Name: A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprenda a identificar neurônios dopaminérgicos vivos em culturas mesencefálicas usando expressão de eGFP e sequenciamento de RNA. Este método permite análises de expressão gênica e eletrofisiologia em células individuais.

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Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (DA017279, AG033954, DA037743), da Fundação Michael J. Fox e da Iniciativa de Inovação Caltech, financiando o Laboratório de Genética e Genômica Millard e Muriel Jacobs no Instituto de Tecnologia da Califórnia. Agradecemos a Brian Williams por otimizar o protocolo da biblioteca RNA-Seq e por fornecer assistência. Agradecemos a Henry Amrhein pelo treinamento computacional. Agradecemos a Barbara J. Wold pelo uso de seu equipamento e espaço de laboratório. Agradecemos a Igor Antoshechkin pelo sequenciamento da biblioteca e pelo gerenciamento das instalações.

<ol><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+nicotine+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).</li>
<li>Marinov, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single-cell+to+cell-pool+transcriptomes%3A+stochasticity+in+gene+expression+and+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing.</a> Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+changes+in+lncRNA+expression+during+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Gertz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposase+mediated+construction+of+RNA-seq+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transposase mediated construction of RNA-seq libraries.</a> Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubator+embedded+cell+culture+imaging+system+%28EmSight%29+based+on+Fourier+ptychographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy.</a> Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).</li>
<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dryanovski, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+entry+and+alpha-synuclein+inclusions+elevate+dendritic+mitochondrial+oxidant+stress+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons.</a> J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).</li>
<li>Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+Action+Potential+Shape+and+Burst-Frequency+Firing+by+BK+and+Kv2+Channels+in+Substantia+Nigra+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons.</a> J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui nós isolar células individuais de uma população heterogênea, utilizando uma etiqueta fluorescente, em seguida, estudar cada célula com uma única célula de RNA-seq. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos, de facto, com base na presença dos três transcritos de genes relacionados com DA seguintes, TH, DDC e SLC6A3. Todas as células positivas TH-EGFP expressa estes três genes como avaliado pela RNA-Seq. Este foi concordante com os estudos eletrofisioló...

Doença de Parkinson (DP) é, uma doença neurodegenerativa incurável relacionada com a idade. A causa desta doença relativamente comum permanece mal compreendido. Há uma perda generalizada neuronal em todo o cérebro, com a degeneração neuronal acentuada de neurónios dopaminérgicos da substância negra (SNC), levando a características clínicas de diagnóstico de bradicinesia, rigidez e tremor. culturas mistas primárias contendo neurônios dopaminérgicos SNc são especialmente relevantes para a doença de Parkinson. Ventral tegmental Área (VTA) neurônios dopaminérgicos têm sido implicados na recompensa e vício. Ventral mesencefálico (VM) culturas embrionárias mistos primários contêm ambos os neurônios SNC ou a VTA dopaminérgico (DA) e neurônios GABAérgicos. VM culturas primárias podem ser úteis para ensaios de neuroproteção e para elucidar a vulnerabilidade selectiva dos neurónios dopaminérgicos. Não há nenhuma maneira confiável para identificar células dopaminérgicas na cultura com base na morfologia. Elere desenvolvemos técnicas para identificar e colher neurónios dopaminérgicos individuais e construir uma única célula, de alto rendimento bibliotecas RNA sequenciamento. Relatamos dados RNA transcriptoma representativos para única dopaminérgica e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Este protocolo pode ser utilizado para a neuroprotecção, a neurodegeneração, e os ensaios farmacológicos para estudar os efeitos de vários tratamentos no transcriptoma DA / GABA. Porque neurônios dopaminérgicos representam uma pequena minoria dos neurônios expressas em culturas primárias de VM, a capacidade de identificar com segurança esses neurônios em culturas que vivem permitirá uma gama avançada de estudos de uma única célula. Essas técnicas inovadoras facilitar avanços na compreensão dos mecanismos que ocorrem no nível celular e pode ter aplicações em outros lugares nos campos da biologia molecular e neuroscience.

<table><tbody><tr><td>Corporação Bioquímica Papain</td><td>Worthington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada LS003126 Hanks (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Soro Equino de Doador</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Medium: Meio neurobasal</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura que contêm uma forma estabilizada de L-glutamina, L-alanil-L-glutamina: GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td>Concentração final de 0,5 mM.</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50x solução estoque, 1x concentração final.</td></tr><tr><td>Pratos com fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek&nbsp; &nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L2020</td><td>Armazenado em -20 &graus; C em 20 e micro; L alíquotas</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I (DNase)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta azuis P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri rasa de 10 mm</td><td>VWR&nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 > C, incubadora</td><td></td><td></td><td></td>de 5% de umidade</tr><tr><td>16% paraformaldeído (PFA) Ciências de</td> <td>Microscopia Eletrônica&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Equitech&nbsp;</td><td>SD-0100HI</td><td>Solução estoque 100%, concentração final a 1%.</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica padrão</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps - 2x3 dentes</td><td>Fine Science Tools</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps - Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Solução tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td> Agulha de <td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G</td><td>BD Agulha PrecisionGlide</td><td>305167</td><td>100 agulhas</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Instrumento Sutter</td><td>modelo P-87</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador&nbsp;</td><td>Instrumento Sutter</td><td> Kit de sequenciamento MP-285</td><td></td></tr><tr><td>: Kit de RNA ultrabaixo SMARTer para sequenciamento</td><td>Illumina Clontech</td><td>634936</td><td>100 rnxs, incluindo Advantage2PCR Kit</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo (12 &micro; M): Oligonucleotídeo SMARTer IIA (12 &micro; M)</td><td></td><td></td> <td>Do Kit SMARTer&nbsp;</td></tr><tr><td>Transcriptase reversa (100 unidades)</td><td>SMARTcribe transcriptase</td><td></td> reversa <td>Do kit SMARTer&nbsp;</td></tr><tr><td>Primário 1</td><td>3' CDSIIa primer&nbsp;</td><td></td><td>Do SMARTer Kit</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS PCR primer</td><td></td><td>Do SMARTer Kit</td></tr><tr><td>50x 2 mistura de polimerase</td><td>50x Advantage 2 mistura</td><td></td> de polimerase <td>Do SMARTer Kit</td></tr><tr><td>10x tampão PCR</td><td>10x Advantage 2 tampão</td><td></td><td>PCR Do SMARTer Kit</td></tr><tr><td>RNA Spikes</td><td>ThermoFisher</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>Rack de resfriamento de PCR</td><td>IsoFreeze Rack de resfriamento de PCR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Preparação de Amostras de DNA</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 Amostras</td></tr><tr><td>de PCR master mix</td><td>Nextera PCR master mix (NPM)</td><td></td><td>Do Kit Nextera&nbsp;</td></tr><tr><td>Coquetel de primer PCR (PPC)&nbsp;</td><td>Coquetel de primer PCR Nextera (PPC)&nbsp;</td><td></td><td>Do Kit Fluorômetro Nextera</td></tr><tr><td></td><td>O kit Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer Sistema</td> de eletroforese <td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bioanalisador Agilent 2100.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Contas magnéticas: Agencourt AMPure&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>de limpeza de RNAse: Limpeza de RNAse Zap Ambion</td><td></td><td>AM9786</td><td>Tamanho 100 Folhas</td></tr><tr><td>Qubit ds HS Kit de Ensaio</td><td>Sondas moleculares&nbsp;</td><td>Q32854</td><td>500 ensaios</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel: Kit de extração de gel Qiaquick</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidro</td> <td>(Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm o.d.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (ou equivalente)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequenciador</td><td>Illumina HiSeq instrumento</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT tirosina hidroxilase-eGFP cepa de camundongo&nbsp;</td><td></td><td>Número de estoque MMRRC: 000292-UNC</td><td>Stock Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat / Mutant Mouse Regional Research Center</td></tr></tbody></table>

a identificação fiável de vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo usando rna sequenciamento e th-driven-promotor egfp expression

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html> Na doença de Parkinson (DP) não há perda neuronal generalizada em todo o cérebro com a degeneração dos neurónios dopaminérgicos pronunciada no Snc, levando a bradicinesia, rigidez e tremores. A identificação dos que vivem neurônios dopaminérgicos em culturas primárias Ventral mesencefálico (VM) usando um marcador fluorescente fornece uma forma alternativa para estudar a vulnerabilidade seletiva desses neurônios sem depender da imunocoloração das células fixas. Aqui, isolamos, dissociar e cultura rato neurônios VM para 3 semanas. Em seguida, identificar os neurónios dopaminérgicos em culturas usando eGFP fluorescência (conduzido por um promotor Tirosina Hidroxilase (TH)). neurónios individuais são colhidas em tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidro. A seguir, lisar as células colhidas, e realizar a síntese de cDNA e &quot;tagmentation&quot; mediada por transposão para produzir bibliotecas de ARN-Seq monocelulares 1, 2,ass = &quot;xref&quot;&gt; 3, 4, 5. Depois de passar uma verificação de controlo de qualidade, as bibliotecas de uma única célula são sequenciados e subsequente análise é realizada para medir a expressão do gene. Nós relatamos resultados transcriptoma para dopaminérgico individual e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que foram colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos. Essas técnicas terão vastas aplicações em neurociência e biologia molecular.

Aqui relatamos um protocolo para a cultura de neurónios do mesencéfalo ventral de um ratinho que expressam eGFP accionado por uma sequência de promotor de tirosina-hidroxilase, colhendo neurónios fluorescentes individuais a partir das culturas, e medindo a sua transcriptoma de ARN utilizando ARN-SEQ (Figura 1). Os dados mostraram que 100% das células TH-eGFP-positivos que foram colhidas e sequenciados eram neurónios dopaminérgicos, com base na presença dos três transcrit...

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar de forma confiável neurônios dopaminérgicos vivos em culturas de mesencéfalo usando a expressão de eGFP impulsionada por tirosina hidroxlase, colheita de célula única e geração de biblioteca de sequenciamento de RNA. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da doença de Parkinson e da dependência de drogas, pois possibilita a realização de ensaios de expressão gênica e eletrofisiológicos em neurônios dopaminérgicos vivos identificados em cultura. A vantagem dessa técnica é que ela fornece um meio de identificar de forma confiável neurônios dopaminérgicos vivos, em vez de fixos, em culturas mesencefálicas ventrais primárias.Demonstrando a primeira parte do procedimento estará Charlene Kim, uma técnica do laboratório de Henry Lester. Comece estabilizando a cabeça de um embrião de camundongo com uma pinça firmemente colocada no focinho, de modo que a superfície dorsal fique acessível. Usando uma pinça segurada na outra mão, aperte a camada de pele e o crânio logo antes da crista do mesencéfalo e retire a pele e o crânio ao longo da linha média.Coloque a pinça ao redor da crista com uma ponta entre o córtex e o mesoncéfalo e a outra sobre o cerebelo. Aperte e remova todo o mesencéfalo. Coloque o mesencéfalo em uma placa de Petri com HBSS frio sob um microscópio de dissecação.Sob o microscópio de dissecação, vire o segmento cerebral para que o lado ventral esteja agora acessível. Existem agora quatro quadrantes visíveis. Remova todas as meninges e vasculaturas segurando suavemente as meninges com uma pinça e puxando para cima, afastando-as do cérebro.Em seguida, coloque uma pinça de pinça no ventrículo aproximadamente no centro do segmento. Em seguida, para separar o mesencéfalo, faça uma pitada dorsalmente e, em seguida, aperte medialmente de cada lado. Pegue os dois quadrantes inferiores fazendo cortes laterais em ambos os lados.A área tegmental ventral e a substância negra pars compacta estão na seção inferior ventral, que parece densa. Colocar o tecido dissecado contendo o VTA e o SNC em HBSS fresco numa área separada da placa de Petri. Depois de dissecar todos os segmentos cerebrais, use uma pinça e um bisturi número 11 para dividir cada seção do mesencéfalo em pedaços de tamanho aproximadamente igual.Em seguida, use uma ponta de pipeta P1000 de diâmetro largo para transferir todos os segmentos do mesencéfalo esquartejados para um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de deixar o tecido assentar e remover o HBSS, adicione 500 microlitros de solução de papaína. Incube em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos.Após a incubação, use uma ponta P1000 de diâmetro largo para transferir apenas os segmentos do mesencéfalo para uma alíquota de um mililitro de solução de DNase I e permitir que os segmentos se depositem no fundo do tubo. Em seguida, transfira apenas os segmentos do mesencéfalo para um tubo de 15 mililitros contendo um mililitro de solução de parada a frio. Substitua o segundo enxágue por um mililitro de solução de parada fresca e pipete para cima e para baixo sete vezes com uma ponta de pipeta P1000 para triturar as células.Em seguida, subjazia a suspensão celular pipetando lentamente 200 microlitros de solução de 4% BSA no fundo do tubo. Após centrifugação a 280 x g durante seis minutos, aspirar o sobrenadante com um P1000 e ressuspender as células num mililitro de meio de plaqueamento. Realize uma contagem de células usando hemocitômetro e, em seguida, dilua a suspensão celular para 1000 células por microlitro com meio de plaqueamento.Coloque 120 microlitros da suspensão celular em placas de cultura revestidas com poli-D-lisina, poli-L-ornitina e laminina imediatamente após a aspiração da laminina, para garantir que o revestimento não seque e forme uma superfície irregular. Em seguida, após uma hora de incubação, adicione cuidadosamente três mililitros de meio de cultura a uma área não semeada da placa de cultura para minimizar a ruptura das células. Após três semanas de cultura, lave a placa de cultura com dois mililitros de PBS de Dulbecco sem RNase.Remova o DPBS. Em seguida, substitua por um mililitro de DPBS fresco para a colheita. Use o conjunto de filtros GFP e a objetiva 40X em um microscópio de epifluorescência invertida para identificar neurônios TH positivos fluorescentes nas culturas.Use o micromanipulador para a pipeta sobre o soma celular. Em seguida, use um tubo de plástico preso à porta lateral do suporte da micropipeta para aplicar uma sucção suave a fim de aspirar o neurônio para dentro da micropipeta de vidro. Remova imediatamente a micropipeta contendo a célula da solução de banho e coloque a ponta dentro de uma coleção de tubos de PCR de 0,2 mililitros contendo tampão de reação.Quebre a ponta contra a lateral do tubo perto do fundo. Em seguida, coloque uma agulha de seringa estéril de calibre 21 na parte de trás da micorpipeta e aplique pressão para expelir o fluido restante da ponta quebrada da micropipeta. Centrifugue o tubo de coleta por cinco segundos usando uma microcentrífuga de mesa e congele-o em gelo seco.Enquanto trabalha no gabinete de PCR com reagentes no gelo ou em um bloco de resfriamento, prepare a primeira mistura mestre de cepas mais 10% de volume adicional à temperatura ambiente. E um microlitro de três primers primários e um microlitro de picos de RNA quantificados para a amostra. Em seguida, incube a amostra no termociclador por três minutos a 72 graus Celsius e, em seguida, coloque as amostras diretamente no rack do resfriador de PCR.Em seguida, adicione 5,5 microlitros da mistura principal preparada ao tubo de reação em um rack de resfriamento de PCR e misture pipetando suavemente. Depois de centrifugar o tubo por cinco segundos, incubar em um termociclador ajustado para os parâmetros agora mostrados na tela. Para purificar o cDNA da primeira fita, adicione 25 microlitros de esferas magnéticas à temperatura ambiente em vórtice à amostra.Misture pipetando todo o volume para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Em seguida, incube em temperatura ambiente por oito minutos para permitir que o cDNA se ligue às contas. Em seguida, coloque as amostras e as esferas magnéticas no dispositivo de separação magnética até que o líquido pareça completamente claro e não haja mais contas no sobrenadante.Aspire e descarte o sobrenadante. Gire a amostra por cinco segundos para coletar o líquido da lateral do tubo. Coloque as amostras no dispositivo de separação magnética por 30 segundos.Em seguida, remova todo o sobrenadante restante com o pipetador P10 para deixar apenas as contas com DNA ligado. Adicione 50 microlitros da mistura mestre de PCR ds-cDNA e, em seguida, execute o programa de PCR de síntese da segunda fita para obter o cDNA de fita dupla. Este histograma mostra o número de genes codificadores de proteínas detectados em bibliotecas de sequenciamento de RNA dopaminérgico de célula única geradas a partir de células positivas para TH-eGFP em fragmentos por quilobase de transcrição por milhão de leituras mapeadas.6.000 a 8.000 genes de proteínas foram detectados nas bibliotecas de células únicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro a cinco semanas, incluindo o tempo para derivar as células, permitir a maturação das células em cultura, as etapas de coleta e geração de bibliotecas, o sequenciamento das bibliotecas e a análise preliminar. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter um espaço de trabalho livre de RNAse para a geração de biblioteca de busca de RNA e coleta de células, para manter técnicas estéreis por meio da cultura de células e fazer pipetas com diâmetro de tamanho apropriado para a coleta de células únicas.Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como usar um exaustor, evitar contato com a pele e os olhos, manter-se longe do calor e chamas abertas e usar roupas de proteção individual adequadas devem sempre ser tomadas. Após este procedimento, outros métodos, como expressão gênica e análise de rede gênica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como os tratamentos medicamentosos afetam a expressão de proteínas em células dopaminérgicas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Identificação de receptor de dopamina D1-alfa no núcleo accumbens é fundamental para esclarecer a disfunção do receptor D1 durante uma doença do sistema nervoso central. Realizamos um novela RNA em situ da hibridação do ensaio para visualizar moléculas de RNA única em uma área específica do cérebro.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

Um método para reativar células-tronco neurais quiescentes em explantas cerebrais de Drosophila cultivadas foi estabelecido. Usando este método, o papel dos sinais sistêmicos pode ser desacoplado a partir de sinais intrínsecos teciduais na regulação da quiescência de células-tronco neurais, entrada e saída.

Reativação de células-tronco neurais em explantes cerebrais de Drosophila cultivadas

Este protocolo descreve a cultura celular de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo humano, seguida de coloração imunológica e geração de perfis fenotípicos neuronais a partir de imagens microscópicas adquiridas de alto conteúdo, permitindo a identificação de variações fenotípicas devido a modulações genéticas ou químicas.

Perfil Fenotípico de Neurônios Dopaminérgicos do Mesencéfalo Derivados de Células-Tronco Humanas

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Este estudo apresenta um método robusto para isolar mRNAs axonais usando inserções de membrana porosas, possibilitando a separação total de neurônios vs. neuritos e a purificação de RNA. Combinado com o RTddPCR, a abordagem permite a quantificação absoluta de transcritos de baixa cópia, facilitando estudos de transporte de mRNA e tradução local com alta sensibilidade, reprodutibilidade e ampla aplicabilidade experimental.

Isolamento e Quantificação de MRNAs Axonais Usando Inserções de Membrana Porosa e RTddPCR

Aprenda a identificar neurônios dopaminérgicos vivos em culturas mesencefálicas usando expressão de eGFP e sequenciamento de RNA. Este método permite análises de expressão gênica e eletrofisiologia em células individuais.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression (Vídeo) | JoVE Journal

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

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