Name: Co-localização de marcadores de células de linhagem e o sinal de tomate (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de rastreamento de linhagem celular combinada com imunofluorescência para investigar a transformação de condrócitos em células ósseas em camundongos Rosa26 tdtomato/Cre. Este método permite visualizar simultaneamente o número, localização e estado de diferenciação das células progenitoras.

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Este estudo foi apoiado pelo DE025014 de concessão do NIH ao JQF.

Todos os protocolos foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Texas A &amp; M University College of Dentistry. Reprodução 1. animal <ol><li> Use três modelos animais neste estudo. Para investigar o destino dos condrócitos embrionárias na formação côndilo, primeiro uso Col10a1-Cre 15 ratos e passe com Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J) ratos para obter Col10a1- Cre e Rosa26 tdTomato ratinhos. Em seguida, atravessar esses camundongos com 2.3Col1a1-GFP ratos 16. Use Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; Ratinhos 2.3Col1a1-GFP para executar as experiências de rastreio linhagem celular (Figura 1B). </li><li> Para estudar o destino dos condrócitos pós-natal, siga o mesmo procedimento como no passo 1.1, mas usar o ERT2 agrecan-cre (Agg-Cre ERT2) 17,18 linha e manter a Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; Ratinhos 2.3Col1a1-GFP para executar as experiências de rastreio linhagem celular (Figura 1C). Injectar tamoxifeno no dia pós-natal 14. </li><li> Para combinar a linhagem celular de rastreamento técnica com imunofluorescência, atravessar ratos Agg-Cre ERT2 e camundongos Rosa26 tdTomato. Use ratinhos que transportam ambos os genes na experiência e injectar as tamoxifeno no dia pós-natal 3 (Figura 1D). </li></ol> 2. Preparação de Material <ol><li> Dissolve-se o pó de tamoxifeno em 10% de etanol e óleo de milho a 90% a uma concentração de 10 mg / ml. A dosagem para injecção é de 75 mg / kg. </li><li> Dissolve-se o pó de paraformaldeído (PFA) em PBS a uma concentração de 4%, com 2 M de hidrato de sódio para ajustar o valor do pH para 7,4. Use 4% de solução PFA para fixar o tecido (o côndilo mandibular e perna são usados ​​aqui) após o sacrifício. Devido à suatoxicidade, lidar com PFA na capa com luvas e uma máscara. </li><li> Dissolve-se o pó de EDTA em água destilada a uma concentração de 10%, com 2 M de hidrato de sódio para ajustar o valor do pH para 7,4. Use 10% EDTA a descalcificação do côndilo mandibular e perna. </li><li> Dissolve-se o pó de sacarose em PBS a concentrações de 15% e 30%. Use a solução de sacarose para desidratar o tecido após descalcificação. </li><li> Dissolve-se o pó de hialuronidase em PBS a uma concentração de 2 mg / ml, pH 5,0. Esta solução é para a recuperação de antigénio de imunofluorescência. </li><li> Utilizar um tubo de 1,5 ml para preparar uma solução de bloqueio que contém 3% de albumina de soro bovino (BSA) e soro de cabra a 20% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente. </li><li> Utilizar um tubo de 1,5 mL, para preparar uma solução de anticorpo primário que contém soro de cabra a 2% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente. A concentração do anticorpo primário é de 1: 400 para Runx2 e 1: 100 para DMP1. </li><li> Utilizar um tubo de 1,5 mL, para preparara solução de IgG de coelho como controlo para a coloração de imunofluorescência para evitar resultados positivos falsos. A solução contém soro de cabra a 2% em PBS. A concentração do IgG de coelho de controlo Runx2 é de 1: 400; para DMP1, 1: 100. Realizar o experimento e controle coloração simultaneamente. </li><li> Utilizar um tubo de 1,5 ml para preparar uma solução de anticorpo secundário que contém soro de cabra a 2% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente. Utilizar o anticorpo secundário com uma diluição de 1: 500. </li></ol> 3. Deslize Preparação para microscopia confocal (Lineage celular Rastreamento Apenas, nenhuma combinação com Imunofluorescência) <ol><li> Injectar tamoxifeno na-cre Agg ERT2 ratos em um ponto de tempo favorável. <ol><li> Em primeiro lugar, remover um mouse de sua gaiola. Em seguida, use o polegar eo dedo indicador esquerdo para agarrar a pele na parte de trás do rato e entregá-lo, expondo o abdômen. Use a mão direita para segurar a seringa. O ponto de entrada óptima para a injecção é a Left ou lado direito do hipogástrio, evitando o fígado e bexiga. </li><li> Manter a seringa paralelo com as pernas traseiras do mouse e injectar por via intraperitoneal. A dosagem para injecção é de 75 mg / kg. Os pesos dos ratos nas idades de 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas de idade são de aproximadamente 7-9 g, 11-13 g, e 16-18 g, respectivamente. </li></ol></li><li> Anestesiar os ratos com uma combinação Xilazina / Ketaset. <ol><li> Para preparar a solução de trabalho, em primeiro lugar diluir a xilazina e Ketaset com água destilada a uma concentração de 1 mg / ml e 5 mg / ml, respectivamente. Em seguida, misturar a xilazina e Ketaset em uma proporção de 1: 2. A dosagem para injecção é de 30 ul / g. </li><li> Injectar como no passo 3.1. Confirmar a anestesia por beliscar o tornozelo do mouse. O mouse é inconsciente, se não tem reação. </li></ol></li><li> Perfundir os ratos com PFA 4% após anestesia. <ol><li> Após o mouse perde a consciência, corrigir as quatro pernas do mouse em uma placa de entirely expor o abdômen. </li><li> Saturar o abdômen com etanol 70% e fazer uma excisão da parte inferior do abdómen para o pescoço ao longo da linha média. Comprima e, simultaneamente, puxa a pele para os lados laterais para revelar a membrana peritoneal. Use tesouras de dissecação para fazer uma excisão longitudinal. </li><li> Cortar e remover as costelas frente para expor o coração. Perfurar o coração do ventrículo esquerdo com uma seringa G 22, segure a seringa, e, simultaneamente, cortar uma abertura na aurícula direita. </li><li> Lentamente injetar a PFA 4%, o que é perfundido ao longo do sistema cardiovascular enquanto as ondas de sangue para fora do corte da aurícula direita. O volume do PFA para perfusão é de 1 ml / grama. Execute esta etapa em uma cabine de segurança biológica Classe I que é difícil-canalizado para o sistema de escape edifício. </li></ol></li><li> Retire a pele do rato e colocar todo o corpo para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml que contém 40 ml de 4% de PFA para fixar durante a noite a 4 ° C. </li><li>Use tesouras de dissecação e # 3 e # 5 fórceps para remover cuidadosamente a mandíbula e perna traseira do corpo e para remover os músculos e tendões na superfície. Execute esta etapa em uma cabine de segurança biológica Classe I que é difícil-canalizado para o sistema de escape edifício. </li><li> Cortar a mandíbula em duas peças na região distal do terceiro molar. Do mesmo modo, cortar o fémur e a tíbia, na parte média da diáfise os para expor a cavidade da medula óssea, a fim de acelerar a descalcificação. Colocar a parte que inclui o processo de côndilo e condilar e juntamente com a perna traseira em 40 ml de 10% de EDTA para descalcificar a 4 ° C durante 2 - 4 dias num tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. </li><li> Utilizar 50 ml de 15% de sacarose para desidratar o côndilo e pata traseira durante a noite a 4 ° C num tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. </li><li> Usar 30% de sacarose para desidratar o côndilo e pata traseira durante a noite a 4 ° C em um tubo de 50 ml de centrífuga de polipropileno. </li><li> Ao longo do plano sagital, incorporar a amostra comOutubro sobre a placa de corte na máquina de criocorte. <ol><li> Horizontalmente deitou a cabeça da mandíbula ou a pata traseira no molde de montagem. Mergulhe o tecido em outubro e deixá-lo na máquina criocorte até o outubro congela. </li><li> Monte o bloco de outubro sobre a placa de corte. Esperar por cerca de 15 minutos antes de cortar para garantir que o OCT é completamente congelado. </li></ol></li><li> Cortar a cabeça da mandíbula e perna em seções de 10 mícrons. Recolher as secções em lâminas e armazenar a -20 ° C. </li><li> Incubar as lâminas numa câmara de 37 ° C para remover a água antes da coloração. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com água destilada durante 5 minutos. </li><li> Limpe a água em torno de cada seção. Use uma caneta barreira hidrofóbica para circundar as seções e soltar DAPI ou solução de montagem anti-fade não-fluorescente dentro do círculo. Estabeleço com cuidado a tampa de deslizamento. </li></ol> 4. imuno coloração para Runx2 e DMP1 NOTA: O IgG controlo é necessário para coloração imuno-histoquímica para evitar sinais de falsos-positivos. A coloração para os grupos experimentais e de controlo necessita de ser realizados simultaneamente. <ol><li> Incubar as lâminas numa câmara de 37 ° C para remover a água antes da coloração. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com água destilada. </li><li> Use a caneta barreira hidrofóbica para circundar todas as seções no slide. A partir deste passo, adicionar toda a solução preparada para dentro do círculo para cobrir completamente as secções. </li><li> Trate as seções com hialuronidase em câmara húmida a 37 ° C durante 30 minutos. O volume da solução (em passos de 4,5 - 4,8) depende do tamanho da secção. Use 50 ml de solução para o côndilo e 100 ul para o osso longo. Lavar com PBST (PBS que contém 0,1% de Tween 20), três vezes. </li><li> Preparar e aplicar a solução de bloqueio a cada secção e incubar numa câmara húmida durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as seções com primárioA solução de anticorpo (Runx2 de coelho anti-rato, coelho ou anti-ratinho DMP1) a 4 ° C durante a noite. Lavar com PBS três vezes. </li><li> Incubam-se as secções com solução de anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho, Alexa Fluor 488) durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar com PBS três vezes. </li><li> Limpe a água ao redor da seção e soltar DAPI para dentro do círculo para cobrir a seção sobre o slide. Estabeleço com cuidado a tampa de deslizamento. </li></ol> 5. Microscopia Confocal <ol><li> Capturar imagens de células fluorescentes utilizando um microscópio confocal em comprimentos de onda que vão de 488 uM (verde) a 561 uM (vermelho). Tomar várias imagens empilhadas a 200 Hz (dimensões de 1.024 × 1.024) 19 utilizando 10X, 20X e 63X lentes. </li></ol>

<ol><li>Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+role+of+chondrocyte+apoptosis+in+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification.</a> Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).</li>
<li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li>
<li>Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+hypertrophic+chondrocyte%3A+microenvironmental+perspectives+on+apoptosis+and+survival+in+the+epiphyseal+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).</li>
<li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte-to-osteocyte+transformation+in+grafts+of+perichondrium-free+epiphyseal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage.</a> Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).</li>
<li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-differentiation+of+hypertrophic+chondrocytes+into+cells+capable+of+producing+a+mineralized+bone+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Miner%22%5BJournal%5D)">Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix.</a> Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts%3A+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li>
<li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).</li>
<li>Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-tracing+methods+and+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Lineage-tracing methods and the kidney.</a> Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).</li>
<li>Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lineage+tracing+to+study+kidney+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration.</a> Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+fate+of+hypertrophic+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes.</a> Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).</li>
<li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li>
<li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+Directly+Transform+into+Bone+Cells+in+Mandibular+Condyle+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth.</a> J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).</li>
<li>Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development%2C+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genet. 10 (12), (2014).</li>
<li>Purcell, P., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mighty+Chondrocyte%3A+No+Bones+about+It%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Mighty Chondrocyte: No Bones about It.</a> J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).</li>
<li>Gebhard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+Cre+recombinase+in+hypertrophic+cartilage+under+the+control+of+a+BAC-Col10a1+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter.</a> Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+the+expression+of+a+green+fluorescent+protein+transgene+in+differentiated+osteoblasts%3A+comparison+between+rat+type+I+collagen+and+rat+osteocalcin+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters.</a> Bone. 31 (6), 654-660 (2002).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteo-chondroprogenitor+cells+are+derived+from+Sox9+expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).</li>
<li>Henry, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+aggrecan-CreERT2+knockin+mice+for+inducible+Cre+activity+in+adult+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage.</a> Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).</li>
<li>Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+way+to+statistically+analyze+morphologic+changes+in+Dmp1-null+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes.</a> Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).</li>
<li>Pest, M. A., Beier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology%3A+Is+there+such+a+thing+as+a+cartilage-specific+knockout+mouse%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).</li>
<li>Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+growth+plate+hypertrophic+chondrocytes%3A+death+or+lineage+extension%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?</a> Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).</li>
<li>Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ScxCre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ScxCre transgenic mice.</a> Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+conditional+null+allele+for+Dmp1+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse.</a> Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).</li>
<li>Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMP1-targeted+Cre+expression+in+odontoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes.</a> J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).</li>
<li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).</li>
<li>Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tamoxifen+induces+rapid%2C+reversible+atrophy%2C+and+metaplasia+in+mouse+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach.</a> Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).</li>
<li>Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+murine+hepatic+steatosis+induced+by+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen.</a> Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).</li>
<li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreER%28T%29+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Devido às limitações tecnológicas, é sempre difícil de investigar o comportamento de células in vivo. No entanto, a técnica de linhagem celular de rastreamento está provando ser uma ferramenta poderosa para estudar biologia celular 7-9. Neste estudo, nós melhorar ainda mais este protocolo, combinando-a com a imunofluorescência. Deste modo, o destino da célula pode ser definido por vários marcadores relacionados, que alarga a aplicação do rastreio linhagem. Além disso, esta co-localização do sinal de ...

Durante o desenvolvimento, a formação de osso endocondral responde por mais de 80% do volume do esqueleto. Acredita-se que começa com a apoptose de condrócitos hipertróf icos. Subsequentemente, as células da medula óssea subjacente invadir e iniciar angiogénese, seguido por nova deposição óssea por marrow- óssea e células derivadas de periósteo 1,2. O destino de células de condrócitos hipertróficas (HCs), no entanto, tem sido um tema de debate durante décadas 3. Inicialmente, foram consideradas HCs ser o final da via de diferenciação de condrócitos, e a apoptose foi geralmente considerado para ser o destino final de HCs. Agora, alguns investigadores sugerem que pelo menos alguns HCs poderia sobreviver e contribuir para a formação de osso endocondral. Embora eles proposto que o crescimento dos condrócitos placa tinha a capacidade de transdiferenciar em osteoblastos com base em ultra-estrutura, coloração imuno-histoquímica, e estudos in vitro, 46, nenhum destes métodos were definitiva em condrócitos demonstrando contribuição para a linhagem dos osteoblastos. A técnica de linhagem celular de rastreamento fornece uma maneira mais rigorosa para estudar o destino celular. Resumidamente falando, uma enzima recombinase, o qual é expresso apenas em um tipo específico de célula, estimula a expressão do gene repórter. Desta forma, este tipo de célula e seus descendentes são permanentemente marcado 7. O sistema Cre-loxP é comumente usado no rastreamento de linhagem. Cre (a enzima recombinase) vai excisar a sequência de paragem entre os dois locais loxP e activar o repórter em uma linha celular específica (Figura 1A). Em alguns casos, o investigador pode escolher um ponto de tempo favorável para activar Cre usando uma droga, tal como tamoxifeno, causando Cre para fundir a uma forma modificada do receptor de estrogénio (Cre ERT2) 8. repórteres fluorescentes tornaram-se o padrão na linhagem rastreamento experimentos porque reduzem drasticamente a complexidadee melhorar a precisão e eficiência da célula destino traçado 8,9. tdTomato está se tornando a melhor escolha entre os repórteres fluorescentes uma vez que tem o mais brilhante proteína fluorescente ea epifluorescência mais forte, tornando-se facilmente visualizado 7 (Figura 1A). Ao utilizar o Rosa26 tdTomato linhagem sistema de detecção, o nosso grupo e outros investigadores mostraram que HCs pode alterar o seu fenótipo em células ósseas durante o desenvolvimento 10-14. Para conseguir isso, nós desenvolvemos dois conjuntos de rastreamento combinações com Rosa26 tdtomato (expressão omnipresente em todas as células) / Cre (específico para condrócitos) ratos: 2.3Col1a1-GFP (específico para osteoblastos) e imunofluorescência (específico para células ósseas). Os dados demonstram que ambos os métodos são meios viáveis para estudar o destino celular in vivo.

<table><tbody><tr><td>Tamoxifeno&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>ativar o evento Cre&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td>fixa a amostra</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10713</td><td>descalcifica o tecido duro</td></tr><tr><td>Sacarose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>desidrata o tecido</td></tr><tr><td>Hialuronidase de testículos bovinos&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>recupera antígeno para coloração imunoquímica</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Solução de bloqueio</td> <td>A3059</td></tr><tr><td>anticorpo primário para Runx2&nbsp;</td><td>Cell Signal</td><td>D1L7F</td><td>anticorpo primário para coloração imunoquímica</td></tr><tr><td>anticorpo primário para DMP1</td><td>fornecido pelo Dr. Chunlin Qin</td><td></td><td>anticorpo primário para coloração imunoquímica</td></tr><tr><td>anti-coelho IgG Sigma</td><td></td><td>18140</td><td>controle para coloração imunoquímica</td></tr><tr><td>anticorpo secundário&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>segundo anticorpo para coloração imunoquímica</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>incorpore a amostra para seção congelada</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>PBST</td></tr><tr><td>antifade mountant não fluorescente</td><td>Life technologies</td><td>P36934</td><td>lâminas de montagem</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life technologies</td><td>P36931</td><td>coloração nuclear</td></tr><tr><td>Caneta de Barreira Hidrofóbica</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>circunda a seção na lâmina para coloração imunoquímica&nbsp;</td></tr><tr>Anestesia <td>anaSed</td><td></td> <td>com xilazina</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketaset&nbsp;</td><td>anestesia Zoetis</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>máquina de criossecção</td><td>Leica</td><td>CM1860 Microscópio confocal UV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>DM6000 CFS&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

co-localização de marcadores de células de linhagem e o sinal de tomate

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

O sistema de rastreamento de linhagem celular foi usado predominantemente em estudos de biologia do desenvolvimento. A utilização da recombinase Cre permite a activação do repórter em uma linha celular específica e toda a progénie. Aqui, utilizou-se a linhagem de células rastreio técnica para demonstrar que os condrócitos transformar directamente em osteoblastos e os osteócitos durante ossos longos e desenvolvimento côndilo mandibular utilizando dois tipos de Cre, Col10a1-Cre e agrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), cruzados com Rosa26 tdTomato. Ambos Col10 e agrecano marcadores são bem reconhecido para condrócitos. Nesta base, nós desenvolvemos uma nova linhagem de células método de rastreio em conjunto com o destino celular imuno-fluorescente para definir por meio da análise da expressão de marcadores de células específicos. Runx2 (um marcador de células osteogênicas em início de carreira) e protein1 matriz de dentina (DMP1; um marcador para células em estágio final osteogênicos) foramutilizado para identificar as células de osso derivadas de condrócitos e o seu estado de diferenciação. Esta combinação não só amplia a aplicação de rastreio linhagem celular, mas também simplifica a geração de ratinhos compostos. Mais importante, os status de número, a localização e diferenciação de progênie de células-mãe são exibidos simultaneamente, fornecendo mais informações do que a linhagem celular de rastreamento sozinho. Em conclusão, a co-aplicação de técnicas de rastreio de linhagem celular e de imunofluorescência é uma ferramenta poderosa para investigar a biologia de células in vivo.

Condrócitos Diretamente transformar em células ósseas (osteoblastos e osteócitos) no Mandibular Condyle e Long Bone. Agrecano, um gene crítico para chondrogenesis, se expressa principalmente no início e maduros condrócitos 18. Como resultado, a injecção de tamoxifeno às 2 semanas de idade em Agg-Cre ERT2; Camundongos Rosa26 tdTomato activado o repórte...

Nós desenvolvemos dois conjuntos de rastreamento combinações em Rosa26 tdtomato (ubiquamente expressa em todas as células) / Cre (especificamente expresso em condrócitos) camundongos: um com 2.3Col1a1-GFP (específico para osteoblastos) e um com imunofluorescência (específico para células ósseas). Os dados demonstram a transformação directa de condrócitos em células ósseas.

Co-localização de marcadores de células de linhagem e o sinal de tomate

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

O objetivo geral dessa técnica de rastreamento de linhagem celular e da imunofluorescência subsequente é investigar a biologia celular e o destino celular in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia celular e desenvolvimento tecidual sobre a origem das células que formam o osso durante a endocondrogênese. A principal vantagem dessa técnica é mostrar simultaneamente o número, a localização e o estado de diferenciação da prole da célula fundadora, ampliando assim a aplicação do rastreamento de linhagem.Embora este método forneça uma visão sobre a transformação de condrócitos em células osteogênicas durante o desenvolvimento normal, ele também pode ser aplicado a outros tecidos e modelos de doenças, como a transformação celular em um tumor. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque o corte por congelamento é difícil e a seção pode facilmente destacar-se durante a coloração. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando pretendíamos demonstrar o estado de diferenciação de células osteogênicas transformadas a partir de condrócitos no osso trabecular.Para rastrear a linhagem de condrócitos hipertrófic

co-localization-of-cell-lineage-markers-and-the-tomato-signal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos.

Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Planta de conexões intercelulares, os dictiossomos (Pd), desempenham um papel central na planta de interações planta-vírus e fisiologia. Crítica para o transporte de Pd está classificando os sinais que dirigem proteínas à polícia. No entanto, nosso conhecimento sobre estas sequências é ainda em sua infância. Nós descrevemos uma estratégia para identificar sinais de localização de Pd em proteínas Pd-alvo.

Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

Este protocolo apresenta como viver a imagem e analisar os meristemas apical de tiro de diferentes espécies de plantas usando laser, microscopia confocal.

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in...

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Neste manuscrito, um protocolo é apresentado para executar a medida FACS-baseada da atividade transcricional de BK-Polyomavirus usando as pilhas HEK293T transfected com um plasmídeo bidirecional do repórter que expressa tdtomato e EGFP. Este método permite determinar quantitativamente a influência de novos compostos na transcrição viral.

Medição de BK-Polyomavirus não-codificação região controle driven transcriptional atividade via citometria de fluxo

Um protocolo para realizar o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos em um único nível celular usando a análise de mosaico com marcadores duplos (MADM). A análise clonal madm fornece uma estrutura quantitativa para medir o comportamento proliferativo, a saída celular e a relação de linhagem de progenitores individuais e suas células filhas.

Rastreamento de linhagem e análise clonal no desenvolvimento de córtex cerebral usando análise de mosaico com marcadores duplos (MADM)

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Este protocolo descreve a seleção de marcadores plasmodésmicos ideais para análises baseadas em microscopia confocal de direcionamento de proteínas para plasmodesmos durante interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal.

Análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em Nicotiana benthamiana

Aprenda a técnica de rastreamento de linhagem celular combinada com imunofluorescência para investigar a transformação de condrócitos em células ósseas em camundongos Rosa26 tdtomato/Cre. Este método permite visualizar simultaneamente o número, localização e estado de diferenciação das células progenitoras.

Co-localização de marcadores de células de linhagem e o sinal de tomate

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