas e que todos os experimentos de RM devem ser realizados por pessoal adequadamente treinado.

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