Name: Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprenda o isolamento de ilhotas pancreáticas murinas e o transplante em andaimes descelularizados na almofada de gordura epidídmica de camundongos diabéticos. Este método demonstra a reversão da hiperglicemia e melhora da enxertia.

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Os autores agradecem a Wei Zhang da Guanhao Biotech por fornecer os andaimes decelularizados. Agradecemos a Xiao-hong Peng pelas discussões úteis. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Projeto No.31322021).

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pequim (IACUC, IACUC nº COE-LuoY-1). 1. Isau Isolamento <ol><li> Preparação de reagentes e equipamentos. <ol><li> Reconstitua o pó de colagenase P (2 U / mg) no HBSS para fazer uma solução de 5 mg / mL e filtre-o através de um filtro de 0,22 μm para remover as bactérias. Preparar soluções alíquotas de 0,6 ml de colagenase P em tubos cônicos de 15 mL e armazenar a -20 ° C. NOTA: Durante o uso, cada alíquota é diluída com HBSS para dar soluções de trabalho de 6 mL com concentrações finais de 0,5 mg / mL, ou 1 U / mL (o suficiente para tratar 3 camundongos). A solução de trabalho é mantida em gelo para uso imediato dentro de 1 h. A solução de trabalho não deve ser restaurada ou re-congelada para uso adicional. </li><li> Prepare a solução de neutralização adicionando FBS (2,5%) e P / S (1%) no HBSS; Mantenha a solução no gelo. Prepare 60 mL de solução de neutralização para treaT 6 camundongos. </li><li> Para o meio de cultura de ilhotas, adicione D-glucose (7 mM), FBS (10%) e P / S (1%) ao meio RPMI 1640. </li><li> Autoclave os instrumentos cirúrgicos a 115 ° C durante 30 min e 15 psi de pressão. </li></ol></li><li> Inflação do pâncreas. <ol><li> Prepare 12 mL de solução de trabalho com colagenase, conforme especificado no passo 1.1.1, para 6 camundongos (12 semanas de idade). Encha a seringa de 10 mL com 9 mL de solução de trabalho e conecte a seringa à agulha intravenosa de 27 G. Armazene a seringa no gelo e use a solução dentro de 1 h. </li><li> Eutanizar o mouse pela luxação cervical. Coloque o mouse na posição supina sobre uma toalha de papel, com a cauda apontada para o operador. Pulverize todo o corpo com 70% de etanol, tornando-o completamente molhado. </li><li> Faça uma incisão em V, a partir da área genital e se estendendo até o diafragma, usando tesoura de dissecação e fórceps. Dobre a pele no peito para revelar completamente a cavidade abdominal. </li><li> MoverO intestino do lado direito do mouse e expõe o pâncreas e o ducto biliar comum. Pegue cuidadosamente o duodeno com fórceps e puxe-o até o ducto biliar ficar tenso ( Figura 1A- 1 e A-2 ). </li><li> Encontre a veia porta e o ducto biliar que conduzem ao fígado. Aperte a veia porta e o ducto biliar com um grampo hemostático microscópico. NOTA: O aperto evita o sangramento excessivo e a entrada da colagenase no fígado. </li><li> Enquanto ainda segura o intestino com a pinça, encontre a localização da ampola que conecta o ducto biliar e o duodeno. Insira a agulha intravenosa 27G no ducto biliar comum através da ampola ( Figura 1B -1 e B-2 ). </li><li> Dispense cerca de 200 μL de solução de trabalho de colagenase para verificar se a canulação está completamente através do ducto biliar. Se a solução de colagenase começar a encher o duto ( 1 e C2 ), a agulha está no lúmen do duto; Prender o segmento de duto contendo a agulha usando uma braçadeira hemostática e distribuir o restante dos 2 mL de solução a uma velocidade lenta e constante em 1 min ( Figura 2A -1 , A-2 e B-1 ). NOTA: Se o tecido que envolve o ducto começa a inflar ( Figura 2B -2 ), a agulha penetrou através da parede do ducto biliar, tornando necessário reposicionar a agulha e tentar canular novamente o ducto biliar. Da mesma forma, se o duodeno começar a inflar ( Figura 2C- 1 e C-2 ), o grampo hemostático da artéria precisa ser ajustado e o ducto biliar re-canulado. À medida que a solução de colagenase enche o pâncreas, o tecido perto do duodeno infla primeiro, seguido pelo regioPerto da cauda pancreática. A perfusão da cauda pancreática (o lobo esplênico) é importante para maximizar o rendimento das ilhotas. </li><li> Após a inflação completa do pâncreas ( Figura 2C -1 ), empurre o intestino para o lado esquerdo do mouse e remova o pâncreas começando no cólon descendente. Use a pinça para levantar o intestino e separá-lo do pâncreas com outro par de fórceps. Continue a remover o pâncreas até que esteja desapegado do topo do estômago. Finalmente, retire o pâncreas do abdômen e baixe-o do bazo remanescente. NOTA: A separação completa deve ser realizada rapidamente, à medida que a digestão continua durante o processo de remoção. </li><li> Coloque o pâncreas em um tubo cônico vazio de 15 mL e deixe-o sobre gelo. Repita o procedimento acima para os ratos restantes. Todo o pâncreas deve ser processado posteriormente dentro de 1 h imediatamente após o passo 1.3 para evitar a sobre-digestão por colagenase P. &lt;/ Li&gt; </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig1.jpg"> Figura 1: Fotografias que mostram a canulação do ducto biliar e a perfusão do pâncreas com soluções de colagenase. ( A1 ) Puxar o duodeno até o ducto biliar ficar tenso. (Ampulla: a área triangular e leitosa na superfície do duodeno, o ducto biliar: a estrutura leitosa na estrutura da leite). ( B1 ) Inserindo a agulha no canal biliar da ampola. ( C1 ) Inflando o pâncreas com a injeção de enzima. ( A2, B2 e C2 ) Imagens de desenhos animados dos procedimentos mostrados em A1, B1 e C1, respectivamente. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2: Solução de problemas para a canulação. ( A1 ) A ponta da agulha inserida no lúmen da via biliar. ( A2 ) O duto cheio com soluções enzimáticas. ( B1 ) A agulha inserida no lúmen do ducto biliar e o duto cheio com um tinte azul. ( B2 ) Devido a canulação inadequada, a agulha está abaixo do ducto biliar, e apenas uma cápsula inflada é observada após a distribuição do corante azul. ( C1 ) Uma canulação bem sucedida é evidenciada pela distensão do pâncreas. ( C2 ) Devido ao aperto impróprio, o corante azul entra no duodeno e causa distensão. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="3"><li> &lt;Forte&gt; Digestão e purificação de ilhotas. <ol><li> Incubar os tubos cônicos contendo o pâncreas perfusado a 37 ° C durante 17 min. NOTA: O tempo de incubação pode variar com a idade e as espécies do animal. </li><li> Termine a digestão adicionando 7 mL de solução de neutralização e colocando os tubos no gelo. </li><li> Dissocie o tecido agitando vigorosamente os tubos ( por exemplo, 20 vezes em 10 s) até obter partículas finas de tecido. NOTA: O rendimento das ilhotas será baixo se o pâncreas falhar em dissociar completamente. </li><li> Filtre as amostras de tecido digeridas através de uma malha de arame de 0,5 mm para remover quaisquer pedaços de tecido não digeridos. Recolher as suspensões de ilhéus em um novo tubo cônico de 50 mL. </li><li> Centrifugue os tubos por 3 min a 230 xg e 4 ° C e despeje cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar as bolinhas de tecido. </li><li> Ressuspender os grânulos de 3 camundongos em 4 mL de gradiente de densidade de polissucrose agitando vortexamente ou pEvitando a suspensão para cima e para baixo algumas vezes. Puxe lentamente 4 mL de HBSS para baixo do lado do tubo até o topo das soluções de polissucrose. NOTA: as duas soluções devem ser camadas bem separadas com uma interface afiada. NOTA: A adição de HBSS deve ser realizada com cuidado, sem perturbar o gradiente de densidade de polissucrose na parte inferior. </li><li> Centrifugue a suspensão por 20 min a 900 xg e 4 ° C selecionando uma taxa de aceleração muito lenta. Termine a centrifugação sem freio. NOTA: Este é um passo para purificar as ilhotas das células exócrinas, com a maioria das ilhotas migrando para a interface entre as camadas de polissonfa e HBSS e a maioria das células exócrinas se estabelecendo na parte inferior. </li><li> Remova a totalidade das soluções de sobrenadante de 8 mL usando uma pipeta de 15 mL de grande diâmetro. Passe as soluções através de um filtro inverso de 70 μm. NOTA: As ilhotas serão mais purificadas e retidas pelo filtro, enquanto as células exócrinasPassará pelo filtro. Cuidado: o gradiente de densidade do polysucorse é tóxico para células; A filtração ajudará as ilhotas a se livrar da polissonfa. </li><li> Pipetar 2 mL de solução de neutralização a frio em uma placa de Petri de 35 mm. Inverta o filtro da célula para o lado direito, mergulhe a superfície mantendo as ilhotas na solução e agite suavemente para liberar as ilhotas. </li><li> Escolha manualmente as ilhotas ao microscópio usando uma pipeta de 20 μL com uma ponta branca. NOTA: As ilhotas são agregados de células amareladas e compactas ( Figura 3A ), enquanto o tecido ou células exocrinas contaminantes possuem uma estrutura negruzca e solta sob o microscópio de dissecação. </li><li> Coloque cerca de 200 ilhéus em uma placa de 35 mm com 2 mL de meio de cultura e incuba a 37 ° C numa incubadora fornecida com 5% de CO 2 durante 12 h. NOTA: Normalmente, 150-300 islets podem ser colhidos a partir de um mouse C57BL / 6J de 12 semanas de idade. As ilhotas são propensas a formar agregados durante a cultura,E os grandes ilhéus (&gt; 300 μm) são suscetíveis à necrose central ( Figura 1B , inserção). Agite bem a suspensão para distribuir uniformemente as ilhotas no prato e para reduzir o aglomerado. </li></ol></li></ol> 2. Cultura do Islão no Andaime NOTA: DCS tem uma porosidade de cerca de 79%, uma espessura de cerca de 0,6 mm e um tamanho de poro variando de 12 a 300 μm. <ol><li> Corte os andaimes em discos de 7 mm, mergulhe-os em etanol a 70% e lave-os com HBSS. Coloque os andaimes nas inserções de cultura de tecidos de 24 poços. NOTA: Quando as ilhotas frescas são recuperadas após a cultura durante a noite, as ilhotas aparecem brilhantes e apertadas, com bordas lisas ( Figura 3B ). </li><li> Remova o prato e colete as ilhotas do centro do prato usando uma pipeta de 20 μL com uma ponta branca. Transfira as ilhotas para os andaimes (250 islotes / andaime) usando uma pipeta e adicione 2 mL de meio de cultura parao poço. Cultive as ilhotas por 12 h antes do transplante. </li></ol> 3. Transplante de ilhotas no site EFP <ol><li> Indução de diabetes em camundongos receptores. <ol><li> Coloque ratos C57BL / 6J (com mais de 10 semanas de idade) em uma gaiola fresca com um suprimento de água, mas sem alimentos. Rápido os ratos por 10 h antes da indução de diabetes. </li><li> Prepare soluções tampão com valores de pH de 4,2-4,5 misturando ácido cítrico 0,1 M com citrato de sódio 0,1 M. Dissolver STZ (10 mg / mL) no tampão recém-preparado e esterilizar a solução passando através de um filtro de 0,22 μm. NOTA: STZ é sensível à luz e perde atividade dentro de 10 min; Sempre prepare a solução STZ fresca antes da injeção. </li><li> Injecte cada rato por via intraperitoneal com STZ numa dose de 140-150 mg / kg para cada rato C57BL / 6J. NOTA: A dose varia dependendo da idade e das espécies do animal. Recomenda-se a realização de um otimização da dose em pequena escalaSt para as espécies especificadas antes de iniciar o experimento formal. </li><li> Recolher o sangue da veia da cauda e monitorar a glicemia com um medidor de glicose nos dias 2, 3 e 4 pós-STZ. NOTA: Quando os animais são hiperglicêmicos (glicemia não jejum&gt; 16,7 mM) em dois dias consecutivos, eles estão prontos para o transplante de ilhotas. </li></ol></li><li> Transplante de ilhotas para o site EFP. <ol><li> Anestesiar os ratos com pentobarbital administrado intraperitonealmente (50 mg / kg). Coloque o mouse na posição supina sobre uma toalha de papel, com a cauda apontada para o operador. Raspe o abdômen extensivamente para remover a pele de todo o local da incisão. Tape os quatro membros e esfregue a pele completamente com álcool alternativo e toalhetes iodóforos movidos de forma circular para esterilizar o local da incisão. Drapele o mouse com uma cobertura esterilizada, permitindo apenas o acesso à área de incisão. Faça uma incisão de 7 mm através da parede peritoneal noLinha média, perto da área genital. NOTA: Todos os instrumentos utilizados durante a cirurgia, incluindo luvas, devem ser estéreis. </li><li> Pegue delicadamente e remova o EFP da cavidade abdominal usando fórceps. Espalhe o EFP na gaze estéril molhada. Coloque o andaime contendo ilhéus no EFP e dobre o EFP para enrolar o transplante. Proteja o contato direto entre as ilhotas e EFP suturando o EFP com suturas absorventes de 6-0. Molhe a superfície do EFP com solução salina estéril usando um cotonete embebido para evitar que o EFP seque. </li><li> Coloque suavemente o EFP na cavidade abdominal. Feche a incisão suturando a parede peritoneal e apertando a camada dérmica com os clipes de ferida. </li><li> Injetar buprenorfina (0,1 mg / kg) subcutaneamente como analgésico. </li><li> Injecte 1 mL de solução salina subcutânea para prevenir a desidratação. </li><li> Coloque o mouse em uma gaiola em uma almofada de aquecimento até que o mouse se recupere da anestesia. </li><li> Verifique o leito de glicose não em jejumDois dias depois, coletando sangue da veia da cauda. Se recuperando o enxerto, repita os procedimentos de transplante acima, retire suavemente o EFP, use a sutura 3-0 para ligar o fim da almofada de gordura adjacente ao epidídimo, obstrua os vasos sanguíneos, explante o enxerto EFP e conserve-o para a histologia . NOTA: A explicação das ilhéus deve tornar os ratos receptores hiperglicêmicos novamente dentro de 3 dias, confirmando a função do enxerto. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A perfusão e o tempo de digestão do pâncreas são dois parâmetros fundamentais que afetam o rendimento e a qualidade das ilhotas. Moskalewski relatou pela primeira vez o uso de uma mistura de colagenase em bruto para digerir pâncreas de cobaias picadas 11 . Lacy et al. Relatou a injeção de enzimas no sistema de duto para perfundir o pâncreas, o que aumentou muito o rendimento de ilhotas 12 . A perfusão ductal da enzima permite a exposição má...

O diabetes mellitus tipo 1 (T1D) é uma doença endócrina autoimune em que as células de ilhotas são abladas pelo sistema imunológico, tornando os pacientes dependentes da injeção de insulina exógena durante toda a vida. O protocolo de Edmonton representa um marco nos estudos clínicos do transplante de ilhotas; As ilhotas foram infundidas através da veia porta e transplantadas no local intra-hepático 1 . No entanto, dois principais obstáculos - fontes inadequadas de ilhotas de doadores e enxertos de ilhotas pobres - evitam o grande sucesso do transplante de ilhotas 2 . Normalmente, as ilhotas precisam ser coletadas de três doadores cadavéricos para reverter a condição hiperglicêmica de um paciente; Isto é devido ao baixo rendimento dos procedimentos de isolamento de ilhotas e à perda de ilhota após o transplante. Em particular, embora as ilhotas pós-transplante fossem banhadas em sangue rico em oxigênio, o contato direto com o sangue geralmente evocava a inflamação instantânea mediada pelo sangueTory reaction (IBMIR), o que poderia causar a perda aguda das ilhotas. A longo prazo, pensa-se que a perda gradual de ilhotas em pacientes representou a queda das taxas de reversão do diabetes nos grupos clínicos, que poderiam atingir 90% no primeiro ano e diminuíram para 30% e 10% em 2 e 5 Anos pós-transplante, respectivamente 3 . O transplante de ilhotas em locais extra-hepáticos tem sido uma estratégia atractiva para reduzir o contato direto de ilhotas com sangue enquanto confinam os transplantes para locais mais definíveis em comparação com a infusão intra-hepática. Estudos foram realizados nas cápsulas de rim, olho, músculo, gordura e espaços subcutâneos nos últimos anos, mostrando que os islotes nesses locais são capazes de sobreviver e funcionar para restaurar normoglicemia 4 . Além disso, as ilhéus desses sites são recuperáveis, possibilitando biópsia ou mesmo para outros procedimentos de substituição. Sonda extrahepáticaPor isso, demonstra grande potencial de transplante clínico 5 . Os andaimes baseados em biomateriais têm sido intensamente investigados para transplante de células e engenharia de tecidos. Os andaimes tridimensionais (3D) geralmente contêm estruturas porosas e podem servir como modelos celulares para gerar estrutura espacial / organização de células ou como reservatórios para fornecer a liberação controlada de pistas bioativas. Os andaimes também foram fabricados a partir de materiais poliméricos, tais como poli (glicolido-L-lactido) 6 , poli (dimetilsiloxano) 7 e poli (uretano) termoplástico 8 , para transplantar ilhotas no EFP. Em comparação com o transplante direto de ilhotas, verificou-se que o uso de andaimes reduziu a perda de ilhotas evitando o vazamento de ilhotas na cavidade intraperitoneal 9 , 10 , proporcionando proteção e modificação mecânicaProvocando a reação inflamatória local. Os andaimes assim podem ser desenvolvidos para promover o enxerto de ilhotas nos locais de transplante 7 . Neste estudo, pretendemos demonstrar um paradigma de transplante de ilhotas no EFP, realizado em modelos de camundongos usando um DCS. Os andaimes derivados de matrizes extracelulares atraíram um grande interesse nos últimos anos devido à biocompatibilidade superior e estruturas porosas mais naturais em comparação com os produtos sintéticos. Aqui, descrevemos um protocolo de isolamento robusto para obter ilhotas pancreáticas com altos rendimentos de ratos C57BL / 6J. Os DCS processados ​​a partir do pericárdio bovino foram então semeados com ilhotas e os enxertos foram transplantados para o EFP em modelos diabéticos singenéticos. A normoglicemia em camundongos foi alcançada dentro de 10 dias e foi mantida por até 100 dias, até a remoção dos enxertos.

<table><tbody><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm de diâmetro malha de arame</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de células m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Grampo hemostático de artéria</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grampo hemostático microscópico</td> Pinça hemostática <td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr> Suturas PGLA Absorvíveis 6-0 da <tr><td></td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>JINHUAN</td><td></td><td>Com clipe de ferida de agulha</td></tr><tr><td></td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonete</td><td>Gaze Médica</td><td></td><td></td>Ningbo</tr><tr><td>Cortinas Estéreis</td><td></td> Médicas Ningbo Seringa Médica <td></td><td></td></tr><tr><td>de 10mL</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha intravenosa 27G</td><td>JINGHUAN</td><td>0.45x15 RWSB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tubo</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL tubo cônico</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50mL tubo cônico</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>35mm Não tratado&nbsp; Peri-pratos</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filter</td><td>Pall</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>10 mL pipeta sorológica</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Enchimento de pipeta S1</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (2-20&mu; L)</td> <td>Axygen</td><td>AP-20</td><td>AXYPETTM</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solução salina balanceada&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C14175500CP</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase P</td><td>Roche</td><td>COLLP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11879-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Gibco</td><td>A24940-01</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de glicose</td><td>Roche</td><td></td><td>ACCU-CHEK</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Estreptozotocina</td><td>Sigma</td><td>V900890</td><td>VetecTM</td></tr><tr><td>Hidrato de cloral</td><td>J& K</td><td>C0073</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Iodóforos</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J, 10-12 semanas de idade</td><td>VitalRiver</td><td></td><td>Pequim, China</td></tr><tr><td>Andaime descelularizado</td><td>Guanhao Biotec</td><td>131102</td><td>Guangzhou, China</td></tr></tbody></table>

transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

O transplante de ilhotas foi clinicamente comprovado para ser eficaz no tratamento da diabetes tipo 1. No entanto, a atual estratégia de transplante intra-hepático pode sofrer reações agudas de sangue total e resultar em enxerto de isleta pobre. Aqui, relatamos um protocolo robusto para o transplante de ilhotas no local de transplante extra-hepático - a almofada de gordura epidídima (EFP) - em um modelo de mouse diabético. É descrito um protocolo para isolar e purificar ilhotas com rendimentos elevados de ratinhos C57BL / 6J, bem como um método de transplante realizado pela criação de ilhéus em um andaime decelularizado (DCS) e implantá-los no local de EFP em camundongos C57BL / 6J singênicos rendidos diabéticos Por estreptozotocina. O enxerto DCS contendo 500 ilhotas reverteu a condição hiperglicêmica dentro de 10 dias, enquanto as ilhotas livres sem DCS exigiam pelo menos 30 dias. A normoglicemia foi mantida por até 3 meses até o enxerto foi explantado. Em conclusão, a DCS aumentou o enxerto de ilhotas em tO site extra-hepático do EFP, que poderia ser facilmente recuperado e poderia fornecer uma plataforma reprodutível e útil para investigar os materiais de andaime, bem como outros parâmetros de transplante necessários para um enxerto de ilhotas bem sucedido.

Nosso método de aperto, realizado usando grampo hemostático microscópico, é direto e economiza tempo em comparação com a técnica de ligadura de sutura. Levaram cerca de 4 h para isolar e purificar cerca de 1.200 ilhotas de 6 camundongos. As ilhotas recentemente isoladas tipicamente tinham uma periferia áspera sob um microscópio óptico ( Figura 3A ). Uma vez que as ilhotas se recuperaram do processo de isolamento, elas pareciam brilhantes e apertadas e adquir...

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Olá a todos, sou Kai Wang, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Pequim, no laboratório do Dr. Lowe. Atualmente, os indivíduos com diabetes tipo um são tratados principalmente com injeções de insulina que não simulam perfeitamente a secreção de insulina das ilhotas. Substituir as ilhotas perdidas pelo transporte de ilhotas pode mostrar um controle estável da glicose no sangue sem flutuações severas.No entanto, a exigência de produzir um grande número de ilhotas de alta qualidade e a baixa eficiência do enxerto comprometeram o uso clínico generalizado. Hoje, vou mostrar a vocês o processo de isolamento das ilhotas e o transplante de ilhotas suportadas por andaimes para a almofada de gordura do epidídimo de camundongos diabéticos. Essas etapas exigem um bom conhecimento das estruturas dos tecidos e mãos habilidosas para realizar a cirurgia.Pulverize todo o corpo com etanol. Faça uma incisão em V a partir da área genital. Remova o intestino pelo lado direito do mouse.Clampeie a veia porta e o ducto biliar com clamp hemostático. Segure o duodeno cuidadosamente com uma pinça e puxe o duodeno até que o ducto biliar seja ensinado. Insira a agulha intravenosa no ducto colédoco através da ampola.Clamp o segmento do ducto que contém a agulha usando um clamp ultra-hemostático. Dispense a solução de colágeno a uma taxa lenta e constante. Após a inflação completa do pâncreas, empurre o intestino pelo lado esquerdo do mouse.Você pode ver que o ducto pancreático está totalmente inflado. Remova o pâncreas começando no final do cólon descendente. Use a pinça para levantar o intestino e separá-lo do pâncreas com outra pinça.Continue a remover o pâncreas até que ele se solte da parte superior do estômago. Finalmente, retire o pâncreas do abdômen e corte-o do baço restante. Coloque um pâncreas no tubo cônico e aplique gelo.Incube o pâncreas perfundido. Termine a digestão adicionando soluções de neutralização. Dissocie as duas sopas agitando os tubos vigorosamente.Filtre as amostras de tecido digestivo através da tela de arame. Recolher as suspensões dos ilhéus num novo tubo cónico. Centrifugue os tubos.Despeje o sobrenadante com cuidado, sem perturbar as paletas de tecidos. Ressuspenda as paletas com Histopaque pipetando a suspensão para cima e para baixo algumas vezes. Pipete lentamente o HBSS pela lateral do tubo até o topo das soluções Histopaque.As duas soluções devem ser camadas bem separadas com uma interface nítida. Centrifugue a suspensão durante 20 minutos. A maioria das ilhotas migra para a interface das camadas Histopaque e HBSS.Remova todas as soluções sobrenadantes e passe as soluções por um filtro invertido. As ilhotas serão retidas pelo filtro. Mergulhe a superfície que retém as ilhotas na solução e agite suavemente para liberar as ilhotas.Escolha manualmente as ilhotas isoladas ao microscópio. Colete ilhotas em um novo prato de cultura. Se o tecido ao redor do ducto começar a inflar, significa que a agulha passa pela parede do ducto biliar.É necessário reposicionar a agulha e tentar canular o ducto biliar novamente. À medida que as soluções preenchem o pâncreas, o tecido próximo ao duodeno infla primeiro, seguido pela região próxima à cauda pancreática. Se o duodeno começar a inflar como mostrado aqui com mancha azul, ajuste a pinça da artéria e recoloque o ducto biliar.Coloque o mouse em decúbito dorsal. Depile o abdômen. Em seguida, esfregue com iodóforos para esterilizar a pele.Cubra o mouse com uma cortina estéril. Faça uma pequena incisão através da parede peritoneal no meio, perto da área genital. Agarre e puxe suavemente a almofada de gordura do epidídimo da cavidade abdominal.Espalhe a almofada de gordura em uma gaze molhada. Coloque um andaime contendo ilhotas na almofada de gordura e dobre a almofada de gordura para envolver o transplante. Suturar a almofada de gordura para prender as ilhotas encapsuladas na almofada de gordura.Coloque suavemente a almofada de gordura de volta na cavidade abdominal. Feche o mouse suturando a parede peritoneal. Prenda a camada dérmica com clipes de ferida.Injete doses apropriadas de analgésicos e antibióticos por via subcutânea. As ilhotas isoladas frescas normalmente tinham uma periferia áspera sob microscópio óptico. Depois que as ilhotas se recuperaram do processo de isolamento, elas pareciam brilhantes, firmes e adquiriram uma superfície lisa.O diâmetro médio calculado das ilhotas foi de cerca de 130 micrômetros. Os andaimes desacelerados são mecanicamente robustos o suficiente para serem manuseados por pinças. As ilhotas porosas suportadas por andaimes foram então transferidas para a superfície da almofada de gordura espalhada e, em seguida, encapsuladas pela almofada de gordura.Em um modelo de transplante singênico, normalmente 500 ilhotas revertem a hipoglicemia em 10 dias. A glicemia normal foi mantida antes de cerca de 100 dias até a retirada dos enxertos. Os estudos histológicos mostram que as ilhotas foram revascularizadas e circundadas pelo tecido adiposo e pelo andaime.Depois de assistir a este vídeo, com prática, você deve aprender as principais etapas envolvidas no isolamento e transporte da ilhota. Em primeiro lugar, a canulação do ducto colédoco e a dilatação do pâncreas é a parte mais difícil deste protocolo. Em segundo lugar, encapsule completamente o andaime carregado de ilhotas com uma almofada de gordura, pois o encapsulamento incompleto pode levar ao fracasso do transplante.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de camundongos. Células estão concentradas em pelotas na tubulação final utilizada para o transplante de células sob a cápsula renal. A facilidade desta técnica reduz o estresse nas células e mouse.

Transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos

Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo de validação em vivo de terapia celular baseada em hidrogel, ilustrada pelo exemplo de transplante de ilhotas. h-Omental ilhéu de Matrix (localizador) implantação de enchimento permite a implantação de uma célula-hidrogel mistura entre as camadas omental, perto dos vasos sanguíneos, para maximizar a enxertia em um ambiente apropriado e metabólica.

Transplante de ilhotas intra-Omental usando h-Omental enchimento Matrix ilhéu (hOMING)

Neste protocolo, um método de isolamento e transplante de isto de murina no tecido adiposo branco subcutâneo inguinal é descrito. Ishotas singeneicas isoladas são transplantadas em um receptor de murina usando um hidrogel de membrana do porão. O nível de glicemia dos receptores é monitorado, e a análise de histologia dos enxertos de lumiçal é realizada.

Modelo de transplante de tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT) de Isletas murina

Este método de transplante de ilhotas cobertas de gordura é adequado para a detecção de ilhotas enxertadas na cavidade intraperitoneal. Notavelmente, não requer o uso de agentes bioligantes ou sutura.

Transplante de ilhotas cobertas de gordura usando tecido adiposo branco epididimal

Aqui apresentamos procedimentos cirúrgicos refinados na realização com sucesso do transplante de ilhotas intraportais, um procedimento cirúrgico clinicamente relevante, mas tecnicamente desafiador, em camundongos.

Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Accurate, quantificação baseada em causalidade da função diastólica global tem sido alcançado por meio de análise baseada na modelização cinemática do fluxo transmitral através do parametrizada enchimento diastólico formalismo (PDF). PDF gera rigidez, relaxamento e parâmetros de carga únicas e elucida 'novo' fisiologia, proporcionando índices sensíveis e específicos de disfunção.

Quantificação da função global diastólica por análise baseada em Modelagem cinemática de transmitral fluxo através do formalismo de enchimento parametrizada diastólica

Aprenda o isolamento de ilhotas pancreáticas murinas e o transplante em andaimes descelularizados na almofada de gordura epidídmica de camundongos diabéticos. Este método demonstra a reversão da hiperglicemia e melhora da enxertia.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

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