Name: Um Experimental e Finite Element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a investigar o transporte de moléculas neutras e carregadas na cartilagem articular usando métodos experimentais e de elementos finitos. Este protocolo permite determinar coeficientes de difusão e densidade de carga fixa em diferentes zonas da cartilagem.

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Os autores gostariam de expressar sua gratidão ao Sr. Jeroen van den Berg e Mr. Matthijs Wassink do grupo mecânica de desenvolvimento, a UMC Utrecht por sua ajuda em processo dos plugues osteocondral envolvendo. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Holandesa Arthritis.

NOTA: O protocolo aqui apresentado é adotada a partir dos procedimentos experimentais e computacionais dos últimos trabalhos de investigação 6, 8, 9. O protocolo é ilustrada na Figura 1. Os materiais de cadáveres foram coletados com a permissão da Faculdade de Veterinária da Universidade de Utrecht. 1. Exemplo de Preparação e banho <ol><li> Furar tampões osteocondrais cilíndricas (diâmetro de 8,5 mm) a partir de côndilos femorais equino de cadáveres utilizando broca feito por medida (Figura 1) enquanto se pulverizava fresco fosfato-salino tamponado (PBS) para evitar o sobreaquecimento e subsequente lesão da cartilagem. </li><li> Termorretráctil as fichas osteocondrais com um plástico encolhimento manga para minimizar a difusão lateral do banho de sobreposição. <ol><li> Montar o tampão osteocondral com cartilagem no the topo inicialmente no interior da manga de plástico e encolhendo seguir por sopragem de ar quente a ela. Adicione os pedaços de algodão molhado na superfície da cartilagem para evitar danos causados ​​pelo calor-relacionado. </li></ol></li><li> Prepara-finitos banhos de (por exemplo, 650 mL, 420 mM, ioxaglato, peso molecular (MW) = 1.269 Da, carga = -1,) e neutro (650 mL, 420 mM, iodixanol, MW = 1550 Da) solutos carregados separadamente. </li><li> Carregar os finitos banhos preparados na superfície da cartilagem utilizando uma seringa e colocar um tampão de cortiça sobre a amostra para evitar a evaporação envolvido durante as experiências à temperatura ambiente (Figura 2A). Para estudar o transporte de soluto neutro, coloque o banho de iodixanol e estudar o banho ioxaglato lugar transporte de solutos com carga negativa na superfície da cartilagem. </li></ol> 2. Imagem e Processamento de Imagem <ol><li> Coloque as amostras embrulhadas isolados com tampão de cortiça sobre um suporte feito por medida ligada à platina motorizada de um micro-CT. lugar tele amostra de modo a que a superfície da cartilagem coberto com uma solução de agente de contraste é voltada para cima. </li><li> Digitalizar usando o micro-CT (tamanho de voxel de 40 × 40 × 40 m 3, o tempo de varredura de 2 min, voltagem do tubo de 90 kV e a corrente do tubo de 180 uA) um campo de visão que consiste em cartilagem, placa subcondral, e finito banho em vários pontos de tempo até que o estado de equilíbrio (48 h) é alcançado (Figura 2A). O estado de equilíbrio é conseguido quando os valores de concentração não mudam ao longo do tempo. </li><li> Registrar as imagens 3D em diferentes pontos de tempo com base na imagem inicial para facilitar o posicionamento da região de interesse (ROI) usando o software do fabricante (por exemplo, Analisar). </li><li> Converter a imagens 3D reconstruídas micro-CT em 2D Tagged Image File Format (TIFF) pilha antes de processá-los usando o software do fabricante. </li><li> Globalmente segmento (ImageJ&gt; Ajustar&gt; Limiar) a cartilagem do osso subcondral e sobrementindo banho no software. </li><li> Obter o valor de cinza média de cartilagem em momentos diferentes (ImageJ&gt; Analisar&gt; Measure) usando a máscara de cartilagem gerada na etapa anterior. </li><li> Dada a concentração do banho inicial e a concentração inicial do agente de contraste na cartilagem, usar uma curva de calibração linear para converter os valores de cinzentos médios para a concentração real de solutos. Os dados anteriores suportam o facto dos valores cinzentos manter uma relação linear com a concentração de agentes de contraste. </li><li> Traçar as concentrações do soluto em comparação com pontos de tempo experimentais. </li></ol> 3. Modelagem Computacional NOTA: A difusão em este problema é assumida para ter lugar em 1D (ao longo do eixo z), o que está em conformidade com a condição de contorno experimental. Portanto, a geometria poderia ser criado de forma arbitrária. <ol><li> Construção de modelos de cartilagem multi-zona com base finito-banho: 1) de cartilagem que consiste em zona superficial (20% da espessura total da cartilagem), zona média (50% da espessura total da cartilagem) e zona profunda (30% da espessura total da cartilagem) 12 e 2) finito-banho em Febio 13, 14 (Figura 2B). </li><li> Atribuir as propriedades mecânicas e físicas de diferentes zonas de cartilagem e casas de banho em Febio. assumiu-se o módulo de Young (10 MPa), para ser suficientemente elevada para resistir à pressão osmótica exercida pelo banho sobrejacente e, por conseguinte, protegem a cartilagem de deformações excessivas. <ol><li> Usar uma permeabilidade hidráulica de 10 -3 mm 4 / N e o coeficiente de Poisson de 0. Uso coeficiente de difusão de soluto real do banho nas simulações 8, 9. </li></ol></li><li> Gerar malha (8 elementos de nó trilinear hexaedro) e refinar que perto dos limites (Figura 2B)class = "xref"&gt; 8, 9. </li><li> modelo bifásico-soluto <ol><li> Aplicar concentração inicial de soluto na pressão banho e eficaz que lhe corresponde. Olhar para a descrição de uma pressão eficaz na 9, 15. </li><li> Executar o modelo no modo transiente para obter a concentração de soluto em relação curvas de tempo de acordo com os coeficientes de difusão previstos em diferentes zonas de cartilagem. </li></ol></li><li> modelo Multiphasic NOTA: A flutuação eléctrico entre o banho e o tecido pode ser contornado pela adição de dois monovalentes contra-iões tanto para o banho e o tecido. <ol><li> Para os modelos de estado estacionário: utilizar as mesmas pressões de fluido eficazes e concentrações em cartilagem e banho sobrejacente ao aumentar FCD ao seu valor desejado. </li><li> Para modelos transientes: criar um finito-banho, bem agitada, mantendo o coeficiente de difusão de soluto no banho suficientemente alta. Injectar asoluto a partir do interface de banho ao ar para dentro do banho de atingir o seu valor de concentração desejado. </li><li> Transitória: remover a condição de limite de concentração de soluto prescrito na etapa anterior e reverter o coeficiente de difusão do finito-banho para o seu coeficiente de difusão efectiva. </li><li> Executar o modelo para obter soluto curvas de concentrao-tempo com base em FCDS aplicadas e coeficientes de difusão em diferentes zonas de cartilagem. </li></ol></li><li> Interface Febio-MATLAB <ol><li> Desenvolver um código MATLAB para executar automaticamente simulação em Febio e traçadas curvas de concentração-tempo (interface de Febio-MATLAB) 8, 9. </li><li> Alterar coeficientes de difusão e FCDS em zonas de cartilagem usando a interface Febio-MATLAB. Executar modelos em Febio e extrai-se curvas de concentração-tempo soluto 8, 9. </li><li> Comparar o soluto obtido curvas de concentrao-tempo com a experimentalde dados e obter conjuntos de coeficientes de difusão e FCDS em diferentes zonas de cartilagem à base de raiz do erro quadrado médio mínimo (RMSE) 8, 9. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54984/54984fig1.jpg"> Figura 1: a instalação experimental. A) procedimento de extração de amostra usando uma broca feita sob medida. B) Procedimento de imagiologia Micro-CT para monitorar o processo de difusão. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54984/54984fig2.jpg"> Figura 2: Representação esquemática.A) O delineamento experimental. B) modelo computacional multi-zona que consiste no banho finito, zonas superficiais, média e profunda da cartilagem e malha associada. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós apresentamos um protocolo experimental combinado com um procedimento de modelação de elemento finito para o estudo da difusão de solutos neutros e carregados em toda a cartilagem articular. De acordo com nossos estudos recentes, os modelos propostos poderia descrever com precisão o transporte de ambos neutro (bifásica-soluto) e carregadas negativamente solutos (multifásicos) em diferentes zonas de cartilagem articular 8, 9. Acredita-se que a cartilagem artic...

<html> Transporte molecular desempenha um papel fundamental na homeostase de juntas de articulação, a entrega de agentes terapêuticos a cartilagem articular e processamento de imagem de contraste melhorada de cartilagem 1, 2, 3. Factores, tais como integração de cartilagem e intacto, a carga de soluto e tamanho, bem como a osmolalidade e concentração do banho em contacto com cartilagem podem influenciar a taxa de transporte 4, 5, 6. O transporte de solutos, quer neutros ou carregados, pode ser diferente entre as zonas de cartilagem articular, uma vez que cada zona consiste em diferentes concentrações e orientações das principais moléculas da matriz extracelular, ou seja, proteoglicanos (PGs) e colagénio de tipo II 1, 7, 8, 9,lass = &quot;xref&quot;&gt; 10, 11. Mais importante ainda, o transporte de solutos com carga pode ser altamente dependente da concentração de proteoglicanos que compreendem cargas negativas fixos no interior da matriz extracelular o que aumenta através da cartilagem articular 8, 9. Esses parâmetros de densidade de carga particularmente fixa (FCD), orientação das fibrilas de colagénio e variação do teor de água em toda a cartilagem pode ser submetido a alterações quanto a osteoartrite (OA) progride, significando, assim, a importância de se estudar a difusão através da cartilagem. No estudo actual, um protocolo com base em estudos experimentais e computacionais previamente estabelecidos 6, 8, 9 está propostos para investigar com precisão a difusão sob várias condições de contorno utilizando solutos neutros e carregados em um modelo finito-banho de difusão. Tele proposto métodos são compostas de micro-tomografia computadorizada de imagem (micro-CT) de um sistema incluindo cartilagem e um finito-banho suportado por avançado bifásica-soluto e modelos de elementos finitos multifásicas. Esses modelos permitem a obtenção dos coeficientes de difusão das moléculas neutras e carregadas, bem como FCDS através de várias zonas de cartilagem articular. Usando esses modelos, pode-se obter uma melhor compreensão do comportamento dos difusores moléculas neutras e carregadas que poderiam ser usados ​​para investigar as interações entre a cartilagem e sobrepondo finito-banho.

<table><tbody><tr><td>Hexabrix</td><td>Guerbet</td><td>15HX005D</td><td>Agente de contraste de carga negativa</td></tr><tr><td>Visipaque</td><td>GE saúde</td><td>12570511</td><td>Agente de contraste Nuetral</td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato)</td> <td>Tecnologias de vida</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td> médio <td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Monitoramento de difusão</td></tr><tr><td>Osmômetro de ponto de congelamento</td><td>Avançado instrumentos</td><td></td><td>Solução de medição de osmolalidade</td></tr></tbody></table>

um experimental e finite element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

<html> A osteoartrite (OA) é uma doença debilitante que está associada com a degeneração da cartilagem articular e osso subcondral. Degeneração da cartilagem articular prejudica a sua função de suporte de carga substancialmente uma vez que sofre uma tremenda degradação química, isto é a perda de proteoglicano e colagénio de fibrilas de interrupção. Uma via promissora para investigar mecanismos de dano químico durante OA é expor as amostras de cartilagem de um soluto externo e controlar a difusão das moléculas. O grau de dano de cartilagem (isto é, a concentração e a configuração de macromoléculas essenciais) está associada com a perda de energia de colisão de solutos externos enquanto se move através da cartilagem articular cria diferentes características de difusão em relação à cartilagem saudável. Neste estudo, nós apresentamos um protocolo, que é constituída por várias etapas e é baseado no desenvolvido anteriormente experimental micro-C14px; &quot;&gt; omputed T omography (micro-CT) e modelagem de elemento finito o transporte de moléculas iodados carregadas e não carregadas é primeiro registado utilizando micro-CT, o que é seguido pela aplicação de bifásica-soluto e multifásicas modelos de elementos finitos para obter os coeficientes de difusão. e fixa densidades de carga através das zonas de cartilagem.

Os resultados representativos fornecidas aqui são adotadas a partir de trabalhos de pesquisa anteriores 6, 8, 9, 16. Na OA, a cartilagem articular sofre alterações significativas mais importante perda de GAG, e colagénio de fibrilas de danos 17, <s...

Propomos um protocolo para investigar o transporte de moléculas carregadas e não carregadas através de cartilagem articular com a ajuda de métodos numéricos experimentais e recentemente desenvolvidos.

Um Experimental e Finite Element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar o transporte de moléculas carregadas e não carregadas através da cartilagem articular com o auxílio de métodos experimentais e numéricos. Este método pode ajudar a responder questões-chave relacionadas às propriedades físicas da cartilagem articular, como coeficiente de difusão e densidade de carga fixa em diferentes zonas. A principal vantagem desta técnica é que ela adota um modelo experimental de caminho finito, baseado em tomografia microcomputadorizada de transporte de moléculas radiopacas.Para iniciar a preparação da amostra, perfure um tampão osteocondral cilíndrico de 8,5 milímetros de diâmetro enquanto pulveriza solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente, PBS, na área de perfuração. Insira o plugue em um tubo termorretrátil de aproximadamente 2,5 centímetros de comprimento para que a camada óssea fique nivelada com a extremidade e, em seguida, cubra a superfície da cartilagem com algodão úmido. Em seguida, use uma pistola de ar quente para encolher a tubulação nas laterais do plugue.Carregue um volume finito de uma solução de ioxagalto ou iodixanol 420 milimolar na superfície da cartilagem dentro do tubo par

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Bioengineering

Bioengenharia

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Apresentamos um método para avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações murino intactas após a aplicação de cargas mecânicas controladas ou impactos. Esse método pode ser usado para investigar como osteoartrite, fatores genéticos e/ou regimes de carregamento diferentes afetam a vulnerabilidade dos condrócitos em situ .

Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

A sondagem durante a cirurgia de artroscopia é normalmente feita para avaliar a condição do tecido mole, mas essa abordagem sempre foi subjetiva e qualitativa. Este relatório descreve um dispositivo de sondagem que pode medir a resistência do tecido mole quantitativamente com um sensor de força tri-axial durante a artroscopia.

Um dispositivo de sondagem para medir quantitativamente as propriedades mecânicas dos tecidos moles durante a artroscopia

Este protocolo descreve a preparação, testes biotribológicos e análise de cilindros osteocondrais deslizando contra material de implante metálico. As medidas de desfecho incluídas neste protocolo são atividade metabólica, expressão genética e histologia.

Testes biotribológicos e Análise de Cartilagem Articular Deslizando contra Metal para Implantes

Este protocolo determina a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão de não-equilíbrio para portadores de peptídeos cationicos na cartilagem. A caracterização das propriedades de transporte é fundamental para garantir uma resposta biológica eficaz. Esses métodos podem ser aplicados para projetar um portador de drogas com carga ideal para direcionar tecidos carregados negativamente.

Caracterização das Propriedades de Transporte Intra-Cartilagem dos Transportadores de Peptídeos Cationic

Aqui, apresentamos o modelo de lesão da cartilagem intra-articular induzida por carga cíclica do joelho de rato, gerado por 60 compressões cíclicas acima de 20 N, resultando em danos à cartilagem condilar femoral em ratos.

Um Método Não Invasivo para Gerar o Modelo de Lesão da Cartilagem Intra-Articular Induzida por Carga Cíclica do Joelho de Rato

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

O presente protocolo descreve um dispositivo de teste de atrito que aplica deslizamento recíproco simultâneo e carga normal a dois contrafacetos biológicos de contato.

Um dispositivo de teste de atrito-bioreator para estudo de biomecânica articular sinovial, mecanobiologia e regulação física

Fornecemos métodos detalhados para gerar quatro tipos de tecidos a partir de células-tronco mesenquimais humanas, que são usadas para recapitular a cartilagem, osso, coxim gorduroso e sinóvia na articulação do joelho humano. Esses quatro tecidos são integrados em um biorreator personalizado e conectados através de microfluídica, gerando assim uma articulação do joelho em um chip.

Criação de uma articulação do joelho em um chip para modelagem de doenças articulares e testes de medicamentos

Apresentamos uma abordagem passo a passo para identificar e abordar os problemas mais comuns associados às micro-indentações por microscopia de força atômica. Exemplificamos os problemas emergentes em explantes de cartilagem articular humana nativa caracterizados por vários graus de degeneração impulsionada pela osteoartrite.

Abordando Questões Práticas em Micro-Indentação Baseada em Microscopia de Força Atômica em Explantes de Cartilagem Articular Humana

Aprenda a investigar o transporte de moléculas neutras e carregadas na cartilagem articular usando métodos experimentais e de elementos finitos. Este protocolo permite determinar coeficientes de difusão e densidade de carga fixa em diferentes zonas da cartilagem.

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Um Experimental e Finite Element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular

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