Fluorescência de raios X (XRF)
Fonte: Laboratório da Dra.
Fluorescência de raios-X é uma radiação induzida e emitida que pode ser usada para gerar informações espectroscópicas. A mi…
1. Preparando as janelas de nitreto de silício
- Use pinças inversas para pegar uma janela (janelas de nitreto de silício se quebrarão se cairem).
- Coloque a janela em um deslizamento de vidro, lado plano para cima.
- Adere pequenos pedaços de fita adesiva aos lados da janela, e use-os para aderir as janelas ao fundo do prato de cultura.
- Esterilize as janelas em pratos de cultura com radiação UV. Isso pode ser feito com a configuração de auto-crosslink em um gabinete UV-crosslinking, seguido de mais irradiação UV sob a lâmpada UV no capô de fluxo laminar por cerca de 1 h.
2. Emplacando as células nas janelas de nitreto de silício esterilizado
- Segure o prato com ele inclinado em cerca de um ângulo de 45°.
- Adicione mídia ao pipetar em direção ao lado do prato e lentamente alivie o ângulo de inclinação para revestir a janela com mídia.
- Adicione células ao prato de cultura, da mesma forma, e incubar.
- Observe as células ocasionalmente usando um microscópio leve para determinar quando elas estão prontas para uso.
3. Fixação e Secagem de Células
- Em um capô de fluxo laminar, remova a mídia por aspiração suave enquanto inclina o prato como descrito acima.
- Adicione PBS, pipetando em direção ao lado do prato enquanto segura-o no ângulo. Alivie lentamente o ângulo de inclinação para revestir a janela com PBS.
- Remova o PBS com aspiração suave.
- Pipetando em direção ao lado do prato, e segurando-o em um ângulo, adicione 4% PFA/PBS, pH 7 para cobrir as células. Mantenha nesta solução por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Remova a mistura PFA/PBS e descarte como material perigoso.
- Adicione PBS, pipetando conforme descrito acima.
- Repita as etapas 3.5 e 3.6 duas vezes.
- Remova o PBS por aspiração suave.
- Adicione 20 mM PIPES, 200 mM de sacarose, pH 7.
- Remova o PIPES/sacarose por aspiração suave.
- Repita as etapas 2.8 e 2.9 duas vezes.
- Limpe rapidamente as bordas e o recuo da janela com um Kimwipe, em seguida, coloque a janela em uma superfície limpa, como um tapete de grade de borracha, para secar.
4. Imagem de Fluorescência de Raios-X das Células
- Uma vez que a amostra esteja seca, verifique a presença de células nas janelas usando um microscópio leve.
- Use esmalte para fixar as janelas em um suporte de alumínio fornecido pela linha de vigas.
- Insira o suporte de alumínio em um suporte cinemático e, em seguida, coloque-o em posição no ponto focal da óptica no microscópio de raios-X, e em um ângulo de cerca de 45° para o feixe de raios-X incidente, montado para os estágios de nanoposicionamento da amostra.
- Saia da área do instrumento do microscópio de raios-X (geralmente uma cabana feita de paredes de chumbo) e abra o obturador. Conduza as etapas restantes remotamente.
- Usando uma placa de zona, ou espelhos Kirkpatrick-Baez, concentre o feixe de raios-X monocromático (geralmente 10 keV em energia) até um tamanho de ponto de sub-mícnico.
- Usando os estágios da amostra de nanoposicionamento e visualizando a posição do feixe de raios-X na amostra com uma câmera cintilante pré-calibrada a jusante, determine a largura e altura apropriadas do raster scan para capturar dados da amostra.
- Com o detector de deriva de silício dispersivo de comprimento de onda a 90° para o feixe de incidente, e cerca de 3 mm ou menos da amostra, colete um espectro de teste com um tempo de 1 a 2 segundos.
- Visualizando o espectro de teste, escolha um tempo de moradia adequado para a varredura, para fornecer sinal-a-ruído suficiente para os elementos de interesse.
- Escolha uma resolução apropriada para a digitalização, que não seja significativamente menor do que o tamanho do feixe na amostra, nem maior do que as características de interesse da amostra.
- Programe a varredura no software de digitalização e colete a imagem.
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A espectroscopia de fluorescência de raios X, ou XRF, é uma técnica analítica não destrutiva usada para realizar análises elementares de amostras à temperatura ambiente.
O XRF pode ser aplicado a uma ampla gama de amostras, incluindo biológicas, forenses, ambientais e até mesmo obras de arte. As amostras também podem assumir uma variedade de formas, como pós, cristais e líquidos. No XRF, uma amostra é bombardeada com um feixe de raios-X, fazendo com que ela emita raios-X secundários com uma energia mais baixa, que são chamados de radiação fluorescente.
Embora seja referido como uma técnica de fluorescência, o XRF difere da microscopia de fluorescência tradicional por não usar luz visível de baixa energia ou moléculas ativas de luz.
Este vídeo apresentará os fundamentos do XRF e demonstrará como coletar mapas elementares de uma amostra biológica.
Quando um fóton de energia suficiente colide com um átomo, a energia é absorvida, excitando um dos elétrons da camada externa. À medida que o elétron relaxa, ele emite um fóton secundário, normalmente de menor energia. Este processo é conhecido como fluorescência. Ao contrário dos fótons de baixa energia, como os usados na microscopia de fluorescência, os fótons de raios-X são energéticos o suficiente para expelir completamente os elétrons firmemente presos de uma camada interna. Um elétron de uma camada de energia mais alta cairá na vacância. Um fóton proporcional à diferença de energia entre as duas camadas é liberado. Cada elemento emite um conjunto único de fótons, ou espectro, que pode ser usado para identificar o elemento e determinar a quantidade presente. Esse fenômeno é conhecido como fluorescência de raios-X.
Uma vez que um espectro elementar tenha sido coletado, os sinais de elementos de interesse podem ser isolados. As medições podem ser feitas em vários locais em uma amostra, gerando uma imagem, um pixel de cada vez. Esse processo é conhecido como varredura raster. Imagens de todos os elementos de interesse podem ser geradas posteriormente. Esses mapas elementares fornecem informações valiosas sobre a amostra. Com uma compreensão do XRF, agora você está pronto para preparar uma amostra de célula biológica para gerar mapas elementares.
Para começar, primeiro prepare e esterilize uma janela de nitreto de silício, que manterá a amostra no lugar para a varredura. Tenha cuidado, pois são muito frágeis. Oriente a janela de forma que fique com o lado plano para cima. Em seguida, coloque a janela em um prato de cultura e cole-o ao prato usando pequenos pedaços de fita adesiva.
Finalmente, esterilize a janela de nitreto de silício com radiação UV por 1 hora.
Agora que a janela foi esterilizada, a amostra pode ser fixada nela. Primeiro, segure o prato de cultura em um ângulo e adicione mídia na lateral do prato. Alivie lentamente a inclinação para revestir a janela. Adicione células ao prato da mesma maneira e incube.
Observe periodicamente as células sob um microscópio óptico até que estejam prontas para uso.
Em uma capela de fluxo laminar, aspire suavemente o meio do prato.
Em seguida, enxágue as células com solução salina tamponada com fosfato para remover o excesso de meio.
Aspire o PBS e fixe as células com paraformaldeído. Após 20 min, remova a mistura e descarte como lixo perigoso.
Remova a janela do prato e seque rapidamente as bordas e o recuo traseiro da janela com um Kimwipe. Coloque a janela em uma superfície limpa para secar.
Quando a amostra estiver seca, verifique a presença de células na janela com um microscópio óptico.
Usando esmalte transparente, prenda a janela a um suporte de alumínio.
Insira o suporte de amostra no suporte do instrumento e, em seguida, coloque o suporte no posicionamento dos microscópios de raios-X stage.
Posicione a janela de amostra no ponto focal da óptica do microscópio de raios X, com um ângulo de 45 graus em relação ao feixe incidente.
Saia da área do instrumento e conduza as etapas restantes remotamente para minimizar a exposição aos raios X.
Abra o obturador e use a óptica para focar o feixe de raios-X monocromático até um tamanho de ponto submicrométrico.
A posição do ponto pode ser fotografada com uma câmera pré-calibrada. Usando os estágios de posicionamento, determine a largura e a altura apropriadas necessárias para varrer a amostra.
Colete um espectro de teste do elemento de interesse com um tempo de permanência de 1 ? 2 segundos.
No espectro de teste, escolha um tempo de varredura apropriado para fornecer uma relação sinal-ruído suficiente para os elementos de interesse.
Em seguida, determine a resolução necessária para a amostra. A resolução deve ser menor que os recursos de interesse, mas maior que o tamanho do ponto. Por fim, programe a digitalização no software de digitalização e colete a imagem.
Neste experimento, um mapa elementar de uma célula foi realizado para vários elementos diferentes. Muitos metais, como cobre, ferro e zinco, são nutrientes importantes na célula e foram claramente identificados dentro da célula.
Ao determinar onde cada metal é encontrado na célula, informações valiosas podem ser elucidadas sobre seus processos celulares normais. Além disso, as doenças baseadas em metais podem ser compreendidas.
A fluorescência de raios X é usada em uma ampla gama de campos científicos. A natureza não destrutiva do XRF permite seu uso no estudo de artefatos históricos. Os historiadores da arte utilizam a técnica para determinar os pigmentos originalmente usados em obras de arte. Isso pode elucidar informações sobre a obra, como a proveniência, as cores que desbotaram com o tempo e a autenticidade. Os cientistas forenses também usam XRF na investigação da cena do crime. Quando uma arma é disparada, a área circundante é revestida com resíduos de tiros. O resíduo de tiro contém pólvora, primer de ignição e metal do invólucro e da bala. As informações coletadas com XRF podem identificar o culpado e a arma usada.
Outro campo de estudo que se presta à fluorescência de raios-X é a paleontologia. Aqui, informações elementares são coletadas de um fóssil de trilobita, um artrópode marinho que viveu há mais de 250 milhões de anos.
Ao caracterizar a composição elementar dos fósseis, novas informações podem ser obtidas sobre a longa vida extinta. Amostras mais bem preservadas podem até fornecer a composição de tecidos moles que se deterioraram há muito tempo.
Você acabou de assistir à introdução de JoVE à fluorescência de raios-X. Agora você deve entender a teoria da espectroscopia de raios-X e como coletar informações elementares de uma ampla gama de fontes.
Obrigado por assistir!
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Q1: How does X-ray fluorescence differ from traditional fluorescence microscopy?
XRF uses high-energy X-ray photons that expel tightly held electrons from inner shells, whereas traditional fluorescence microscopy uses lower-energy visible light and light-active molecules. X-ray photons are energetic enough to cause inner-shell ionization, producing characteristic fluorescent radiation unique to each element that enables elemental identification and quantification.
Q2: What happens when an X-ray photon collides with an atom in XRF?
A high-energy X-ray photon expels an electron from an inner shell of the atom. An electron from a higher-energy shell then falls into the vacancy, releasing a secondary photon proportional to the energy difference between the two shells. This emitted photon is characteristic of the specific element and forms the basis of elemental identification.
Q3: What types of samples can be analyzed using X-ray fluorescence?
XRF can be applied to biological, forensic, environmental, and art samples in various forms including powders, crystals, and liquids. The non-destructive nature of XRF makes it ideal for analyzing historical artifacts, crime scene evidence, and paleontological fossils without damaging the original material.
Q4: How are elemental maps generated in XRF analysis?
Once an elemental spectrum is collected, signals of elements of interest are isolated and measured at multiple locations across a sample through raster scanning. This pixel-by-pixel process generates images for all elements of interest, producing elemental maps that reveal the spatial distribution and concentration of specific elements within the sample.
Q5: Why is sample preparation important before XRF analysis of biological cells?
Proper sample preparation ensures cells adhere securely to the silicon nitride window and remain intact during analysis. Sterilization with UV radiation, fixation with paraformaldehyde, and careful handling prevent contamination and cell damage, enabling accurate elemental mapping and reliable identification of metals like copper, iron, and zinc within cellular structures.
Q6: What information can forensic scientists obtain from XRF analysis of gunshot residue?
Gunshot residue contains gunpowder, ignition primer, and metal from the casing and bullet. XRF identifies the elemental composition of this residue, providing information that can identify the culprit and weapon used in crime scene investigations through the characteristic metal signatures present in the residue.
Q7: How does XRF contribute to understanding paleontological specimens?
By characterizing the elemental composition of fossils using XRF, researchers gain new information about long-extinct life forms. Better-preserved samples can reveal the elemental composition of soft tissues that deteriorated millions of years ago, providing insights into ancient organisms and their biological processes.