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A espectroscopia de fluorescência de raios X, ou XRF, é uma técnica analítica não destrutiva usada para realizar análises elementares de amostras à temperatura ambiente.
O XRF pode ser aplicado a uma ampla gama de amostras, incluindo biológicas, forenses, ambientais e até mesmo obras de arte. As amostras também podem assumir uma variedade de formas, como pós, cristais e líquidos. No XRF, uma amostra é bombardeada com um feixe de raios-X, fazendo com que ela emita raios-X secundários com uma energia mais baixa, que são chamados de radiação fluorescente.
Embora seja referido como uma técnica de fluorescência, o XRF difere da microscopia de fluorescência tradicional por não usar luz visível de baixa energia ou moléculas ativas de luz.
Este vídeo apresentará os fundamentos do XRF e demonstrará como coletar mapas elementares de uma amostra biológica.
Quando um fóton de energia suficiente colide com um átomo, a energia é absorvida, excitando um dos elétrons da camada externa. À medida que o elétron relaxa, ele emite um fóton secundário, normalmente de menor energia. Este processo é conhecido como fluorescência. Ao contrário dos fótons de baixa energia, como os usados na microscopia de fluorescência, os fótons de raios-X são energéticos o suficiente para expelir completamente os elétrons firmemente presos de uma camada interna. Um elétron de uma camada de energia mais alta cairá na vacância. Um fóton proporcional à diferença de energia entre as duas camadas é liberado. Cada elemento emite um conjunto único de fótons, ou espectro, que pode ser usado para identificar o elemento e determinar a quantidade presente. Esse fenômeno é conhecido como fluorescência de raios-X.
Uma vez que um espectro elementar tenha sido coletado, os sinais de elementos de interesse podem ser isolados. As medições podem ser feitas em vários locais em uma amostra, gerando uma imagem, um pixel de cada vez. Esse processo é conhecido como varredura raster. Imagens de todos os elementos de interesse podem ser geradas posteriormente. Esses mapas elementares fornecem informações valiosas sobre a amostra. Com uma compreensão do XRF, agora você está pronto para preparar uma amostra de célula biológica para gerar mapas elementares.
Para começar, primeiro prepare e esterilize uma janela de nitreto de silício, que manterá a amostra no lugar para a varredura. Tenha cuidado, pois são muito frágeis. Oriente a janela de forma que fique com o lado plano para cima. Em seguida, coloque a janela em um prato de cultura e cole-o ao prato usando pequenos pedaços de fita adesiva.
Finalmente, esterilize a janela de nitreto de silício com radiação UV por 1 hora.
Agora que a janela foi esterilizada, a amostra pode ser fixada nela. Primeiro, segure o prato de cultura em um ângulo e adicione mídia na lateral do prato. Alivie lentamente a inclinação para revestir a janela. Adicione células ao prato da mesma maneira e incube.
Observe periodicamente as células sob um microscópio óptico até que estejam prontas para uso.
Em uma capela de fluxo laminar, aspire suavemente o meio do prato.
Em seguida, enxágue as células com solução salina tamponada com fosfato para remover o excesso de meio.
Aspire o PBS e fixe as células com paraformaldeído. Após 20 min, remova a mistura e descarte como lixo perigoso.
Remova a janela do prato e seque rapidamente as bordas e o recuo traseiro da janela com um Kimwipe. Coloque a janela em uma superfície limpa para secar.
Quando a amostra estiver seca, verifique a presença de células na janela com um microscópio óptico.
Usando esmalte transparente, prenda a janela a um suporte de alumínio.
Insira o suporte de amostra no suporte do instrumento e, em seguida, coloque o suporte no posicionamento dos microscópios de raios-X stage.
Posicione a janela de amostra no ponto focal da óptica do microscópio de raios X, com um ângulo de 45 graus em relação ao feixe incidente.
Saia da área do instrumento e conduza as etapas restantes remotamente para minimizar a exposição aos raios X.
Abra o obturador e use a óptica para focar o feixe de raios-X monocromático até um tamanho de ponto submicrométrico.
A posição do ponto pode ser fotografada com uma câmera pré-calibrada. Usando os estágios de posicionamento, determine a largura e a altura apropriadas necessárias para varrer a amostra.
Colete um espectro de teste do elemento de interesse com um tempo de permanência de 1 ? 2 segundos.
No espectro de teste, escolha um tempo de varredura apropriado para fornecer uma relação sinal-ruído suficiente para os elementos de interesse.
Em seguida, determine a resolução necessária para a amostra. A resolução deve ser menor que os recursos de interesse, mas maior que o tamanho do ponto. Por fim, programe a digitalização no software de digitalização e colete a imagem.
Neste experimento, um mapa elementar de uma célula foi realizado para vários elementos diferentes. Muitos metais, como cobre, ferro e zinco, são nutrientes importantes na célula e foram claramente identificados dentro da célula.
Ao determinar onde cada metal é encontrado na célula, informações valiosas podem ser elucidadas sobre seus processos celulares normais. Além disso, as doenças baseadas em metais podem ser compreendidas.
A fluorescência de raios X é usada em uma ampla gama de campos científicos. A natureza não destrutiva do XRF permite seu uso no estudo de artefatos históricos. Os historiadores da arte utilizam a técnica para determinar os pigmentos originalmente usados em obras de arte. Isso pode elucidar informações sobre a obra, como a proveniência, as cores que desbotaram com o tempo e a autenticidade. Os cientistas forenses também usam XRF na investigação da cena do crime. Quando uma arma é disparada, a área circundante é revestida com resíduos de tiros. O resíduo de tiro contém pólvora, primer de ignição e metal do invólucro e da bala. As informações coletadas com XRF podem identificar o culpado e a arma usada.
Outro campo de estudo que se presta à fluorescência de raios-X é a paleontologia. Aqui, informações elementares são coletadas de um fóssil de trilobita, um artrópode marinho que viveu há mais de 250 milhões de anos.
Ao caracterizar a composição elementar dos fósseis, novas informações podem ser obtidas sobre a longa vida extinta. Amostras mais bem preservadas podem até fornecer a composição de tecidos moles que se deterioraram há muito tempo.
Você acabou de assistir à introdução de JoVE à fluorescência de raios-X. Agora você deve entender a teoria da espectroscopia de raios-X e como coletar informações elementares de uma ampla gama de fontes.
Obrigado por assistir!
