Fluorescência de raios X (XRF)

1. Preparando as janelas de nitreto de silício

1. Use pinças inversas para pegar uma janela (janelas de nitreto de silício se quebrarão se cairem).
2. Coloque a janela em um deslizamento de vidro, lado plano para cima.
3. Adere pequenos pedaços de fita adesiva aos lados da janela, e use-os para aderir as janelas ao fundo do prato de cultura.
4. Esterilize as janelas em pratos de cultura com radiação UV. Isso pode ser feito com a configuração de auto-crosslink em um gabinete UV-crosslinking, seguido de mais irradiação UV sob a lâmpada UV no capô de fluxo laminar por cerca de 1 h.

2. Emplacando as células nas janelas de nitreto de silício esterilizado

1. Segure o prato com ele inclinado em cerca de um ângulo de 45°.
2. Adicione mídia ao pipetar em direção ao lado do prato e lentamente alivie o ângulo de inclinação para revestir a janela com mídia.
3. Adicione células ao prato de cultura, da mesma forma, e incubar.
4. Observe as células ocasionalmente usando um microscópio leve para determinar quando elas estão prontas para uso.

3. Fixação e Secagem de Células

1. Em um capô de fluxo laminar, remova a mídia por aspiração suave enquanto inclina o prato como descrito acima.
2. Adicione PBS, pipetando em direção ao lado do prato enquanto segura-o no ângulo. Alivie lentamente o ângulo de inclinação para revestir a janela com PBS.
3. Remova o PBS com aspiração suave.
4. Pipetando em direção ao lado do prato, e segurando-o em um ângulo, adicione 4% PFA/PBS, pH 7 para cobrir as células. Mantenha nesta solução por 20 minutos em temperatura ambiente.
5. Remova a mistura PFA/PBS e descarte como material perigoso.
6. Adicione PBS, pipetando conforme descrito acima.
7. Repita as etapas 3.5 e 3.6 duas vezes.
8. Remova o PBS por aspiração suave.
9. Adicione 20 mM PIPES, 200 mM de sacarose, pH 7.
10. Remova o PIPES/sacarose por aspiração suave.
11. Repita as etapas 2.8 e 2.9 duas vezes.
12. Limpe rapidamente as bordas e o recuo da janela com um Kimwipe, em seguida, coloque a janela em uma superfície limpa, como um tapete de grade de borracha, para secar.

4. Imagem de Fluorescência de Raios-X das Células

1. Uma vez que a amostra esteja seca, verifique a presença de células nas janelas usando um microscópio leve.
2. Use esmalte para fixar as janelas em um suporte de alumínio fornecido pela linha de vigas.
3. Insira o suporte de alumínio em um suporte cinemático e, em seguida, coloque-o em posição no ponto focal da óptica no microscópio de raios-X, e em um ângulo de cerca de 45° para o feixe de raios-X incidente, montado para os estágios de nanoposicionamento da amostra.
4. Saia da área do instrumento do microscópio de raios-X (geralmente uma cabana feita de paredes de chumbo) e abra o obturador. Conduza as etapas restantes remotamente.
5. Usando uma placa de zona, ou espelhos Kirkpatrick-Baez, concentre o feixe de raios-X monocromático (geralmente 10 keV em energia) até um tamanho de ponto de sub-mícnico.
6. Usando os estágios da amostra de nanoposicionamento e visualizando a posição do feixe de raios-X na amostra com uma câmera cintilante pré-calibrada a jusante, determine a largura e altura apropriadas do raster scan para capturar dados da amostra.
7. Com o detector de deriva de silício dispersivo de comprimento de onda a 90° para o feixe de incidente, e cerca de 3 mm ou menos da amostra, colete um espectro de teste com um tempo de 1 a 2 segundos.
8. Visualizando o espectro de teste, escolha um tempo de moradia adequado para a varredura, para fornecer sinal-a-ruído suficiente para os elementos de interesse.
9. Escolha uma resolução apropriada para a digitalização, que não seja significativamente menor do que o tamanho do feixe na amostra, nem maior do que as características de interesse da amostra.
10. Programe a varredura no software de digitalização e colete a imagem.