Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Olá a todos, sou Kai Wang, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Pequim, no laboratório do Dr. Lowe. Atualmente, os indivíduos com diabetes tipo um são tratados principalmente com injeções de insulina que não simulam perfeitamente a secreção de insulina das ilhotas. Substituir as ilhotas perdidas pelo transporte de ilhotas pode mostrar um controle estável da glicose no sangue sem flutuações severas.

No entanto, a exigência de produzir um grande número de ilhotas de alta qualidade e a baixa eficiência do enxerto comprometeram o uso clínico generalizado. Hoje, vou mostrar a vocês o processo de isolamento das ilhotas e o transplante de ilhotas suportadas por andaimes para a almofada de gordura do epidídimo de camundongos diabéticos. Essas etapas exigem um bom conhecimento das estruturas dos tecidos e mãos habilidosas para realizar a cirurgia.

Pulverize todo o corpo com etanol. Faça uma incisão em V a partir da área genital. Remova o intestino pelo lado direito do mouse.

Clampeie a veia porta e o ducto biliar com clamp hemostático. Segure o duodeno cuidadosamente com uma pinça e puxe o duodeno até que o ducto biliar seja ensinado. Insira a agulha intravenosa no ducto colédoco através da ampola.

Clamp o segmento do ducto que contém a agulha usando um clamp ultra-hemostático. Dispense a solução de colágeno a uma taxa lenta e constante. Após a inflação completa do pâncreas, empurre o intestino pelo lado esquerdo do mouse.

Você pode ver que o ducto pancreático está totalmente inflado. Remova o pâncreas começando no final do cólon descendente. Use a pinça para levantar o intestino e separá-lo do pâncreas com outra pinça.

Continue a remover o pâncreas até que ele se solte da parte superior do estômago. Finalmente, retire o pâncreas do abdômen e corte-o do baço restante. Coloque um pâncreas no tubo cônico e aplique gelo.

Incube o pâncreas perfundido. Termine a digestão adicionando soluções de neutralização. Dissocie as duas sopas agitando os tubos vigorosamente.

Filtre as amostras de tecido digestivo através da tela de arame. Recolher as suspensões dos ilhéus num novo tubo cónico. Centrifugue os tubos.

Despeje o sobrenadante com cuidado, sem perturbar as paletas de tecidos. Ressuspenda as paletas com Histopaque pipetando a suspensão para cima e para baixo algumas vezes. Pipete lentamente o HBSS pela lateral do tubo até o topo das soluções Histopaque.

As duas soluções devem ser camadas bem separadas com uma interface nítida. Centrifugue a suspensão durante 20 minutos. A maioria das ilhotas migra para a interface das camadas Histopaque e HBSS.

Remova todas as soluções sobrenadantes e passe as soluções por um filtro invertido. As ilhotas serão retidas pelo filtro. Mergulhe a superfície que retém as ilhotas na solução e agite suavemente para liberar as ilhotas.

Escolha manualmente as ilhotas isoladas ao microscópio. Colete ilhotas em um novo prato de cultura. Se o tecido ao redor do ducto começar a inflar, significa que a agulha passa pela parede do ducto biliar.

É necessário reposicionar a agulha e tentar canular o ducto biliar novamente. À medida que as soluções preenchem o pâncreas, o tecido próximo ao duodeno infla primeiro, seguido pela região próxima à cauda pancreática. Se o duodeno começar a inflar como mostrado aqui com mancha azul, ajuste a pinça da artéria e recoloque o ducto biliar.

Coloque o mouse em decúbito dorsal. Depile o abdômen. Em seguida, esfregue com iodóforos para esterilizar a pele.

Cubra o mouse com uma cortina estéril. Faça uma pequena incisão através da parede peritoneal no meio, perto da área genital. Agarre e puxe suavemente a almofada de gordura do epidídimo da cavidade abdominal.

Espalhe a almofada de gordura em uma gaze molhada. Coloque um andaime contendo ilhotas na almofada de gordura e dobre a almofada de gordura para envolver o transplante. Suturar a almofada de gordura para prender as ilhotas encapsuladas na almofada de gordura.

Coloque suavemente a almofada de gordura de volta na cavidade abdominal. Feche o mouse suturando a parede peritoneal. Prenda a camada dérmica com clipes de ferida.

Injete doses apropriadas de analgésicos e antibióticos por via subcutânea. As ilhotas isoladas frescas normalmente tinham uma periferia áspera sob microscópio óptico. Depois que as ilhotas se recuperaram do processo de isolamento, elas pareciam brilhantes, firmes e adquiriram uma superfície lisa.

O diâmetro médio calculado das ilhotas foi de cerca de 130 micrômetros. Os andaimes desacelerados são mecanicamente robustos o suficiente para serem manuseados por pinças. As ilhotas porosas suportadas por andaimes foram então transferidas para a superfície da almofada de gordura espalhada e, em seguida, encapsuladas pela almofada de gordura.

Em um modelo de transplante singênico, normalmente 500 ilhotas revertem a hipoglicemia em 10 dias. A glicemia normal foi mantida antes de cerca de 100 dias até a retirada dos enxertos. Os estudos histológicos mostram que as ilhotas foram revascularizadas e circundadas pelo tecido adiposo e pelo andaime.

Depois de assistir a este vídeo, com prática, você deve aprender as principais etapas envolvidas no isolamento e transporte da ilhota. Em primeiro lugar, a canulação do ducto colédoco e a dilatação do pâncreas é a parte mais difícil deste protocolo. Em segundo lugar, encapsule completamente o andaime carregado de ilhotas com uma almofada de gordura, pois o encapsulamento incompleto pode levar ao fracasso do transplante.