Protocolo experimental para Detectar Cianobactérias Em amostras líquidas e sólidas com um Microarray Chip Antibody

O objetivo geral deste procedimento é determinar a presença de várias cepas de cianobactérias em amostras líquidas e sólidas usando um imunoensaio de microarray de fluorescência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos ambiental, de monitoramento e de gestão da água, como a presença de toxinas produzidas por bactérias produtoras de protoxinas antes que as florações se tornem visíveis a olho nu. A principal vantagem dessa técnica é que várias cepas de cianobactérias e várias amostras podem ser monitoradas simultaneamente em um período de três, quatro horas, tanto in situ quanto em laboratório.

Portanto, esses métodos podem fornecer informações sobre a biodiversidade. Também pode ser aplicado a outros campos, como monitoramento de instalações agrícolas, detecção de vida em ambientes de tensão ou exploração planetária. Geralmente, os indivíduos novos neste método não terão dificuldades.

Devido à simplicidade no processamento da amostra e à mais fácil interpretação dos resultados. Depois de produzir e purificar os anticorpos de acordo com o protocolo de texto, adicione 100 microlitros de DMSO em um frasco comercial contendo corante para rotulagem, um miligrama de proteína. Assim que o corante estiver dissolvido, rotule os anticorpos purificados adicionando dois microlitros do corante a 50 microlitros de cada preparação de anticorpos.

Manter as reações de rotulagem à temperatura ambiente sob agitação contínua em uma plataforma vibratória por uma hora. Depois de purificar os anticorpos marcados de acordo com o protocolo de texto, carregar uma pequena alíquota em um espectrofotômetro e medir a absorbância em 280 e 650 nanômetros. Calcule as eficiências de rotulagem seguindo as recomendações do fornecedor.

Para fazer um CYANOCHIP, prepare 30 microlitros de cada anticorpo purificado misturando um miligrama por mililitro de anticorpo em um tampão de impressão de proteína 1X com 01% de volume por volume de Tween 20. Prepare 30 microlitros das seguintes soluções de impressão como controles. 1X tampão de impressão de proteína com 01% de volume por volume de Tween 20.

Cada proteína A purificada de soro pré-imune a um miligrama por mililitro em 1X tampão de impressão de proteína com 01% Tween 20 e um miligrama por mililitro de BSA e 1X tampão de impressão de proteína com 01% Tween 20. Adicione 30 microlitros por poço das soluções de impressão preparadas às microplacas de 384 poços de alta qualidade. Depois de configurar o robô de impressão e os substratos das lâminas de acordo com o protocolo de texto, localize todos os anticorpos e os controles nas lâminas em um padrão de ponto triplicado de aproximadamente 180 a 200 mícrons de diâmetro.

Para amostragem no ambiente, use uma seringa estéril para coletar de um a 100 mililitros de líquidos e concentre as células passando a amostra por um filtro de poros de três mícrons. Se necessário, colete amostras sólidas de rochas ou solos e mantenha-as em tubos estéreis. As amostras podem ser analisadas em um pequeno laboratório de campo.

Adicione um mililitro de tampão de incubação de extração para recuperar a biomassa coletada no filtro e use um espátula para raspar o filtro em um tubo de 15 mililitros. Com um processador ultrassônico portátil, ou pipetando para cima e para baixo várias vezes, isso agrega e homogeneiza a amostra. Além disso, pesar até 0,5 gramas da amostra sólida em um tubo separado de 10 mililitros e adicionar até dois mililitros de tampão de extração.

Mergulhe uma sonda sonicadora no tubo e sonice com um processador ultrassônico portátil ou outro dispositivo de ultrassom. Enquanto mantém a amostra no gelo, execute pelo menos cinco ciclos de 30 segundos a 30 kilohertz, parando por 30 segundos entre as sonicações. Para preparar um extrato filtrado para o imunoensaio, use uma seringa de 10 mililitros acoplada a um porta-filtro de náilon de cinco a 20 mícrons para filtrar a solução em um tubo de 1,5 mililitro para remover areia, argila e outros materiais grossos.

Com os pontos de microarray voltados para baixo, coloque a lâmina em uma gota de 100 a 200 microlitros de solução de bloqueio e incube por três a cinco minutos. Usando pinças com ponta de plástico e evitando as zonas de microarray, pegue cuidadosamente a lâmina. Mergulhe a lâmina em uma nova solução de bloqueio e incube a lâmina com agitação suave por 30 minutos.

Para secar a lâmina, coloque-a em uma centrífuga adaptada para lâminas de microscópio e gire-a brevemente. Configure a lâmina em um de hibridização de microarray de três por oito poços seguindo as instruções do provedor. Como alternativa, depois de modificar o padrão de impressão de anticorpos, configure um feito sob medida, como o mostrado aqui, ou simplesmente use slides de capa para a configuração.

Após a montagem da lâmina e do, pipete até 50 microlitros de cada extrato de amostra ou diluição em tampão de incubação de extração em cada poço do. Como alternativa, coloque amostras em outros dispositivos de incubação ou simplesmente use lâminas de cobertura. Como um controle em branco, pipete 50 microlitros de tampão TBSTRR em pelo menos dois poços separados do.

Incubar as amostras à temperatura ambiente durante uma hora e misturar pipetando de 15 em 15 minutos, ou incubar a quatro graus Celsius durante 12 horas. Para lavar os microarrays, coloque o no chão e bata-o cuidadosamente em papel absorvente limpo. Em seguida, lave os poços adicionando 150 microlitros de tampão de incubação de extração a cada um e remova o tampão batendo no papel absorvente como antes.

Repita a lavagem mais três vezes. Para cada poço, adicione 50 microlitros da mistura de anticorpos fluorescentes que contém os 17 anticorpos anti-cianobactérias. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante uma hora ou a quatro graus Celsius durante 12 horas.

Para lavar os microarrays, coloque cuidadosamente o no chão e bata suavemente no papel absorvente limpo. Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão de incubação de extração antes de removê-lo batendo em uma toalha de papel. Repita a lavagem três vezes.

Em seguida, desmonte o e mergulhe a lâmina em solução 0.1X PBS para um enxágue rápido. Centrifugue rapidamente como antes para secar a lâmina. Usando um scanner fluorescente, escaneie a lâmina quanto à fluorescência no pico máximo de emissão para corante fluorescente vermelho distante.

Tire várias imagens dos microarrays em diferentes parâmetros de varredura, alterando o valor de ganho. Por fim, carregue a grade, quantifique, processe e analise os dados de acordo com o protocolo de texto. O imunoensaio multiplex CYANOCHIP, demonstrado neste vídeo, foi usado para testar a identificação simultânea das espécies de cianobactérias de água doce mais relevantes, conforme listado nesta tabela.

Amostras de água coletadas na margem de um reservatório de água doce foram analisadas por meio do ensaio de microarray. As principais reações imunológicas positivas corresponderam a anticorpos para as espécies planctônicas de cianobactérias microcystis e para as espécies de leptolyngbya bentônica. Sinais fluorescentes mais baixos foram obtidos para as espécies planctônicas nostocales aphanizomenon, anabaena, microcystis flos-aquae e as espécies de rivularia bentônica.

O microarranjo também foi validado pelo ensaio de um tapete microbiano seco antártico para testar a presença de marcadores de cianobactérias. Reações positivas nos anticorpos foram produzidas para as cianobactérias bentônicas, espécies de anabaena e espécies de leptolyngbya. Reações imunológicas positivas adicionais foram detectadas com anticorpos para cianobactérias planctônicas, como espécies de microcystis, espécies de aphanizomenon e espécies de plancttothrix rubescens.

Por último, esses sinais foram obtidos a partir de anticorpos contra outras espécies bentónicas, incluindo as espécies de tolypothrix e as espécies de anabaena. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três, quatro horas, se for realizada corretamente, excluindo a produção de anticorpos e o nivelamento. Por incubação simultânea de amostra e anticorpos fluorescentes, pode economizar uma hora.

Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar de preparar a mistura de anticorpos fluorescentes com seu anticorpo em sua diluição de trabalho ideal. Após esses procedimentos, outros métodos, como microscopia óptica ou extração de DNA e uma amplificação de PCR específica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a concentração do solo ou para confirmar o tipo de cepa detectada. Após o seu desenvolvimento, esta técnica abrirá caminho para que pesquisadores da área de monitoramento ambiental explorem corpos d'água, em processos de bicultura, manejo de água doce ou estudos de ecologia microbiana, independentemente do tipo de amostra.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como rotular anticorpos com fluorescência, manipular microarrays de anticorpos, realizar imunoensaio multiplex e analisar e interpretar os resultados do imunoensaio de microarray. Não se esqueça de que trabalhar com ultrassons pode ser perigoso e precauções como o uso de dispositivos de proteção auricular ou outras medidas de cuidado específicas devem sempre ser tomadas durante a realização desses procedimentos.